CN117625665A - 一种基于纤维小体脚手架蛋白胞内多酶组装构建产l-赖氨酸工程菌的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于纤维小体脚手架蛋白胞内多酶组装构建产L‑赖氨酸工程菌的方法及应用，属于基因工程和酶工程领域，主要为取来源于大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875酶基因组合与对接蛋白DocA‑D3，依据RED同源重组进行基因组上的双片段同源组装构建工程菌，脚手架蛋白ScaA利用质粒载体pET‑28a(+)构建质粒pET‑28a(+)‑ScaA；将质粒pET‑28a(+)‑ScaA转化入工程菌构建目的工程菌，本发明制备的工程菌L‑赖氨酸浓度达到67.6g/L，比出发菌株E.coli CGMCC 1.12875提高46.9％，有效提高了L‑赖氨酸浓度。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种基于纤维小体脚手架蛋白胞内多酶组装构建产L-赖氨酸工程菌的方法及应用。
背景技术
纤维小体通常存在于细胞表面，通过特异锚定充分接触酶促环境，多角度促进纤维素酶发挥降解作用：(1)提高多种酶发挥作用的协调性；(2)对于催化效率低的纤维素酶种，定向减少它们对纤维素底物的吸附量；(3)降低多种复杂酶在相近空间中的竞争压力；(4)最大限度延长纤维素酶催化降解底物的持续时间，更彻底地发挥作用，参见文献[Schwarz,Applied Microbiology Biotechnology，2001，56(5-6)：634]。
现有技术发现使用人工纤维小体架构在酵母表面展示3个级联反应的酶，将甲醇氧化为二氧化碳产生NADH，反应速率提高5倍。美国加州大学河滨分校Lin等使用人工纤维小体架构将多个酶定位到酵母的脂滴表面，产生乙酸乙酯的速率比未使用纤维小体架构的酶提升了两倍，参见文献[Lin,ACS Synthetic Biology，2017，6(8)：1534-1544]。人工纤维小体可应用于多种微生物细胞胞外，现有技术无法实现胞内纤维小体关键元件组装多种关键酶。
目前，提升L-赖氨酸发酵强度主要有两大途径：一是通过启动子、SD序列优化等手段提高L-赖氨酸合成关键酶的表达量；二是通过对合成途径上的酶分子进行改造，提高酶的活性，进而提高L-赖氨酸合成速率。虽然上述途径均可以提高L-赖氨酸的发酵强度，但通常仅考虑到L-赖氨酸合成途径中的一种或几种关键酶，而由于L-赖氨酸的合成途径较长，参与合成的酶数量较多，现有技术通过过表达一个或几个酶的基因往往难以完成L-赖氨酸合成途径中的多酶种的同时增强来提高工业菌L-赖氨酸的合成强度。纤维小体可连续组装多个酶蛋白，由于胞内环境钙离子浓度低，现有技术无法实现基于纤维小体脚手架蛋白的多酶组装，现有技术无法实现胞内多酶高效组装提高发酵效率。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于纤维小体脚手架蛋白胞内多酶组装构建产L-赖氨酸工程菌的方法及应用。
本发明提供一种基于纤维小体脚手架蛋白多酶胞内组装的方法及应用，解决了现有纤维小体元件在细胞内高效组装多酶的问题。
本发明涉及的技术方案
一种基于纤维小体脚手架蛋白胞内多酶组装构建产L-赖氨酸工程菌的方法，包括如下步骤：
(1)取来源于大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875酶基因组合与对接蛋白DocA-D3，依据RED同源重组进行基因组上的双片段同源组装，出发菌株为大肠杆菌E.coli CGMCC1.12875，得到RED重组工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC、QDE-asd-DocA-D3-dapA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB或QDE-dapE-DocA-D3-dapF；
(2)脚手架蛋白ScaA利用质粒载体pET-28a(+)构建质粒pET-28a(+)-ScaA；
(3)将步骤(2)的质粒pET-28a(+)-ScaA转化入步骤(1)的工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC、QDE-asd-DocA-D3-dapA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB或QDE-dapE-DocA-D3-dapF中，筛选获得工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC::pET-28a(+)-ScaA、QDE-asd-DocA-D3-dapA::pET-28a(+)-ScaA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB::pET-28a(+)-ScaA或QDE-dapE-DocA-D3-dapF::pET-28a(+)-ScaA；
所述酶基因组合包括：aspC和lysC组合、asd和dapA组合、dapA和dapB组合或dapE和dapF组合；
对接蛋白DocA-D3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
脚手架蛋白ScaA核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
酶基因aspC核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；酶基因lysC核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；酶基因asd核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；酶基因dapA核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；酶基因dapB核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；酶基因dapE核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示；酶基因dapF核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
根据本发明优选的，步骤(1)中，工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC、QDE-asd-DocA-D3-dapA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB或QDE-dapE-DocA-D3
-dapF的构建，具体如下：
②多片段无缝克隆组装框的构建
使用EcoRI和NotI双酶切制备线性化pET-28a(+)载体；
以大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875基因组为模板，设计组装基因的上下游同源臂引物X1-F/R和X2-F/R；再通过PCR扩增得到目的片段X1和X2；与组装基因相连的DocA-D3基因的上下游引物X-D3-F/R，通过PCR扩增获得DocA-D3片段；以质粒pKD13为模板，上下游引物X-FRT-F/R，PCR扩增得到与组装基因同源臂重叠的frt位点片段FRT-XKan-FRT；组装框的上下游引物X组装框F/R，扩增验证X1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-X2组装框片段的获得；
使用多片段无缝克隆方法将aspC1片段，aspC2片段，DocA-D3片段，FRT-aspCKan-FRT片段，线性化克隆载体pET-28a(+)重组连接，提取构建的质粒pET-28a(+)-aspC1-DocA-D3-FRT-aspCKan-FRT-aspC2；然后以此为模板，以组装框aspC-F/R为上下游引物进行PCR扩增，纯化回收获得aspC1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-aspC2组装框片段；
同理，获得lysC1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-lysC2组装框片段，asd1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-asd2组装框片段，dapA1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-dapA2组装框片段，dapB1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-dapB2组装框片段，dapE1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-dapE2组装框片段，dapF1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-dapF2组装框片段；
扩增引物核苷酸序列如下：
aspC1-F：如SEQ ID NO.13所示；aspC1-R：如SEQ ID NO.14所示；
aspC-D3-F：如SEQ ID NO.15所示；aspC-D3-R：如SEQ ID NO.16所示；
aspC-FRT-F：如SEQ ID NO.17所示；aspC-FRT-R：如SEQ ID NO.18所示；
aspC2-F：如SEQ ID NO.19所示；aspC2-R：如SEQ ID NO.20所示；
lysC1-F：如SEQ ID NO.21所示；lysC1-R：如SEQ ID NO.22所示；
lysC-D3-F：如SEQ ID NO.23所示；lysC-D3-R：如SEQ ID NO.24所示；
lysC-FRT-F：如SEQ ID NO.25所示；lysC-FRT-R：如SEQ ID NO.26所示；
lysC2-F：如SEQ ID NO.27所示；lysC2-R：如SEQ ID NO.28所示；
asd1-F：如SEQ ID NO.29所示；asd1-R：如SEQ ID NO.30所示；
asd-D3-F：如SEQ ID NO.31所示；asd-D3-R：如SEQ ID NO.32所示；
asd-FRT-F：如SEQ ID NO.33所示；asd-FRT-R：如SEQ ID NO.34所示；
asd2-F：如SEQ ID NO.35所示；asd2-R：如SEQ ID NO.36所示；
dapA1-F：如SEQ ID NO.37所示；dapA1-R：如SEQ ID NO.38所示；
dapA-D3-F：如SEQ ID NO.39所示；dapA-D3-R：如SEQ ID NO.40所示；
dapA-FRT-F：如SEQ ID NO.41所示；dapA-FRT-R：如SEQ ID NO.42所示；
dapA2-F：如SEQ ID NO.43所示；dapA2-R：如SEQ ID NO.44所示；
dapB1-F：如SEQ ID NO.45所示；dapB1-R：如SEQ ID NO.46所示；
dapB-D3-F：如SEQ ID NO.47所示；dapB-D3-R：如SEQ ID NO.48所示；
dapB-FRT-F：如SEQ ID NO.49所示；dapB-FRT-R：如SEQ ID NO.50所示；
dapB2-F：如SEQ ID NO.51所示；dapB2-R：如SEQ ID NO.52所示；
dapE1-F：如SEQ ID NO.53所示；dapE1-R：如SEQ ID NO.54所示；
dapE-D3-F：如SEQ ID NO.55所示；dapE-D3-R：如SEQ ID NO.56所示；
dapE-FRT-F：如SEQ ID NO.57所示；dapE-FRT-R：如SEQ ID NO.58所示；
dapE2-F：如SEQ ID NO.59所示；dapE2-R：如SEQ ID NO.60所示；
dapF1-F：如SEQ ID NO.61所示；dapF1-R：如SEQ ID NO.62所示；
dapF-D3-F：如SEQ ID NO.63所示；dapF-D3-R：如SEQ ID NO.64所示；
dapF-FRT-F：如SEQ ID NO.65所示；dapF-FRT-R：如SEQ ID NO.66所示；
dapF2-F：如SEQ ID NO.67所示；dapF2-R：如SEQ ID NO.68所示；
组装框aspC-F：如SEQ ID NO.69所示；组装框aspC-R：如SEQ ID NO.70所示；组装框lysC-F：如SEQ ID NO.71所示；组装框lysC-R：如SEQ ID NO.72所示；组装框asd-F：如SEQID NO.73所示；组装框asd-R：如SEQ ID NO.74所示；组装框dapA-F：如SEQ ID NO.75所示；组装框dapA-R：如SEQ ID NO.76所示；组装框dapB-F：如SEQ ID NO.77所示；组装框dapB-R：如SEQ ID NO.78所示；组装框dapE-F：如SEQ ID NO.79所示；组装框dapE-R：如SEQ IDNO.80所示；组装框dapF-F：如SEQ ID NO.81所示；组装框dapF-R：如SEQ ID NO.82所示；
②RED同源重组工程菌的构建
(a)制备大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875感受态细胞；
(b)将pKD46质粒转化入大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875感受态细胞，获得大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875/pKD46；
(c)制备大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875/pKD46感受态，将aspC1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-aspC2组装框片段转入大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875/pKD46感受态细胞，42℃培养消除pKD46质粒，获得携带组装框的重组菌；
(d)制备携带组装框的重组菌感受态细胞，将pCP20质粒转化入携带组装框的重组菌感受态细胞，验证培养消除重组菌Kan抗性，42℃培养消除pCP20质粒，获得aspC组装菌QDE-aspC-DocA-D3；
同理，重复(a)-(d)步骤组装酶基因lysC，依次完成aspC和lysC与对接蛋白DocA-D3在基因组水平上的组装，筛选验证得到RED重组工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC；
同理，重复①-②步骤，制备得到RED重组工程菌QDE-asd-DocA-D3-dapA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB和QDE-dapE-DocA-D3-dapF；
③将质粒pET-28a(+)-ScaA转化入RED重组工程菌
QDE-aspC-DocA-D3-lysC、QDE-asd-DocA-D3-dapA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB或QDE-dapE-DocA-D3-dapF中，筛选获得工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC::pET-28a(+)-ScaA、QDE-asd-DocA-D3-dapA::pET-28a(+)-ScaA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB::pET-28a(+)-ScaA或QDE-dapE-DocA-D3-dapF::pET-28a(+)-ScaA。
进一步优选的，步骤①中，PCR反应体系：
质粒载体模板2μL，正向引物F 2μL，反向引物R 2μL，2×Phanta Max Master Mix25μL，ddH2O 19μL。
进一步优选的，步骤①中，PCR反应条件：
95℃预变性3min；95℃15sec，60℃15sec，72℃30sec，30个循环；补充延伸72℃5min。
进一步优选的，步骤①中，表达载体pET-28a(+)的双酶切体系：
EcoRI酶2.5μL，NotI酶2.5μL，10×FastDigest 7.5μL，质粒pET-28a(+)25μL，ddH2O 12.5μL。
进一步优选的，步骤①中，构建aspC组装框时多片段无缝克隆体系：
aspC1片段1μL，aspC2片段1μL，DocA-D3 2μL，FRT-aspCKan-FRT片段2μL，线性化克隆载体pET-28a(+)2μL，5×CEⅡBuffer 4μL，ExnaseⅡ2μL，ddH2O 6μL；37℃、30min连接，获得aspC1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-aspC2组装框片段。
进一步优选的，步骤②中，使用CaCl2法制备感受态细胞。
进一步优选的，步骤③中，质粒pET-28a(+)-ScaA转化入RED重组工程菌，电转仪参数为2500v，25μF，200Ω，电击时间4-5ms。
上述方法构建的工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC::pET-28a(+)-ScaA、QDE-asd-DocA-D3-dapA::pET-28a(+)-ScaA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB::pET-28a(+)-ScaA或QDE-dapE-DocA-D3-dapF::pET-28a(+)-ScaA在生产L-赖氨酸中的应用。
本发明的有益效果如下：
1、本发明制备的工程菌L-赖氨酸浓度达到67.6g/L，比出发菌株E.coli CGMCC1.12875提高46.9％，有效提高了L-赖氨酸浓度。
2、本发明涉及的纤维小体对接蛋白DocA-D3实现了在细胞内与脚手架蛋白的有效组装。
3、本发明为细胞内多酶复合体的组装提供了新的方法和途径，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例5对应的基于纤维小体脚手架蛋白多酶胞内组装关键酶基因aspC和lysC工程菌发酵过程变化图。
图2为实施例5对应的基于纤维小体脚手架蛋白多酶胞内组装关键酶基因asd和dapA工程菌发酵过程变化图。
图3为实施例5对应的基于纤维小体脚手架蛋白多酶胞内组装关键酶基因dapA和dapB工程菌发酵过程变化图。
图4为实施例5对应的基于纤维小体脚手架蛋白多酶胞内组装关键酶基因dapE和dapF工程菌发酵过程变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但本发明保护范围不限于此。
材料来源
质粒pET-28a(+)、pKD46、pKD13和pCP20由齐鲁工业大学山东省微生物工程重点实验室提供，本领域技术人可以根据现有技术构建，也可由该重点实验室购买获得，也可购买市售产品；大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
实施例中未注明具体条件的内容，按照常规条件进行；所用试剂或仪器未注明生成厂商的，均为普通市售产品。
实施例1
大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875基因组提取和质粒pKD46、pKD13、pCP20和pET-28a(+)的提取。
大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875基因组提取按照诺唯赞基因组提取试剂盒步骤完成；对实验室保藏的DH5α甘油菌进行活化培养后，提取质粒pKD46、pKD13、pCP20和pET-28a(+)，分别按照诺唯赞质粒提取试剂盒进行各自对应质粒的提取。
L-赖氨酸合成关键酶-纤维小体元件胞内组装表达载体设计
DocA蛋白Ca2+结合位点钙离子以内的氨基酸作为Ca2+结合的关键氨基酸，结合蛋白稳定突变点计算网站敲定了以两个钙离子结合位点为主的关键突变区域：D5VN7GD9GT11INSTD16和D39VD41KN43GS45INAAD50。对于D5、N7、D9、T11、D16、D39、D41、N43、S45和D50关键氨基酸位点，采用ISM进化设计软件CASTER 2.1和氨基酸结构特性分析，选择D5VN7GD9GT11突变为D5VD7GS9GR11，D39VD41KN43GS45突变为D39TS41NN43GT45，提交氨基酸序列优化合成获得对接蛋白DocA突变体DocA-D3。
不进行突变的对接蛋白DocA无法与黏连蛋白Coh在细胞内组装。
对接蛋白DocA-D3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；对接蛋白DocA的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.85所示。
黏连蛋白Coh核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；脚手架蛋白ScaA核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
所述酶基因组合包括：aspC和lysC组合、asd和dapA组合、dapA和dapB组合或dapE和dapF组合，具体核苷酸序列如下：
酶基因aspC核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；酶基因lysC核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；酶基因asd核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；酶基因dapA核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；酶基因dapB核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；酶基因dapE核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示；酶基因dapF核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
多片段无缝克隆组装框的构建所需的引物设计
以大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875基因组为模板，利用Oligo 7.0软件设计组装基因的上下游同源臂引物(设计的同源臂长度300bp-500bp)X1-F/R和X2-F/R，再通过PCR扩增得到目的片段X1和X2；与组装基因相连的DocA-D3基因的上下游引物X-D3-F/R，获得DocA-D3片段；以质粒pKD13为模板，位于质粒pKD13上的frt位点片段大小为1324bp，上下游引物FRT-XKan-FRT-F/R，PCR扩增得到与组装基因同源臂重叠的frt位点片段FRT-XKan-FRT；组装框的上下游引物X组装框F/R；扩增引物核苷酸序列表如表1所示。
表1引物列表
实施例2
多片段无缝克隆组装框的构建
在基因组水平组装酶基因aspC，使用EcoRI和NotI双酶切制备线性化pET-28a(+)载体。双酶切体系：EcoRI酶2.5μL，NotI酶2.5μL，10×FastDigest 7.5μL，质粒pET-28a(+)25μL，ddH2O 12.5μL。酶切条件为37℃恒温水浴，时间为2小时，酶切完成后使用胶回收试剂盒进行纯化回收。
通过PCR扩增出构建胞内组装框所需的四个基因片段，首先使用aspC1-F和aspC1-R，克隆组装基因aspC的上同源臂aspC1，同样使用aspC2-F和引物aspC2-R克隆组装基因aspC下同源臂aspC2；使用上下游引物aspC-D3-F和aspC-D3-R，克隆与aspC同源臂相连的DocA-D3片段；然后使用上游引物aspC-FRT-F和下游引物aspC-FRT-R，克隆位于pKD13质粒上可与对接蛋白突变体DocA-D3和aspC同源臂相连的含Kan抗性的frt位点片段FRT-aspCKan-FRT，核苷酸序列如SEQ ID NO.83所示。PCR反应体系：质粒载体模板2μL，正向引物F 2μL，反向引物R 2μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，ddH2O 19μL。PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃15sec，60℃15sec，72℃30sec，30个循环；补充延伸72℃5min。将目的片段aspC的上游同源臂aspC1、aspC下游同源臂aspC2、对接蛋白突变体片段DocA-D3和FRT位点片段FRT-aspCKan-FRT切胶后回收。
将胶回收获得的片段aspC的上游同源臂aspC1、aspC下游同源臂aspC2、对接蛋白突变体片段DocA-D3和FRT位点片段FRT-aspCKan-FRT以及经限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ酶切后的线性化载体pET-28a(+)进行多片段无缝克隆，从而将四段基因连接在一起。多片段无缝克隆体系：aspC1片段1μL，aspC2片段1μL，DocA-D3 2μL，FRT-aspCKan-FRT片段2μL，线性化克隆载体pET-28a(+)2μL，5×CEⅡBuffer 4μL，ExnaseⅡ2μL，ddH2O 6μL；37℃、30min连接。提取构建的质粒pET-28a(+)-aspC1-DocA-D3-FRT-aspCKan-FRT-aspC2。然后以此为模板，以组装框aspC-F/R为上下游引物进行PCR扩增，纯化回收获得aspC1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-aspC2组装框片段。
同理，获得lysC1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-lysC2组装框片段，asd1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-asd2组装框片段，dapA1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-dapA2组装框片段，dapB1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-dapB2组装框片段，dapE1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-dapE2组装框片段，dapF1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-dapF2组装框片段。
实施例3
通过RED同源重组方法构建多酶组装工程菌
(1)使用常用的CaCl2法制备大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875感受态，将pKD46质粒转入感受态细胞。转化复苏后，挑取单菌落接种于10mL已高温高压灭菌的添加有氨苄抗生素(终浓度为100μL/mL)的LB培养基里，然后30℃、200r/min的培养条件培养过夜，获得E.coli CGMCC 1.12875/pKD46菌株。
(2)30℃条件下培养E.coli CGMCC 1.12875/pKD46菌株至OD600为0.2，终浓度为10mmol/L L-Arabinose诱导，培养至OD600为0.2-0.6。使用CaCl2法制备大肠杆菌E.coliCGMCC 1.12875/pKD46感受态，每管100μL分装，-80℃冻存，减少反复冻融。
(3)将实施例2获得的aspC1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-aspC2组装框片段转入E.coliCGMCC 1.12875/pKD46感受态细胞，具体如下：
取10uL组装框片段加入到E.coli CGMCC 1.12875/pKD46感受态细胞中，使之混合后再放冰上静置5-10min。将加有组装框片段aspC1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-aspC2的E.coliCGMCC 1.12875/pKD46感受态细胞全部吸取到提前在零度冰上预冷的2mm电转杯中，并设置电转仪参数为2500v，25μF，200Ω，电击时间4-5ms，30℃，200r/min，摇床复苏控制时间1h。由于质粒pKD46筛选抗性为Amb抗性，组装框的筛选抗性为kan抗性，涂布LB平板需要含氨苄抗生素终浓度100μL/mL，卡那霉素终浓度50μL/mL，置于30℃恒温培养箱。完成阳性重组菌的筛选。菌落PCR验证后进行组装框基因测序，确认组装框成功转入，测序引物为上端同源臂上游引物与下端同源臂下游引物。
(4)菌株划线纯化后，挑取单菌落接种于10mL已高温高压灭菌的LB培养基中，含Amp 50μL/mL和Kan 50μL/mL。30℃、200r/min的培养条件培养过夜。重新转接，在42℃、200r/min的无抗性LB液体培养基培养12h以上，在含Kan 50μL/mL LB固体培养基上纯化菌体。挑取所要正确菌株的单菌落，接种于10mL已高温高压灭菌的含Kan 50μL/mL LB培养基，然后37℃、200r/min的培养条件培养过夜，完成pKD46质粒的消除。获得只携带组装框的重组菌。
(5)37℃条件下培养只携带组装框的重组菌至OD600＝0.5，使用CaCl2法制备所需感受态细胞。转化pCP20质粒，转化复苏后，挑取单菌落接种于10mL已高温高压灭菌的添加有氨苄抗生素100μL/mL的LB培养基里，30℃、200r/min的培养条件培养过夜，消除重组菌株Kan抗性。验证正确的菌株划线纯化后，挑取单菌落接种于10mL已高温高压灭菌的含氨苄抗生素终浓度100μL/mL的培养基里，然后30℃、200r/min的培养条件培养过夜。重新转接，在42℃、200r/min的无抗性LB液体培养基培养12h以上。抗性验证后所得菌株为aspC组装菌QDE-aspC-DocA-D3。
重复(1)-(5)，依次完成天冬氨酸氨基转移酶基因aspC和天冬氨酸激酶基因lysC与对接蛋白突变体DocA-D3在基因组水平上的组装，得到RED重组工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC。
同理获得QDE-asd-DocA-D3-dapA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB和QDE-dapE-DocA-D3-dapF RED组装工程菌。
实施例4
基于纤维小体脚手架蛋白多酶胞内组装关键酶基因工程菌的构建
依据纤维小体胞内组装基本骨架，9个重复的黏连蛋白Coh组成脚手架蛋白ScaA以载体pET-28a(+)进行表达。将质粒pET-28a(+)-ScaA电转化到工程菌株QDE-aspC-DocA-D3-lysC中，电转仪参数为2500v，25μF，200Ω，电击时间4-5ms。最终得到基于脚手架蛋白的多酶组装工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC::pET-28a(+)-ScaA。
同理将质粒pET-28a(+)-ScaA依次电转化到工程菌株QDE-asd-DocA-D3-dapA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB和QDE-dapE-DocA-D3-dapF中，得到基于脚手架蛋白的多酶组装工程菌QDE-asd-DocA-D3-dapA::pET-28a(+)-ScaA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB::pET-28a(+)-ScaA和QDE-dapE-DocA-D3-dapF::pET-28a(+)-ScaA。
实施例5
将实施例4构建的多酶组装工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC::pET-28a(+)-ScaA、QDE-asd-DocA-D3-dapA::pET-28a(+)-ScaA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB::pET-28a(+)-ScaA或QDE-dapE-DocA-D3-dapF::pET-28a(+)-ScaA进行发酵，具体如下：
分别将工程菌将细菌接种到50mL种子培养基(10.0g/L蛋白胨、10.0g/L酵母浸粉、5.0g/L NaCl、0.5g/L丙酮酸钠)中，在37℃、220r/min条件下，培养10h作为种子液。按照接种量15％接种到发酵培养基：20.0g/L葡萄糖、0.5-0.7g/L玉米浆、0.02g/L糖蜜、6.0×10- 4g/L H3PO4、11.0g/L(NH)2SO4、2.0g/L MgSO4、0.5g/L KCl、0.04g/L FeSO4、0.04g/L MnSO4、0.01g/L ZnSO4、0.007g/L CuSO4；IPTG 26℃诱导8h，发酵条件为：37℃，pH值6.7，300r/min；葡萄糖浓度＝2.0％，溶解氧＝20％-35％，25％的氨水调节pH。蛋白表达后发酵36h，每4h取样一次，用紫外分光光度计测定稀释后样品在600nm处的吸光度确定菌体浓度变化。用生物传感器测定葡萄糖和L-赖氨酸含量。
发酵36h多酶组装工程菌株QDE-aspC-DocA-D3-lysC::pET-28a(+)-ScaA的L-赖氨酸浓度达到67.6g/L，比出发菌株E.coli CGMCC 1.12875提高46.9％，比未组装对照菌株QDE::pET-28a(+)-aspC/lysC高39.1％，发酵结果如图1所示。
发酵36h多酶组装工程菌株QDE-asd-DocA-D3-dapA::pET-28a(+)-ScaA的L-赖氨酸浓度达到51.3g/L，比未组装对照菌株QDE::pET-28a(+)-asd/dapA高1.6％，发酵结果如图2所示。
发酵36h多酶组装工程菌株QDE-dapA-DocA-D3-dapB::pET-28a(+)-ScaA的L-赖氨酸浓度达到50.5g/L，比未组装对照菌株QDE::pET-28a(+)-dapA/dapB高18.5％，发酵结果如图3所示。
发酵36h多酶组装工程菌株QDE-dapE-DocA-D3-dapF::pET-28a(+)-ScaA的L-赖氨酸浓度达到46.7g/L，比未组装对照菌株QDE::pET-28a(+)-dapE/dapF高4.7％，发酵结果如图4所示。
本发明涉及一种基于纤维小体脚手架蛋白胞内多酶组装构建产L-赖氨酸工程菌的方法及应用，本发明提供的工程菌能够有效提高L-赖氨酸的产量。基于脚手架蛋白多酶组装aspC和lysC两种关键酶基因的效果最好，L-赖氨酸产量优势明显。工程菌株QDE-aspC-DocA-D3-lysC::pET-28a(+)-ScaA的L-赖氨酸浓度达到67.6g/L，比出发菌株E.coli CGMCC1.12875提高46.9％，比未组装对照菌株QDE::pET-28a(+)-aspC/lysC高39.1％；说明该纤维小体元件DocA-D3与多种酶基因能够在基因组上表达，与脚手架蛋白ScaA发生胞内相互作用，完成整个纤维小体关键酶的组装，并且可以提高关键酶的催化效率，是本领域技术人员预料不到的。
Claims (9)
1.一种基于纤维小体脚手架蛋白胞内多酶组装构建产L-赖氨酸工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取来源于大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875酶基因组合与对接蛋白DocA-D3，依据RED同源重组进行基因组上的双片段同源组装，出发菌株为大肠杆菌E.coli CGMCC1.12875，得到RED重组工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC、QDE-asd-DocA-D3-dapA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB或QDE-dapE-DocA-D3-dapF；
(2)脚手架蛋白ScaA利用质粒载体pET-28a(+)构建质粒pET-28a(+)-ScaA；
(3)将步骤(2)的质粒pET-28a(+)-ScaA转化入步骤(1)的工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC、QDE-asd-DocA-D3-dapA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB或QDE-dapE-DocA-D3-dapF中，筛选获得工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC::pET-28a(+)-ScaA、QDE-asd-DocA-D3-dapA::pET-28a(+)-ScaA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB::pET-28a(+)-ScaA或QDE-dapE-DocA-D3-dapF::pET-28a(+)-ScaA；
所述酶基因组合包括：aspC和lysC组合、asd和dapA组合、dapA和dapB组合或dapE和dapF组合；
对接蛋白DocA-D3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
脚手架蛋白ScaA核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
酶基因aspC核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
酶基因lysC核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
酶基因asd核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
酶基因dapA核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
酶基因dapB核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
酶基因dapE核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
酶基因dapF核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC、QDE-asd-DocA-D3-dapA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB或QDE-dapE-DocA-D3-dapF的构建，具体如下：
①多片段无缝克隆组装框的构建
使用EcoRI和NotI双酶切制备线性化pET-28a(+)载体；
以大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875基因组为模板，设计组装基因的上下游同源臂引物X1-F/R和X2-F/R；再通过PCR扩增得到目的片段X1和X2；与组装基因相连的DocA-D3基因的上下游引物X-D3-F/R，通过PCR扩增获得DocA-D3片段；以质粒pKD13为模板，上下游引物X-FRT-F/R，PCR扩增得到与组装基因同源臂重叠的frt位点片段FRT-XKan-FRT；组装框的上下游引物X组装框F/R，扩增验证X1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-X2组装框片段的获得；
使用多片段无缝克隆方法将aspC1片段，aspC2片段，DocA-D3片段，FRT-aspCKan-FRT片段，线性化克隆载体pET-28a(+)重组连接，提取构建的质粒pET-28a(+)-aspC1-DocA-D3-FRT-aspCKan-FRT-aspC2；然后以此为模板，以组装框aspC-F/R为上下游引物进行PCR扩增，纯化回收获得aspC1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-aspC2组装框片段；
同理，获得lysC1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-lysC2组装框片段，asd1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-asd2组装框片段，dapA1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-dapA2组装框片段，dapB1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-dapB2组装框片段，dapE1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-dapE2组装框片段，dapF1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-dapF2组装框片段；
扩增引物核苷酸序列如下：
aspC1-F：如SEQ ID NO.13所示；aspC1-R：如SEQ ID NO.14所示；
aspC-D3-F：如SEQ ID NO.15所示；aspC-D3-R：如SEQ ID NO.16所示；
aspC-FRT-F：如SEQ ID NO.17所示；aspC-FRT-R：如SEQ ID NO.18所示；aspC2-F：如SEQID NO.19所示；aspC2-R：如SEQ ID NO.20所示；
lysC1-F：如SEQ ID NO.21所示；lysC1-R：如SEQ ID NO.22所示；
lysC-D3-F：如SEQ ID NO.23所示；lysC-D3-R：如SEQ ID NO.24所示；
lysC-FRT-F：如SEQ ID NO.25所示；lysC-FRT-R：如SEQ ID NO.26所示；lysC2-F：如SEQID NO.27所示；lysC2-R：如SEQ ID NO.28所示；
asd1-F：如SEQ ID NO.29所示；asd1-R：如SEQ ID NO.30所示；
asd-D3-F：如SEQ ID NO.31所示；asd-D3-R：如SEQ ID NO.32所示；
asd-FRT-F：如SEQ ID NO.33所示；asd-FRT-R：如SEQ ID NO.34所示；
asd2-F：如SEQ ID NO.35所示；asd2-R：如SEQ ID NO.36所示；
dapA1-F：如SEQ ID NO.37所示；dapA1-R：如SEQ ID NO.38所示；
dapA-D3-F：如SEQ ID NO.39所示；dapA-D3-R：如SEQ ID NO.40所示；
dapA-FRT-F：如SEQ ID NO.41所示；dapA-FRT-R：如SEQ ID NO.42所示；dapA2-F：如SEQID NO.43所示；dapA2-R：如SEQ ID NO.44所示；
dapB1-F：如SEQ ID NO.45所示；dapB1-R：如SEQ ID NO.46所示；
dapB-D3-F：如SEQ ID NO.47所示；dapB-D3-R：如SEQ ID NO.48所示；
dapB-FRT-F：如SEQ ID NO.49所示；dapB-FRT-R：如SEQ ID NO.50所示；dapB2-F：如SEQID NO.51所示；dapB2-R：如SEQ ID NO.52所示；
dapE1-F：如SEQ ID NO.53所示；dapE1-R：如SEQ ID NO.54所示；
dapE-D3-F：如SEQ ID NO.55所示；dapE-D3-R：如SEQ ID NO.56所示；
dapE-FRT-F：如SEQ ID NO.57所示；dapE-FRT-R：如SEQ ID NO.58所示；dapE2-F：如SEQID NO.59所示；dapE2-R：如SEQ ID NO.60所示；
dapF1-F：如SEQ ID NO.61所示；dapF1-R：如SEQ ID NO.62所示；
dapF-D3-F：如SEQ ID NO.63所示；dapF-D3-R：如SEQ ID NO.64所示；
dapF-FRT-F：如SEQ ID NO.65所示；dapF-FRT-R：如SEQ ID NO.66所示；dapF2-F：如SEQID NO.67所示；dapF2-R：如SEQ ID NO.68所示；
组装框aspC-F：如SEQ ID NO.69所示；组装框aspC-R：如SEQ ID NO.70所示；
组装框lysC-F：如SEQ ID NO.71所示；组装框lysC-R：如SEQ ID NO.72所示；组装框asd-F：如SEQ ID NO.73所示；组装框asd-R：如SEQ ID NO.74所示；
组装框dapA-F：如SEQ ID NO.75所示；组装框dapA-R：如SEQ ID NO.76所示；
组装框dapB-F：如SEQ ID NO.77所示；组装框dapB-R：如SEQ ID NO.78所示；
组装框dapE-F：如SEQ ID NO.79所示；组装框dapE-R：如SEQ ID NO.80所示；
组装框dapF-F：如SEQ ID NO.81所示；组装框dapF-R：如SEQ ID NO.82所示；
②RED同源重组工程菌的构建
(a)制备大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875感受态细胞；
(b)将pKD46质粒转化入大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875感受态细胞，获得大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875/pKD46；
(c)制备大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875/pKD46感受态，将aspC1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-aspC2组装框片段转入大肠杆菌E.coli CGMCC 1.12875/pKD46感受态细胞，42℃培养消除pKD46质粒，获得携带组装框的重组菌；
(d)制备携带组装框的重组菌感受态细胞，将pCP20质粒转化入携带组装框的重组菌感受态细胞，验证培养消除重组菌Kan抗性，42℃培养消除pCP20质粒，获得aspC组装菌QDE-aspC-DocA-D3；
同理，重复(a)-(d)步骤组装酶基因lysC，依次完成aspC和lysC与对接蛋白DocA-D3在基因组水平上的组装，筛选验证得到RED重组工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC；
同理，重复①-②步骤，制备得到RED重组工程菌QDE-asd-DocA-D3-dapA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB和QDE-dapE-DocA-D3-dapF；
③将质粒pET-28a(+)-ScaA转化入RED重组工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC、QDE-asd-DocA-D3-dapA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB或QDE-dapE-DocA-D3-dapF中，筛选获得工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC::pET-28a(+)-ScaA、QDE-asd-DocA-D3-dapA::pET-28a(+)-ScaA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB::pET-28a(+)-ScaA或QDE-dapE-DocA-D3-dapF::pET-28a(+)-ScaA。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤①中，PCR反应体系：
质粒载体模板2μL，正向引物F 2μL，反向引物R 2μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，ddH2O 19μL。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤①中，PCR反应条件：
95℃预变性3min；95℃15sec，60℃15sec，72℃30sec，30个循环；补充延伸72℃5min。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤①中，表达载体pET-28a(+)的双酶切体系：
EcoRI酶2.5μL，NotI酶2.5μL，10×FastDigest 7.5μL，质粒pET-28a(+)25μL，ddH2O12.5μL。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤①中，构建aspC组装框时多片段无缝克隆体系：
aspC1片段1μL，aspC2片段1μL，DocA-D3 2μL，FRT-aspCKan-FRT片段2μL，线性化克隆载体pET-28a(+)2μL，5×CEⅡBuffer 4μL，ExnaseⅡ2μL，ddH2O 6μL；37℃、30min连接，获得aspC1-DocA-D3-FRT-Kan-FRT-aspC2组装框片段。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤②中，使用CaCl2法制备感受态细胞。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤③中，质粒pET-28a(+)-ScaA转化入RED重组工程菌，电转仪参数为2500v，25μF，200Ω，电击时间4-5ms。
9.权利要求1-8任一项所述方法构建的工程菌QDE-aspC-DocA-D3-lysC::pET-28a(+)-ScaA、QDE-asd-DocA-D3-dapA::pET-28a(+)-ScaA、QDE-dapA-DocA-D3-dapB::pET-28a(+)-ScaA或QDE-dapE-DocA-D3-dapF::pET-28a(+)-ScaA在生产L-赖氨酸中的应用。
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