CN114134127B

CN114134127B - 用于合成依克多因的二氨基丁酸乙酰转移酶突变体

Info

Publication number: CN114134127B
Application number: CN202111401151.4A
Authority: CN
Inventors: 王金刚; 韦炎龙; 梁岩; 任亮
Original assignee: Shanghai Banglin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Banglin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-11-24
Filing date: 2021-11-24
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2041-11-24
Also published as: CN114134127A

Abstract

本发明公开了一种二氨基丁酸乙酰转移酶突变体SEQ ID NO:3，该二氨基丁酸乙酰转移酶突变体能够高效地催化L‑2,4‑二氨基丁酸反应生成N‑乙酰‑2,4‑二氨基丁酸，进一步在ectC酶催化下生成依克多因。

Description

用于合成依克多因的二氨基丁酸乙酰转移酶突变体

技术领域

本发明属于代谢工程领域，具体地说，涉及一种二氨基丁酸乙酰转移酶突变体、及其用于生产依克多因的用途。

背景技术

依克多因(Ectoin)，化学名为(S)-2-甲基-1,4,5,6-四氢嘧啶-4-羧酸，又名四氢甲基嘧啶羧酸，简称四氢嘧啶，分子式为C₆H₁₀O₂N₂，是一种氨基酸衍生物，其结构式如下。

依克多因最初从嗜盐耐盐微生物中发现，其能使细胞在高盐、高渗透压、干燥、高温、强紫外辐射等环境下免受伤害。进一步研究发现，依克多因能够增强细胞或生物大分子的稳定性，从而进行自我修护。研究表明，依克多因同样对皮肤有很好的修复保护作用，可作为化妆品添加剂起到保湿、抗皱等作用，还可用于医疗保健，比如用于治疗应激性皮炎、神经性皮炎、肺炎、过敏性鼻炎、湿疹等疾病，极具市场潜力。

目前，Ectoin主要是以嗜盐菌发酵来制备。1998年，Sauer等人(Biotechnologyand Bioengineering,1998,57(3):306-313)利用高盐(15％～20％NaCl)培养基培养伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)，发酵120h后，利用微滤浓缩收集菌体并转入低盐(3％NaCl)培养基中释放胞内的依克多因。随后再收集菌体并利用高盐培养基发酵合成依克多因，循环9次后，依克多因的产量达到7.4g/L。2008年，Nagata等人(Biotechnology andBioengineering,2008,99(4):941-948)发现Brevibacterium sp.JCM 6894不仅能够合成依克多因，而且具备在高盐和低盐反复冲击下不易破裂的特点，但依克多因的产量仅为2.4g/L。但是，高盐发酵对生物反应器设备要求较高，不但影响设备的寿命，后续的废液处理也有很大的难度，导致依克多因价格居高不下，限制了它的应用。

发明内容

为了能够利用传统的基因工程菌通过发酵法实现依克多因的大规模生产，降低依克多因的生产成本，发明人对于伸长盐单胞菌中的依克多因合成途径进行了研究，发现在依克多因的生物合成途径中，二氨基丁酸乙酰转移酶(EctA)、二氨基丁乙酸转氨酶(EctB)和四氢嘧啶合酶(EctC)(简写ECT)的酶活力影响显著。其中，EctB用于催化L-天冬氨酸-β-半醛反应生成L-2,4-二氨基丁酸，EctA用于催化L-2,4-二氨基丁酸反应生成N-乙酰-2,4-二氨基丁酸，EctC用于催化N-乙酰-2,4-二氨基丁酸反应生成依克多因。发明人通过突变提高了EctA的酶活力，从而大幅度提高了产依克多因的细菌的依克多因产量，改进了发酵法合成依克多因的经济性。因此，本发明包含如下技术方案：

一种二氨基丁酸乙酰转移酶突变体，其为伸长盐单胞菌CGMCC 1.6329(Halomonaselongata CGMCC 1.6329)来源的野生型二氨基丁酸乙酰转移酶的氨基酸序列SEQ ID NO:2中下述位点的三个以上、优选四个以上、直至五个发生突变后所形成的突变体：T4、P17、P53、N162、D177，该二氨基丁酸乙酰转移酶突变体可催化L-2,4-二氨基丁酸反应生成N-乙酰-2,4-二氨基丁酸。

上述的术语“突变”包括但不限于氨基酸的取代、缺失或添加。

优选地，上述突变选自下组：T4A、P17H、P53T、N162H、D177V。

在一种优选的实施方式中，上述二氨基丁酸乙酰转移酶突变体为SEQ ID NO:2的(T4A、P17H、P53T、N162H、D177V)突变体，相对于SEQ ID NO:2而言，发生了5个位点的氨基酸替换，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3：

MNAATEPFTPSADLAKHSVADAVVGHEASPLFIRKPSPDDGWGIYELVKSCPTLDVNSAYAYLLLATQFRDSCAVATNEEGEIVGFVSGYVKSNAPDTYFLWQVAVGEKARGTGLARRLVEAVMTRPEMAEVHHLETTITPDNQASWGLFRRLADRWQAPLHSREYFSTDQLGGEHVPENLVRIGPFQTDQI(SEQ ID NO:3)。

本发明第二个方面提供了一种编码上述二氨基丁酸乙酰转移酶突变体的基因。

优选地，编码二氨基丁酸乙酰转移酶突变体SEQ ID NO:3的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

本发明的第三个方面提供了一种用于表达依克多因生物合成途径中二氨基丁酸乙酰转移酶(EctA)、二氨基丁乙酸转氨酶(EctB)和四氢嘧啶合酶(EctC)的ectABC基因簇，其包含编码上述二氨基丁酸乙酰转移酶突变体例如SEQ ID NO:3的基因。

优选地，上述ectABC基因簇的核苷酸序列为SEQ ID NO:5。

本发明的第四个方面提供了一种包含上述ectABC基因簇的质粒。该质粒包含用于表达上述ectABC基因簇的载体骨架，优选载体是pTrc99A或者PET系列比如pET22b、pET24a、pET28a等，但并不受限于此。

本发明的第五个方面提供了一种用于表达上述ectABC基因簇的微生物。例如，该微生物的基因组中克隆了上述ectABC基因簇。

上述微生物宿主可以选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌W3110或者BL21(DE3)。

本发明的第六个方面提供了表达上述ectABC基因簇的微生物在生产依克多因中的用途。

具体地，通过微生物的发酵生产依克多因。

本发明通过3轮突变筛选出的二氨基丁酸乙酰转移酶突变体SEQ ID NO:3相较野生型二氨基丁酸乙酰转移酶SEQ ID NO:2的酶活力提高明显，使得其表达微生物合成依克多因的产量提高了近20倍，能够显著降低发酵法生产依克多因的成本，经济性显著提高。

附图说明

图1是实施例中HPLC检测发酵液中依克多因的保留时间的HPLC图。

具体实施方式

在微生物的依克多因代谢途径中，ectABC基因簇表达的酶系(ECT)的活力高低直接关系到依克多因的产量，而其中二氨基丁酸乙酰转移酶(EctA)是第一个关键酶，起到了一个承上启下的作用。发明人通过文献检索以及数据库检索分析，选定了伸长盐单胞菌CGMCC 1.6329来源的ectABC基因簇(SEQ ID NO:1)作为改进对象，并将野生型二氨基丁酸乙酰转移酶作为改造重点，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2：

MNATTEPFTPSADLAKPSVADAVVGHEASPLFIRKPSPDDGWGIYELVKSCPPLDVNSAYAYLLLATQFRDSCAVATNEEGEIVGFVSGYVKSNAPDTYFLWQVAVGEKARGTGLARRLVEAVMTRPEMAEVHHLETTITPDNQASWGLFRRLADRWQAPLNSREYFSTDQLGGEHDPENLVRIGPFQTDQI(SEQ ID NO:2)。

在本文中，术语“野生型”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指氨基酸序列为SEQ ID NO:2的二氨基丁酸乙酰转移酶。有时为了表述方便起见，在本文中可以将野生型二氨基丁酸乙酰转移酶SEQ ID NO:2与其突变体比如SEQ ID NO:3等统称为“二氨基丁酸乙酰转移酶”。

为了在基因工程中最常用的大肠杆菌中最佳地表达二氨基丁酸乙酰转移酶以及包含该二氨基丁酸乙酰转移酶的酶系ECT，可以对这些酶的表达基因进行了密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。例如，经密码子优化的ectABC基因簇可以是SEQ ID NO:5。

在本文中，为了描述简便，有时会将某种蛋白比如EctA与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。本领域技术人员根据语境和上下文容易理解它们的含义。例如，对于EctA，用于描述二氨基丁酸乙酰转移酶功能或类别时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该二氨基丁酸乙酰转移酶EctA的基因ectA。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

ME培养基：5g/L硫酸铵、1.5g/L磷酸二氢钾、5.1g/L磷酸氢二钠、0.5g/L柠檬酸铵、5g/L酵母提取物、2g/L碳酸钙、20g/L葡萄糖、1mL/L微量元素溶液。其中葡萄糖配制成200g/L葡萄糖母液，与发酵液其它成分分开灭菌。微量元素溶液包括17.2g/L FeCl₃·6H₂O、0.5g/L CaCl₂·2H₂O、0.2g/LZnSO₄·7H₂O、0.15g/L CuSO₄·5H₂O、0.15g/L MnSO₄·4H₂O、0.17g/LCoCl₂·6H₂O、20g/L EDTA，过滤除菌。

HPLC检测发酵液离心后上清液中依克多因的色谱条件：

AQ-C18色谱柱；流动相：90％5mM磷酸二氢钾、10％乙腈；检测波长：210nm。依克多因标准品的HPLC结果如图1所示。

需说明的是，为描述方便起见，在实施例中，有时可将菌株编号、质粒编号、酶编号、酶编码基因编号共用一个编号，这是本领域技术人员容易理解的，即同一个编号在不同环境中可以指代不同的生物形式。

实施例1：构建野生型ectABC基因簇表达菌株

以伸长盐单胞菌CGMCC 1.6329基因组(GenBank:FN869568.2)为模板，ABC-5、ABC-3为引物，PCR扩增约2.5kb的ectABC片段，并克隆到pTrc99A的EcoRI/HindIII位点，获得质粒pTrc99A-ectABC。引物序列如下所示：

ABC-5：5’-GGAATTCATGAACGCAACCACAGAGCC-3’，

ABC-3：5’-CCCAAGCTTTTACAGCGGCTTCTGGTCGT-3’。

质粒pTrc99A-ectABC经酶切、PCR鉴定和测序验证目的基因ectABC的***位置、大小和读码框均正确。

通过电转化将重组质粒pTrc99A-ectABC转入大肠杆菌W3110感受态细胞中，获得菌株ECT-1。扩增出的ectABC基因簇的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。其表达的酶系ECT中的二氨基丁酸乙酰转移酶(ectA)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例2：易错PCR法构建ectA随机突变体库

以质粒pTrc99A-ectABC为模板，利用易错PCR技术构建ectA随机突变体文库。

设计如下引物对ECTA-5/ECTA-3：

正向引物ECTA-5：5’-ATGAACGCAACCACAGAGCC-3’，

反向引物ECTA-3：5’-TCAGATCTGGTCGGTCTGGA-3’。

以质粒pTrc99A-ectABC为模板，进行PCR扩增，获得约0.6kb的转氨酶突变体DNA序列。

50μL易错PCR反应体系包括：10ng质粒模板，50pmol一对引物，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl₂，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl₂，2.5个单位的Taq酶(Takara)。

PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp，30个循环；72℃10min。

对PCR产物电泳、胶回收(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)。

以质粒pTrc99A-ectABC为模板，以约0.6kb的回收产物(随机突变片段)作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR，PCR反应条件如下：94℃5min；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kb，25个循环；68℃10min。DpnI限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化大肠杆菌W3110感受态细胞，得到超过10⁴个克隆的EctA随机突变库。

实施例3：EctA突变体的高通量筛选

将实施例2获得的EctA随机突变库转化至大肠杆菌W3110感受态细胞中。挑取单菌落至96孔板(每孔含有110μL的液体LB-Amp培养基)，在37℃、400rpm条件下孵育5h后，从每孔中取出60μL的菌液到96孔深孔板(每孔含有240μL的液体ME-Amp-0.2mM IPTG)，在30℃、400rpm条件下孵育12～16h。在4℃、4000rpm条件下离心10min，取上清液，用HPLC检测依克多因含量。

将发酵液中依克多因含量高低作为评定二氨基丁酸乙酰转移酶EctA酶活力高低的标准。选择活力明显提升的菌株，委托苏州金唯智生物科技有限公司进行基因组测序比对，确定氨基酸序列改变情况。将活力改善最高的菌株作为下一轮随机突变体库建库的出发菌株，重复进行上述EctA随机突变库建立及高通量筛选的步骤。共进行3轮突变，筛选结果列于表1中。

表1、第1轮到第3轮ectA随机突变库高通量筛选结果

备注：“-”代表没有检测到产物依克多因；“+”代表依克多因含量相对各自出发菌株大于0％小于等于100％；“++”代表依克多因含量相对各自出发菌株大于100％小于等于200％；“+++”代表依克多因含量相对各自出发菌株大于200％小于等于300％。

最终筛选出一株发酵液中依克多因含量提高最明显的菌株，命名为ECT-9。

经基因组测序比对，确定菌株ECT-9的ectA基因的核酸序列为SEQ ID NO:4，即EctA发生了突变，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

实施例4：摇瓶水平发酵生产依克多因

将冰箱保藏的ECT-1甘油菌和ECT-9甘油菌分别划线到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，挑取单菌落到5mL液体LB培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)中，在37℃、220rpm条件下孵育10～14h用作种子液。接种1mL种子液到装有100mL ME培养基的500mL摇瓶中，在220rpm、30℃下孵育。当OD₆₀₀值达到2.0～3.0时，加终浓度0.2mM的IPTG诱导质粒pTrc99A-ectABC上的ectA、ectB、ectC基因表达，诱导48h后，4000rpm离心10min，取上清液，用HPLC检测依克多因含量，结果如表2所示。

表1、摇瓶发酵生产依克多因含量

菌株编号	依克多因合成水平(g/L)
		ECT-1	0.11
ECT-9	2.14

上述结果表明，在野生型二氨基丁酸乙酰转移酶EctA发生了T4A、P17H、P53T、N162H和D177V突变后，依克多因的产量提高了18倍，提示突变体SEQ ID NO:3的酶活力提高了近20倍。

序列表

<110> 上海邦林生物科技有限公司

<120> 用于合成依克多因的二氨基丁酸乙酰转移酶突变体

<130> SHPI2110502

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2433

<212> DNA

<213> Halomonas elongata CGMCC 1.6329

<400> 1

atgaacgcaa ccacagagcc ctttacaccc tccgccgacc tggccaagcc cagcgtggcc 60

gatgccgtgg tcggccatga ggcctcaccg ctcttcatcc gcaagccaag ccccgatgac 120

ggctggggca tctacgagct ggtcaagtcc tgtccgcctc tcgacgtcaa ttccgcctac 180

gcctatctgt tgctggccac ccagttccgc gatagctgcg ccgtggcgac caacgaagag 240

ggcgagatcg tcggcttcgt ttccggctac gtgaagagca acgcccccga tacctatttc 300

ctctggcagg ttgccgtggg cgagaaggca cgtggcaccg gcctggcccg tcgtctggtg 360

gaagccgtga tgacacgccc ggaaatggcc gaggtccacc atctcgagac cactatcacg 420

cccgacaacc aggcgtcctg gggcttgttc cgccgtctcg ccgatcgctg gcaggcgccg 480

ttgaacagcc gcgaatactt ctccaccgat caactcggcg gtgagcatga cccggaaaac 540

ctcgttcgca tcggcccgtt ccagaccgac cagatctgag ccgggacgcc gcctggccgg 600

cccggtacgg gccggcaacc cgtcttttcg ttttatcact ttccccccac aggaggtcgc 660

aatgcagacc cagattctcg aacgcatgga gtccgacgtt cggacctact cccgctcctt 720

cccggtcgtc ttcaccaagg cgcgcaatgc ccgcctgacc gacgaggaag ggcgcgagta 780

catcgacttc ctggccggtg ccggcaccct gaactacggc cacaacaacc cgcacctcaa 840

gcaggcgctg ctcgactata tcgacagcga cggcatcgtc cacggcctgg acttctggac 900

tgcggccaag cgcgactatc tggaaaccct ggaagaggtg atcctcaagc cgcgcggtct 960

cgactacaag gtgcatctgc ccggaccgac tggcaccaac gccgtcgagg cggccattcg 1020

cctggcccgg gtcgccaagg ggcgccacaa tatcgtctcc ttcaccaacg gctttcatgg 1080

cgtcaccatg ggcgcgctgg cgaccaccgg taaccgcaag ttccgcgagg ccaccggtgg 1140

cgtgccgacc caggctgctt ccttcatgcc gttcgatggc tacctcggca gcagcaccga 1200

caccctcgac tacttcgaga agctgctcgg cgacaagtcc ggcggcctgg acgtgcccgc 1260

ggcggtgatc gtcgagacag tgcagggcga gggcggtatc aatgtcgccg gcctggagtg 1320

gctcaagcgc ctcgagagca tctgccgcgc caatgacatc ctgctgatca tcgacgacat 1380

ccaggcgggc tgcggccgga ccggcaagtt cttcagcttc gagcatgccg gcatcacgcc 1440

ggatatcgtg accaactcca agtcgctgtc cggttacggc ctgccgttcg ctcacgtcct 1500

gatgcgcccc gagctcgaca agtggaagcc cggtcagtac aacggcacct tccgcggctt 1560

caacctggct ttcgccactg ctgctgccgc catgcgcaag tactggagcg acgacacctt 1620

cgagcgtgac gtgcagcgca aggctcgcat cgtcgaggaa cgcttcggca agatcgccgc 1680

ctggctgagc gagaacggca tcgaggcctc cgagcgcggc cgcgggctga tgcggggcat 1740

cgacgtgggt tccggcgata tcgccgacaa gatcacccac caagccttcg agaacgggtt 1800

gatcatcgaa accagcggtc aggacggcga agtggtcaag tgcctgtgcc cgctgaccat 1860

tcccgacgaa gacctggtcg agggactcga catcctcgag accagcacca agcaggcctt 1920

tagctgatcg cctgaggtgc gccatcgggc ctgtccatgg catcctgtat cggtcggccg 1980

tgcgcggccg gccagtcatt gattcactgg agaatcgaca tgatcgttcg caatctcgaa 2040

gaagcgcgcc agaccgaccg tctggtcacc gccgaaaacg gcaactggga cagcacccgc 2100

ctgtcgctgg ccgaagatgg tggcaactgc tccttccaca tcacccgcat cttcgagggt 2160

accgagaccc acatccacta taagcatcac ttcgaggctg tttattgcat cgaaggcgag 2220

ggcgaagtgg aaaccctggc cgatggcaag atctggccca tcaagccggg tgacatctac 2280

atcctcgacc agcacgacga gcacctgctg cgcgccagca agaccatgca cctggcctgc 2340

gtgttcacgc cgggcctgac cggcaacgaa gtgcaccgcg aagacggttc ctacgcacct 2400

gccgacgaag ccgacgacca gaagccgctg taa 2433

<210> 2

<211> 192

<212> PRT

<213> Halomonas elongata CGMCC 1.6329

<400> 2

Met Asn Ala Thr Thr Glu Pro Phe Thr Pro Ser Ala Asp Leu Ala Lys

1 5 10 15

Pro Ser Val Ala Asp Ala Val Val Gly His Glu Ala Ser Pro Leu Phe

20 25 30

Ile Arg Lys Pro Ser Pro Asp Asp Gly Trp Gly Ile Tyr Glu Leu Val

35 40 45

Lys Ser Cys Pro Pro Leu Asp Val Asn Ser Ala Tyr Ala Tyr Leu Leu

50 55 60

Leu Ala Thr Gln Phe Arg Asp Ser Cys Ala Val Ala Thr Asn Glu Glu

65 70 75 80

Gly Glu Ile Val Gly Phe Val Ser Gly Tyr Val Lys Ser Asn Ala Pro

85 90 95

Asp Thr Tyr Phe Leu Trp Gln Val Ala Val Gly Glu Lys Ala Arg Gly

100 105 110

Thr Gly Leu Ala Arg Arg Leu Val Glu Ala Val Met Thr Arg Pro Glu

115 120 125

Met Ala Glu Val His His Leu Glu Thr Thr Ile Thr Pro Asp Asn Gln

130 135 140

Ala Ser Trp Gly Leu Phe Arg Arg Leu Ala Asp Arg Trp Gln Ala Pro

145 150 155 160

Leu Asn Ser Arg Glu Tyr Phe Ser Thr Asp Gln Leu Gly Gly Glu His

165 170 175

Asp Pro Glu Asn Leu Val Arg Ile Gly Pro Phe Gln Thr Asp Gln Ile

180 185 190

<210> 3

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Asn Ala Ala Thr Glu Pro Phe Thr Pro Ser Ala Asp Leu Ala Lys

1 5 10 15

His Ser Val Ala Asp Ala Val Val Gly His Glu Ala Ser Pro Leu Phe

20 25 30

Ile Arg Lys Pro Ser Pro Asp Asp Gly Trp Gly Ile Tyr Glu Leu Val

35 40 45

Lys Ser Cys Pro Thr Leu Asp Val Asn Ser Ala Tyr Ala Tyr Leu Leu

50 55 60

Leu Ala Thr Gln Phe Arg Asp Ser Cys Ala Val Ala Thr Asn Glu Glu

65 70 75 80

Gly Glu Ile Val Gly Phe Val Ser Gly Tyr Val Lys Ser Asn Ala Pro

85 90 95

Asp Thr Tyr Phe Leu Trp Gln Val Ala Val Gly Glu Lys Ala Arg Gly

100 105 110

Thr Gly Leu Ala Arg Arg Leu Val Glu Ala Val Met Thr Arg Pro Glu

115 120 125

Met Ala Glu Val His His Leu Glu Thr Thr Ile Thr Pro Asp Asn Gln

130 135 140

Ala Ser Trp Gly Leu Phe Arg Arg Leu Ala Asp Arg Trp Gln Ala Pro

145 150 155 160

Leu His Ser Arg Glu Tyr Phe Ser Thr Asp Gln Leu Gly Gly Glu His

165 170 175

Val Pro Glu Asn Leu Val Arg Ile Gly Pro Phe Gln Thr Asp Gln Ile

180 185 190

<210> 4

<211> 576

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atgaacgcag ccacagagcc ctttacaccc tccgccgacc tggccaagca cagcgtggcc 60

gatgccgtgg tcggccatga ggcctcaccg ctcttcatcc gcaagccaag ccccgatgac 120

ggctggggca tctacgagct ggtcaagtcc tgtccgactc tcgacgtcaa ttccgcctac 180

gcctatctgt tgctggccac ccagttccgc gatagctgcg ccgtggcgac caacgaagag 240

ggcgagatcg tcggcttcgt ttccggctac gtgaagagca acgcccccga tacctatttc 300

ctctggcagg ttgccgtggg cgagaaggca cgtggcaccg gcctggcccg tcgtctggtg 360

gaagccgtga tgacacgccc ggaaatggcc gaggtccacc atctcgagac cactatcacg 420

cccgacaacc aggcgtcctg gggcttgttc cgccgtctcg ccgatcgctg gcaggcgccg 480

ttgcacagcc gcgaatactt ctccaccgat caactcggcg gtgagcatgt cccggaaaac 540

ctcgttcgca tcggcccgtt ccagaccgac cagatc 576

<210> 5

<211> 2433

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

atgaacgcag ccacagagcc ctttacaccc tccgccgacc tggccaagca cagcgtggcc 60

gatgccgtgg tcggccatga ggcctcaccg ctcttcatcc gcaagccaag ccccgatgac 120

ggctggggca tctacgagct ggtcaagtcc tgtccgactc tcgacgtcaa ttccgcctac 180

gcctatctgt tgctggccac ccagttccgc gatagctgcg ccgtggcgac caacgaagag 240

ggcgagatcg tcggcttcgt ttccggctac gtgaagagca acgcccccga tacctatttc 300

ctctggcagg ttgccgtggg cgagaaggca cgtggcaccg gcctggcccg tcgtctggtg 360

gaagccgtga tgacacgccc ggaaatggcc gaggtccacc atctcgagac cactatcacg 420

cccgacaacc aggcgtcctg gggcttgttc cgccgtctcg ccgatcgctg gcaggcgccg 480

ttgcacagcc gcgaatactt ctccaccgat caactcggcg gtgagcatgt cccggaaaac 540

ctcgttcgca tcggcccgtt ccagaccgac cagatctgag ccgggacgcc gcctggccgg 600

cccggtacgg gccggcaacc cgtcttttcg ttttatcact ttccccccac aggaggtcgc 660

aatgcagacc cagattctcg aacgcatgga gtccgacgtt cggacctact cccgctcctt 720

cccggtcgtc ttcaccaagg cgcgcaatgc ccgcctgacc gacgaggaag ggcgcgagta 780

catcgacttc ctggccggtg ccggcaccct gaactacggc cacaacaacc cgcacctcaa 840

gcaggcgctg ctcgactata tcgacagcga cggcatcgtc cacggcctgg acttctggac 900

tgcggccaag cgcgactatc tggaaaccct ggaagaggtg atcctcaagc cgcgcggtct 960

cgactacaag gtgcatctgc ccggaccgac tggcaccaac gccgtcgagg cggccattcg 1020

cctggcccgg gtcgccaagg ggcgccacaa tatcgtctcc ttcaccaacg gctttcatgg 1080

cgtcaccatg ggcgcgctgg cgaccaccgg taaccgcaag ttccgcgagg ccaccggtgg 1140

cgtgccgacc caggctgctt ccttcatgcc gttcgatggc tacctcggca gcagcaccga 1200

caccctcgac tacttcgaga agctgctcgg cgacaagtcc ggcggcctgg acgtgcccgc 1260

ggcggtgatc gtcgagacag tgcagggcga gggcggtatc aatgtcgccg gcctggagtg 1320

gctcaagcgc ctcgagagca tctgccgcgc caatgacatc ctgctgatca tcgacgacat 1380

ccaggcgggc tgcggccgga ccggcaagtt cttcagcttc gagcatgccg gcatcacgcc 1440

ggatatcgtg accaactcca agtcgctgtc cggttacggc ctgccgttcg ctcacgtcct 1500

gatgcgcccc gagctcgaca agtggaagcc cggtcagtac aacggcacct tccgcggctt 1560

caacctggct ttcgccactg ctgctgccgc catgcgcaag tactggagcg acgacacctt 1620

cgagcgtgac gtgcagcgca aggctcgcat cgtcgaggaa cgcttcggca agatcgccgc 1680

ctggctgagc gagaacggca tcgaggcctc cgagcgcggc cgcgggctga tgcggggcat 1740

cgacgtgggt tccggcgata tcgccgacaa gatcacccac caagccttcg agaacgggtt 1800

gatcatcgaa accagcggtc aggacggcga agtggtcaag tgcctgtgcc cgctgaccat 1860

tcccgacgaa gacctggtcg agggactcga catcctcgag accagcacca agcaggcctt 1920

tagctgatcg cctgaggtgc gccatcgggc ctgtccatgg catcctgtat cggtcggccg 1980

tgcgcggccg gccagtcatt gattcactgg agaatcgaca tgatcgttcg caatctcgaa 2040

gaagcgcgcc agaccgaccg tctggtcacc gccgaaaacg gcaactggga cagcacccgc 2100

ctgtcgctgg ccgaagatgg tggcaactgc tccttccaca tcacccgcat cttcgagggt 2160

accgagaccc acatccacta taagcatcac ttcgaggctg tttattgcat cgaaggcgag 2220

ggcgaagtgg aaaccctggc cgatggcaag atctggccca tcaagccggg tgacatctac 2280

atcctcgacc agcacgacga gcacctgctg cgcgccagca agaccatgca cctggcctgc 2340

gtgttcacgc cgggcctgac cggcaacgaa gtgcaccgcg aagacggttc ctacgcacct 2400

gccgacgaag ccgacgacca gaagccgctg taa 2433

Claims

1. 一种二氨基丁酸乙酰转移酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 3。

2.编码如权利要求1所述二氨基丁酸乙酰转移酶突变体的基因。

3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO: 4。

4.一种用于表达依克多因合成途径中二氨基丁酸乙酰转移酶EctA、二氨基丁乙酸转氨酶EctB和四氢嘧啶合酶EctC的ectABC基因簇，其特征在于，包含如权利要求2或3所述的基因。

5. 如权利要求4所述的ectABC基因簇，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO: 5。

6.一种微生物，其基因组中包含如权利要求4或5所述的ectABC基因簇。

7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，其为大肠杆菌。

8.如权利要求6或7所述的微生物在生产依克多因中的用途。