CN113549633A - 一种l-半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产l半胱氨酸中的应用 - Google Patents

一种l-半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产l半胱氨酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种L‑半胱氨酸转运蛋白突变体制备方法，其方法步骤包括：⑴A31V突变体的获得，以SEQIDNO.2核苷酸序列为模板，SEQIDNO.3、SEQIDNO.4为引物，进行PCR得到的突变体基因eamBA31V；⑵将突变体基因eamBA31V与PMW118质粒分别用EcorI,XbaI双酶切，酶切产物纯化后用T4连接酶22℃连接12小时，连接产物用化学转化法转化DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄氯霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养；⑶对固体培养基上长出的单菌落用PMW118通用引物M13F、M13R进行菌落PCR，将PCR产物测序，验证正确的单菌落扩大培养，提取质粒PMW118‑eamB‑A31V。本发明同时将L‑半胱氨酸转运蛋白突变体应用于产L‑半胱氨酸大肠杆菌工程菌株，可使大肠杆菌对L‑半胱氨酸耐受性提高1.78倍，L‑半胱氨酸产量提高18％。

Description

一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产L半胱氨酸中的 应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及编码基因应用技术，尤其是一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产L半胱氨酸中的应用。
背景技术
L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛应用于食品，生物，农业等领域。L-半胱氨酸的产量从2012年的2770吨增加到2017年的3402吨，平均增长率为420％。
在大规模工业化生产上，L-半胱氨酸主要依靠蛋白质水解产生，由于较低的提取率以及生产中产生的有害气体和浪费问题，市场更青睐合成或生物技术方法生产L-半胱氨酸，其中就包括发酵法，但目前微生物发酵法生产L-半胱氨酸面临着产量不足的问题，缺乏一种高产的L-半胱氨酸工程菌，因此，通过改造L-半胱氨酸转运蛋白，增强胞内L-半胱氨酸的外排，减轻菌种的代谢负担，对微生物发酵生产L-半胱氨酸具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产L半胱氨酸中的应用，在天然L-半胱氨酸转运蛋白EAMB的基础上，通过定向进化技术改造蛋白质分子结构，突变蛋白可使大肠杆菌对L-半胱氨酸耐受性提高1.78倍，L-半胱氨酸产量提高18％。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体制备方法，包括含L-半胱氨酸转运蛋白突变体的重组质粒的构建，其方法步骤如下：
⑴A31V突变体的获得，以SEQ ID NO.2核苷酸序列为模板，SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4为引物，进行PCR即得到的突变体基因eamBA31V，该突变体基因的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；
⑵将突变体基因eamBA31V与PMW118质粒分别用EcorI,XbaI双酶切，酶切产物纯化后用T4连接酶22℃连接12小时，连接产物用化学转化法转化DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄氯霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养；
⑶对固体培养基上长出的单菌落用PMW118通用引物M13F、M13R进行菌落PCR，将PCR产物测序，验证正确的单菌落扩大培养，提取质粒，将质粒命名为PMW118-eamB-A31V。
而且，含氨苄氯霉素的LB固体平板浓度为100mg/ul。
一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体在生产L半胱氨酸中的应用，应用于产L-半胱氨酸大肠杆菌工程菌株，具体方法包括：将得到的重组质粒PMW118-eamB-A31V按化学转化法化转至大肠杆菌感受态细胞，5uL质粒PMW118-eamB-A31V在超净工作100uLW3110 tnaAyham中，冰种放置30min，42℃水浴90S，冰上放置4min，加入890uLSOC培养基，37℃，200rpm/min复苏30分钟，8000rpm/min离心30s秒，留100ul培养基重悬，涂布于100mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养12小时，得到重组菌株W3110ΔtnaAΔYham-eamB-A31V。
而且，化学转化法需要的培养基为Luria-Bertani培养基，其组分包括：酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨10g/L。
本发明的优点和积极效果是：
本发明在天然L-半胱氨酸转运蛋白EAMB的基础上，通过定向进化技术改造蛋白质分子结构，突变蛋白可使大肠杆菌对L-半胱氨酸耐受性提高1.78倍，L-半胱氨酸产量提高18％。本发发明对大肠杆菌L-半胱氨酸转运蛋白EAMB第31位的氨基酸对该蛋白的转运L-半胱氨酸能力有较大影响，可用于大肠杆菌发酵生产L-半胱氨酸，对蛋白的转运机理的研究提供了一定的理论基础并提高了该转运蛋白的工业应用价值。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
一、含L-半胱氨酸转运蛋白突变体的重组质粒的构建
(1)A31V突变体的获得，以SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为模板，SEQ ID NO.3、SEQID NO.4为引物，进行PCR得到的突变体基因eamBA31V，该突变体基因的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
(2)将重组基因eamBA31V与PMW118质粒分别用EcorI,XbaI双酶切，酶切产物纯化后用T4连接酶22℃连接12小时，连接产物用化学转化法转化DH5α感受态细胞，涂布与含氨苄氯霉素(100mg/ul)的的LB固体平板上37℃过夜培养。
(3)对固体培养基上长出的单菌落用PMW118通用引物M13F，M13R进行菌落PCR，将PCR产物测序，验证正确的单菌落扩大培养，提取质粒，将质粒命名为PMW118-eamB-A31V，测序工作由金唯智完成。
二、产L-半胱氨酸大肠杆菌工程菌株的构建
将步骤一得到的重组质粒PMW118-eamB-A31V按化学转化法化转至大肠杆菌感受态细胞。
化学转化法需要的培养基成分如下：(g/L)Luria-Bertani培养基：酵母提取物5；氯化钠10，蛋白胨10。
化学转化法步骤：
5uL质粒PMW118-eamB-A31V在超净工作100uLW3110 tnaA yham中，冰种放置30min，42℃水浴90S，冰上放置4min，加入890uLSOC培养基，37℃，200rpm/min复苏30分钟。8000rpm/min离心30s秒，留100ul培养基重悬，涂布于LB(100mg/mL氨苄青霉素)固体培养基上，37℃培养12小时，得到重组菌株W3110ΔtnaAΔYham-eamB-A31V。
重组菌株W3110ΔtnaAΔYham-eamB-A31V发酵L-半胱氨酸产量测试。
(1)将重组菌株W3110ΔtnaAΔyham-eamB-A31V划线于含有相应抗性的LB平板上划线，37°倒置培养12h；挑取单菌落接种于含有3mlLB(100ug/ml氨苄青霉素)液体培养基的试管中，37°，200rpm震荡过夜；转接到发酵培养基中，培养二十四小时后接种量接种于20mL/250mL的SMI发酵培养基中，调整起始OD＝1，32°，200rpm，震荡培养二十四小时后取菌液用化学法测定L-cys含量。
(2)重组菌株发酵培养基SMI配方：(g/L)
100mmol的磷酸盐缓冲液(pH7.0),75.5mmol(NH4)2SO4,1.7mmolNaCl,1.0mmolCaCl2,7.2umol的FeSO4,3.4mmol的柠檬酸钠，0.6umol/LNa2SO4,40.4umol/LH3BO3,2.9umolCoCl2,1umol的CuSO4,8.1umol的MnCl2,1umol的ZnSO4,30g的葡萄糖(Glucose)配置后0.22um的滤膜滤。
(3)L-半胱氨酸测定方法
配置茚三酮溶液：250mg茚三酮，浓盐酸4ml,冰乙酸6ml,室温下用磁力搅拌器混匀15min左右，现配现用。
反应过程：茚三酮溶液，冰乙酸溶液，检测液各500ul,混匀，沸水浴10min，冰浴至室温。
测定方法：使用紫外分光光度计测定反应液560nm处的吸收光，使数值在0.2-0.8之间，若测定值超出了此范围，则稀释一定倍数再测定。
结果表明突变体W3110ΔtnaAΔyham-eamB-A31V比对照组W3110ΔtnaAΔYham-eamB发酵产量提高了18％。
表1大肠杆菌重组菌株发酵L-半胱氨酸产量
Figure BDA0003105009540000031
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Figure BDA0003105009540000041
Figure BDA0003105009540000051
序列表
<120> 一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产L半胱氨酸中的应用
<141> 2021-06-08
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 195
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Met Thr Pro Thr Leu Leu Ser Ala Pro Thr Thr Thr Thr Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ala Met Thr Pro Gly Pro Ala Ala Ile Leu Ala Leu Ser Ser Val Thr
20 25 30
Ser His Gly Pro Ala Gly Ser Thr Ala Val Leu Ala Gly Met Ser Leu
35 40 45
Gly Pro Leu Ile Val Met Leu Leu Cys Ala Gly Ile Ser Pro Ser Leu
50 55 60
Ala Val Ile Ala Pro Ala Ala Val His Leu Leu Ser Thr Ala Gly Ala
65 70 75 80
Ala Thr Ile Val Thr Leu Ala Thr Leu Ile Ala Thr Ser Pro Thr Leu
85 90 95
Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Pro Ile Ser Pro Thr Ala Ser Pro Ala
100 105 110
Leu Gly Pro Val Ala Val Leu Ile Ile Leu Thr Gly Val Thr Ala Leu
115 120 125
Ser Thr Pro Val Leu Pro Gly Thr Gly Ala Leu Ser Thr Val Val Gly
130 135 140
Val Ser Val Leu Leu Ala Met Ile Gly Thr Pro Gly Ala Val Cys Thr
145 150 155 160
Ala Leu Ala Gly His Leu Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly Thr Gly Ala
165 170 175
Gly Leu Ala Ile Val Leu Ala Leu Leu Leu Val Thr Cys Ala Val Ala
180 185 190
Ile Pro Thr
195
<210> 2
<211> 587
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
gtgacaccga cccttttaag tgctttttgg acttacaccc tgattaccgc tatgacgcca 60
ggaccgaaca atattctcgc ccttagctct gctacgtcgc atggatttcg tcaaagtacc 120
cgcgtgctgg cagggatgag tctgggattt ttgattgtga tgttactgtg tgcgggcatt 180
tcattttcac tggcagtgat tgacccggca gcggtacacc ttttgagttg ggcgggggcg 240
gcatatattg tctggctggc gtggaaaatc gccaccagcc caacaaagga agacggactt 300
caggcaaaac caatcagctt ttgggccagc tttgctttgc agtttgtgaa gtcaaaatca 360
ttttgtacgg tgttacggca ctgtcgacgt ttgttctgcc gcaaacacag gcgttaagct 420
gggtagttgg cgtcagcgtt ttgctggcga tgattgggac gtttggcaat gtgtgctggg 480
cgctggcggg gcatctgttt cagcgattgt ttcgccagta tggtcgccag ttaaatatcg 540
tgcttgccct gttgctggtc tattgcgcgg tacgcatttt ctattaa 587
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
accgaacaat attctcgccc ttagctctnn kacgtc 36
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
agaatattgt tcggtcctgg cgtcatagcg gtaatc 36

Claims (4)

1.一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体制备方法，其特征在于：包括含L-半胱氨酸转运蛋白突变体的重组质粒的构建，其方法步骤如下：
⑴A31V突变体的获得，以SEQ ID NO.2核苷酸序列为模板，SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4为引物，进行PCR得到的突变体基因eamBA31V，该突变体基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
⑵将突变体基因eamBA31V与PMW118质粒分别用EcorI,XbaI双酶切，酶切产物纯化后用T4连接酶22℃连接12小时，连接产物用化学转化法转化DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄氯霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养；
⑶对固体培养基上长出的单菌落用PMW118通用引物M13F、M13R进行菌落PCR，将PCR产物测序，验证正确的单菌落扩大培养，提取质粒，将质粒命名为PMW118-eamB-A31V。
2.根据权利要求1所述的一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体制备方法，其特征在于：含氨苄氯霉素的LB固体平板浓℃为100mg/ul。
3.一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体在生产L半胱氨酸中的应用，其特征在于：应用于产L-半胱氨酸大肠杆菌工程菌株，具体方法包括：将得到的重组质粒PMW118-eamB-A31V按化学转化法化转至大肠杆菌感受态细胞，5uL质粒PMW118-eamB-A31V在超净工作100uLW3110tnaA yham中，冰种放置30min，42℃水浴90S，冰上放置4min，加入890uLSOC培养基，37℃，200rpm/min复苏30分钟，8000rpm/min离心30s秒，留100ul培养基重悬，涂布于100mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养12小时，得到重组菌株W3110ΔtnaAΔYham-eamB-A31V。
4.根据权利要求3所述的一种L-半胱氨酸转运蛋白突变体在生产L半胱氨酸中的应用，其特征在于：化学转化法需要的培养基为Luria-Bertani培养基，其组分包括：酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、蛋白胨10g/L。
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