CN116121160A - 过表达pyrB基因的基因工程菌及其生产L-精氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种过表达pyrB基因的基因工程菌以及利用其生产L‑精氨酸的方法。更具体的，所述基因工程菌是对菌株E.coli W3110ARG10以过表达pyrB基因的方式进行了修饰，利用修饰后的基因工程菌发酵生产L‑精氨酸，显著提高了L‑精氨酸生产性能。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种过表达pyrB基因的基因工程菌以及利用其生产L-精氨酸的方法。
背景技术
L-精氨酸在医药、工业、食品、化妆品、畜牧业等领域有广泛的应用，有重要的经济和社会价值。
目前，L-精氨酸的生产方法主要有三种：微生物发酵法、化学合成法、蛋白水解法。其中，微生物发酵法具有生产原料来源广泛、生产工艺相对简单、对环境影响相对较小、产品纯度高等优势，现已成为L-精氨酸生产的主流方法。
选育具有L-精氨酸生产能力的高效菌株是微生物发酵法工业化应用的关键。目前选育L-精氨酸生产菌株的方法主要有两种：1)非理性的诱变筛选：该方法主要通过物理或化学方法对野生型底盘微生物进行诱变处理，结合L-精氨酸结构类似物抗性筛选方法，选育对L-精氨酸具有拮抗作用的诱变菌株。经过多轮诱变，最终筛选出具有L-精氨酸合成能力的优良生产菌株。例如，CN03112896.3采用钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYA5(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性)为亲株，按常规方法进行物理化学诱变处理，并经多重结构类似物抗性筛选，得到突变株SDNN403(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性)，在优化条件下培养生产L-精氨酸，产酸水平达到30-35g/L。2)理性代谢工程改造：该方法主要利用高效的基因编辑技术对底盘微生物中L-精氨酸合成网络进行***的代谢工程改造，以最大化重定向碳代谢流量至L-精氨酸合成途径，主要包括阻断L-精氨酸降解途径、解除由L-精氨酸合成引起的关键酶反馈抑制调控机制、加强合成途径代谢流量、优化底盘细胞辅酶供应平衡、修饰目标产物跨膜运输***等。例如，CN110964683A在大肠杆菌通过整合编码氨甲酰磷酸合成酶的基因和编码L-精氨酸生物合成途径酶的基因，对大肠杆菌中精氨酸合成途径和整个氨基酸代谢网络中与精氨酸相关的代谢流进行分析重构，得到遗传背景清晰，不携带质粒，不经诱变且能稳定高效生产L-精氨酸的基因工程菌。随着基因工程技术的飞速发展，理性的代谢工程改造构建高效L-精氨酸生产菌株的方法逐渐取代了诱变筛选育种方法，成为选育高效稳定L-精氨酸生产菌株的主流方法。
提高底盘微生物L-精氨酸生产性能是理性代谢工程育种持续性的目标。在对底盘微生物代谢网络进行***的重构过程中，靶基因表达强度的增强或减弱是提高L-精氨酸生产性能的常用策略。例如，对L-精氨酸降解的一个或几个基因、L-精氨酸合成竞争途径的一个或几个基因、参与碳氮流量再分配的基因进行减弱表达可以显著促进L-精氨酸的合成；另外，通过提高L-精氨酸合成途径关键酶表达、提高L-精氨酸外排膜蛋白的表达、提高L-精氨酸前体物合成途径的关键酶表达也对提高底盘微生物生产L-精氨酸具有显著的有益效果。
pyrB基因编码天冬氨酸氨甲酰转移酶，其催化氨甲酰磷酸和天冬氨酸结合生成氨甲基天冬氨酸和磷酸盐，该双向反应是嘧啶生物合成的第一步，对嘧啶和嘌呤合成途径代谢流量的平衡方面具有重要作用。然而，针对pyrB基因的修饰对L-精氨酸生产的影响尚未见报道。
发明内容
针对现有技术不足，本发明目的是提供一种通过进行了基因修饰的大肠杆菌生产L-精氨酸的方法。
为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：
第一方面，本发明提供了一种生产L-精氨酸的基因工程菌，具体的，其属于大肠杆菌，更具体的，所述大肠杆菌是对菌株E.coli W3110 ARG10以过表达pyrB基因的方式进行了修饰。
第二方面，本发明提供了利用如上所述的基因工程菌生产L-精氨酸的方法，包括：在培养基中培养所述基因工程菌以使其生产L-精氨酸；以及，从所述基因工程菌和/或所述培养基中收集所述L-精氨酸。
如上述第二方面本发明提供的方法，所述基因工程菌已经以过表达pyrB基因的方式进行了修饰，使其与未修饰的大肠杆菌相比所述pyrB基因的表达强度增强或表达水平提高。
本发明的有益效果如下：
pyrB基因编码天冬氨酸氨甲酰转移酶，该基因与L-精氨酸合成途径的关系及作用尚不清晰。本发明证实，以过表达pyrB基因的方式修饰的大肠杆菌生产L-精氨酸的水平显著提高。具体而言，以一株L-精氨酸工程菌株E.coli W3110 ARG10为出发菌株，以过表达pyrB基因的方式进行了修饰的基因工程菌株中L-精氨酸积累浓度从31.2g/L提升到36.5g/L，L-精氨酸产率提高了17％。
附图说明
图1：ygaY::Ptrc-pyrB基因编辑电泳图。其中：M：1kb DNAmarker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
第一方面，本发明提供了一种生产L-精氨酸的基因工程菌，具体的，其属于大肠杆菌，更具体的，所述大肠杆菌是对菌株E.coli W3110 ARG10以过表达pyrB基因的方式进行了修饰。
根据本发明第一方面，所述大肠杆菌是对菌株E.coli W3110 ARG10以过表达pyrB基因的方式进行了修饰，使其与未修饰的大肠杆菌相比所述pyrB基因的表达水平提高，或者pyrB基因表达产物如天冬氨酸氨甲酰转移酶的总酶活性提高，例如，提高了150％或更多，200％或更多，300％或更多。
根据本发明第一方面，所述菌株E.coli W3110 ARG10(详细描述于中国专利CN110964683B)是以大肠杆菌W3110为基础，含有来源于枯草芽孢杆菌B.subtilisA260的编码氨甲酰磷酸合成酶的基因pyrAA和pyrAB；含有以下的精氨酸生物合成途径酶：argC、argJ、argB、argD、argF、argG和argH，所述编码精氨酸生物合成途径酶的基因由Ptrc启动子启动；敲除了分解L-精氨酸的编码基因speA、adiA、astA和argE；含有来源于有效棒杆菌的编码精氨酸转运蛋白的基因lysE。
根据本发明第一方面，过表达pyrB基因的方式，可以通过在细菌基因组中引入和/或增加pyrB基因的拷贝数(例如，通过pET28a、pTrc99a、pSTV28等自主复制质粒增加pyrB基因的拷贝数，或者增加细菌染色体中pyrB基因的拷贝数)，或者修饰pyrB基因的表达调控序列(例如，启动子，核糖体结合位点等)，或者以上方法的组合。
根据本发明一种优选的实施方式，过表达pyrB基因的方式是将该基因连接了强启动子并整合在大肠杆菌基因组中，其中基因的整合位点可以根据本领域技术人员常规认知选择一些不会对细菌生长和基础代谢产生明显影响的假基因位点，例如yeeP、ygiP、yghX、ygaY、yjiT、ycjV、ycgH、ygaY、yeeL、ilvG等基因位点都是可以选择的；所述强启动子可以选择Ptrc、BBa-J23100、T7中任意一种。
根据本发明第一方面，所述pyrB基因不限于NCBI GeneID:948767所示的核苷酸序列，还可以包括作为NCBI GeneID:948767所示序列的突变体核苷酸序列或与NCBI GeneID:948767所示序列同源，且编码pyrB蛋白的突变体的基因。所述pyrB基因可以是由于遗传密码的简并性所致的变体核苷酸序列。
第二方面，本发明提供了利用如上所述的基因工程菌生产L-精氨酸的方法，包括：在培养基中培养所述基因工程菌以使其生产L-精氨酸；以及，从所述基因工程菌和/或所述培养基中收集所述L-精氨酸。
根据本发明第二方面，所述L-精氨酸不仅包括游离形式的L-精氨酸，还可以包括L-精氨酸的盐或水合物。
根据本发明第二方面，所述基因工程菌的培养可以采用本领域常规方法进行。用于生产L-精氨酸的培养基可以是合成的或天然的培养基，例如含有碳源、氮源、硫源、无机离子和需要的其它有机和无机组分的典型培养基。
所述基因工程菌可以在需氧条件下进行培养，持续16至72小时，或20至48小时，或26至30小时；培养温度可以控制在30至45℃，或30至37℃内；且pH可以调节在5.0至8.0之间，或6.0至7.5之间，或6.8至7.2之间。可以通过使用无机或有机酸性或碱性物质，以及氨气调节pH。
培养后，可以通过常规技术(例如离心，膜过滤)从液体培养基中除去固体，如细胞和细胞碎片，然后可以通过常规技术(例如浓缩，离子交换层析，结晶)的任意组合从发酵液回收L-精氨酸。
细菌在接种发酵前根据其保存状态还可以进行了菌种活化、种子扩培等，根据本领域常规技术选择合适条件和培养基进行即可，例如种子培养基可以采用与发酵培养基相同的组成，也可以在此基础上进行了适当调整。
其他所涉及的分子生物学、基因工程等具体操作手段根据本领域人员容易获得的技术手册、教科书或文献报道均可以实现，不必在此详细描述操作过程。此外，以下实施例中选用了具体的菌株作为宿主，因而根据宿主选择了具体的基因整合位点、目标基因及其引物等，但并不意味着本发明目的仅能通过这些具体的选择得以实现，不能以此限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。
实施例1：以过表达pyrB基因的方式修饰的基因工程菌株ARG-pyrB的构建
1基因编辑的方法
如未特别说明，本发明实施例中采用的基因编辑方法参照文献(Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR–Cas9meditated genome editing.Metabolic engineering,2015,31:13-21.)进行。其中pREDCas9携带gRNA表达质粒pGRB的消除***，λ噬菌体的Red重组***及Cas9蛋白表达***，奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，32℃培养；pGRB以pUC18为骨架，包括启动子J23100，gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列，氨苄青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，37℃培养。
该方法的具体步骤如下：
1.1pGRB质粒构建
构建质粒pGRB的目的是为了转录相应的gRNA，从而与Cas9蛋白形成的复合体，并通过碱基配对和PAM识别目的基因靶位点，实现目的DNA双链断裂。采用包含靶序列的DNA片段与线性化的载体片段重组的方法构建pGRB质粒。
1.1.1靶序列设计
使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列(PAM:5’-NGG-3’)
1.1.2包含靶序列的DNA片段的制备
设计引物：5’-线性化载体末端序列(15bp)-酶切位点-靶序列(不包括PAM序列)-线性化载体末端序列(15bp)-3’及其反向互补的引物，通过单链DNA的退火制备包含靶序列的DNA片段。反应条件：预变性95℃，5min；退火30-50℃，1min。退火体系如下表：
1.1.3线性载体的制备
载体的线性化采用反向PCR扩增的方法。
1.1.4重组反应
所用重组酶均为ClonExpress
II One Step Cloning Kit系列的酶，重组条件：37℃，30min。重组体系如下表：
1.1.5质粒的转化
取10μL反应液，加入到100mL DH5α化转感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴20min，42℃热激45-90s，立即冰浴2-3min，加入900μL SOC，于37℃复苏1h。8000rpm离心2min，弃部分上清，留200μL左右将菌体重悬后涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的平板，将平板倒置，于37℃过夜培养。待平板长出单菌落后通过菌落PCR鉴定，挑选阳性重组子。
1.1.6克隆鉴定
将PCR阳性菌落接种至含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养后保菌，提取质粒，酶切鉴定。
1.2重组DNA片段的制备
用于启动子替换的重组片段由pyrB基因的上下游同源臂组成(上游同源臂-下游同源臂)。利用引物设计软件primer5，以pyrB基因的上下游序列为模板，设计上下游同源臂引物(扩增长度约400-500bp)通过PCR的方法分别扩增上下游同源臂和目的基因片段后，再经过重叠PCR制备重组片段。PCR扩增体系如下表：
重叠PCR的体系如下表：
注：模板由上下游同源臂的扩增片段和目的基因等摩尔组成，且总量不超过10ng。
PCR反应条件(宝生物PrimeSTAR HS酶)：预变性(95℃)5min；然后进行30轮循环：变性(98℃)10s，退火((Tm-3/5)℃)15s，72℃延伸(此酶活力1min延伸约1kb)；72℃继续延伸10min；维持(4℃)。
1.3质粒和重组DNA片段的转化
1.3.1 pREDCas9的转化
利用电转的方法将pREDCas9质粒电转至出发菌株的电转感受态中，将菌体复苏培养后涂布于含奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。抗性平板上生长单菌落用鉴定引物进行菌落PCR,筛选阳性重组子。
1.3.2含pREDCas9的目的菌株电转化感受态制备
32℃培养至OD600＝0.1～0.2时，添加0.1M的IPTG(使其终浓度为0.1mM)，继续培养至OD600＝0.6～0.7时进行感受态制备。添加IPTG的目的是使pREDCas9质粒上的重组酶诱导表达。感受态制备所需培养基及制备过程参照常规标准操作。
1.3.3pGRB和重组DNA片段的转化
将pGRB和供体DNA片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态细胞中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。利用专门设计的鉴定引物，进行菌落PCR验证，筛选阳性重组子并保菌。
1.4质粒的消除
1.4.1 pGRB的消除
将阳性重组子置于含有0.2％***糖的LB培养基中过夜培养，适量稀释后涂布于含有奇霉素抗性的LB平板上，32℃过夜培养。对点含有氨苄青霉素和奇霉素抗性的LB平板，挑选氨苄青霉素平板不生长，奇霉素抗性平板生长的单菌落保菌。
1.4.2 pREDCas9质粒的消除
将阳性重组子转接到无抗性的LB液体培养基中，42℃过夜培养，适量稀释后涂布于无抗性的LB平板上，37℃过夜培养。对点含有奇霉素抗性和无抗性的LB平板，挑选奇霉素抗性平板不生长，无抗性平板生长的单菌落保菌。
2.菌株构建过程中使用的引物见下表：
3.ygaY::Ptrc-pyrB基因编辑构建菌株
以大肠杆菌基因组为模板，根据其ygaY基因(NCBI GeneID:2847696)的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-ygaY-S、UP-ygaY-A)和下游同源臂引物(DN-ygaY-S、DN-ygaY-A)；根据pyrB基因(NCBI GeneID:948767)上下游序列及Ptrc启动子序列设计扩增pyrB基因所需的引物pyrB-S和pyrB-A。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得ygaY::Ptrc-pyrB(上游同源臂-Ptrc-下游同源臂)。构建pGRB-ygaY：使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-ygaY-S和gRNA-ygaY-A的退火制得。制备E.coli W3110 ARG10的感受态细胞，按照上述1.3和1.4所示的方法操作，构建获得以过表达pyrB基因的方式修饰的基因工程菌株ARG-pyrB。ygaY::Ptrc-pyrB片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图1。其中，上游同源臂的长度应为616bp，Ptrc启动子长度为74bp，pyrB片段长度为660bp，下游同源臂的长度应为617bp，重叠片段的总长应为1967bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为1967bp，原菌PCR扩增片段长度应为1424bp。
实施例2：利用具有过表达pyrB基因的大肠杆菌ARG-pyrB生产L-精氨酸
大肠杆菌ARG-pyrB是在大肠杆菌ARG10基础上以过表达pyrB基因的方式进行了修饰。ARG10菌株(详细描述于中国专利CN110964683B)是以大肠杆菌W3110为基础，含有来源于枯草芽孢杆菌B.subtilisA260的编码氨甲酰磷酸合成酶的基因pyrAA和pyrAB；含有以下的精氨酸生物合成途径酶：argC、argJ、argB、argD、argF、argG和argH，所述编码精氨酸生物合成途径酶的基因由Ptrc启动子启动；敲除了分解L-精氨酸的编码基因speA、adiA、astA和argE；含有来源于有效棒杆菌的编码精氨酸转运蛋白的基因lysE。
采用相同的培养基和培养方法对大肠杆菌ARG-pyrB和对照大肠杆菌ARG10进行摇瓶培养发酵生产L-精氨酸。
培养基的组成：葡萄糖20g/L，酵母提取物3g/L，蛋白胨2g/L，K2HPO4 6g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO4·7H2O 20mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1mg/L其余为水，pH 7.0-7.2。
摇瓶培养方法：按种子培养液体积10％的接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行。
经摇瓶28h发酵培养后，各取1mL发酵液13000转/分钟高速去除菌体，获取发酵上清液。利用高效液相色谱检测发酵上清液中L-精氨酸浓度(如表1所示)。
表1 ARG-pyrB菌株摇瓶发酵结果
表1结果显示，过表达pyrB基因并未对工程菌株的生长造成明显的影响；同时，促使ARG-pyrB中L-精氨酸浓度从31.2g/L提升到36.5g/L，L-精氨酸产率提高了17％。以上实验结果表明，利用以过表达pyrB基因的方式进行了修饰的基因工程菌发酵生产L-精氨酸，显著提高了L-精氨酸生产性能，说明修饰后的菌株具有更强的L-精氨酸生产能力。
虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。
Claims (4)
1.一种生产L-精氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是对菌株E.coliW3110ARG10以过表达pyrB基因的方式进行了修饰。
2.如权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述菌株E.coli W3110 ARG10是以大肠杆菌W3110为基础，含有来源于枯草芽孢杆菌B.subtilisA260的编码氨甲酰磷酸合成酶的基因pyrAA和pyrAB；含有以下的精氨酸生物合成途径酶：argC、argJ、argB、argD、argF、argG和argH，所述编码精氨酸生物合成途径酶的基因由Ptrc启动子启动；敲除了分解L-精氨酸的编码基因speA、adiA、astA和argE；含有来源于有效棒杆菌的编码精氨酸转运蛋白的基因lysE。
3.如权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述pyrB基因整合在菌株E.coliW3110ARG10基因组的ygaY基因位点，并由Ptrc启动子启动。
4.利用权利要求1-3任一项所述基因工程菌生产L-精氨酸的方法，包括：在培养基中培养所述基因工程菌以使其生产L-精氨酸；以及，从所述基因工程菌和/或所述培养基中收集所述L-精氨酸。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117887652A (zh) * | 2024-03-14 | 2024-04-16 | 天津科技大学 | 一种乳清酸生产菌株及其定向改造方法与应用 |
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| CN102317436A (zh) * | 2008-07-23 | 2012-01-11 | Opx生物工艺学公司 | 用于增加微生物对3-羟基丙酸(3-hp)的耐受性以及增加3-羟基丙酸产量的方法、***和组合物 |
| CN110964683A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-04-07 | 天津科技大学 | 生产l-精氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 |
-
2022
- 2022-10-28 CN CN202211353781.3A patent/CN116121160A/zh active Pending
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| CN117887652B (zh) * | 2024-03-14 | 2024-06-11 | 天津科技大学 | 一种乳清酸生产菌株及其定向改造方法与应用 |
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