CN113777209B - 尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用 - Google Patents

尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113777209B
CN113777209B CN202111310594.2A CN202111310594A CN113777209B CN 113777209 B CN113777209 B CN 113777209B CN 202111310594 A CN202111310594 A CN 202111310594A CN 113777209 B CN113777209 B CN 113777209B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ohdg
detection
pahs
urine
exposure
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111310594.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113777209A (zh
Inventor
郑晶
梅航
唐斌
汤送雄
秦瑞欣
蔡凤珊
于云江
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Institute of Environmental Science of Ministry of Ecology and Environment
Original Assignee
South China Institute of Environmental Science of Ministry of Ecology and Environment
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Institute of Environmental Science of Ministry of Ecology and Environment filed Critical South China Institute of Environmental Science of Ministry of Ecology and Environment
Priority to CN202111310594.2A priority Critical patent/CN113777209B/zh
Publication of CN113777209A publication Critical patent/CN113777209A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113777209B publication Critical patent/CN113777209B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明公开了一种尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测的方法及应用，该方法选取同一份尿液样品中可能存在相关性的OH‑PAHs、mVOCs和8‑OHdG作为目标检测物，进行同步提取、检测、分析，其包括如下步骤：样品的预处理；样品的富集与分离；样品的浓缩与检测：采用HPLC‑MS/MS分别进行OH‑PAHs、mVOCs及8‑OHdG的上机检测，对应分析得到尿液中的多种目标检测物含量数据，并分析出三者之间的相关性。本发明将分析目标物含量数据之间的关系，应用于评估两类污染物的人体暴露特征。本发明通过优化方案，使多种目标检测物能够进行同步检测和分析，简化了检测步骤、降低了检测成本，扩展了健康暴露风险评估结果的应用范围。

Description

尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用
技术领域
本发明属于污染物检测、健康暴露风险评估及医疗技术领域，具体涉及一种尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用。
背景技术
多环芳烃（PAHs）是一类由煤炭、石油、烟草等有机质不完全燃烧产生的半挥发性有机污染物（SVOCs）。研究表明，PAHs暴露可能引起消化道和呼吸道刺激效应，长期暴露还会造成人体循环***、神经***损伤，产生致畸、致癌和致突变等危害。挥发性有机化合物（VOCs）是大气中普遍存在的污染物，其来源十分广泛，工业生产、机动车尾气、香烟烟雾、高温烹饪食物等均会产生VOCs。长期暴露某些VOCs可能会增加罹患癌症、出生缺陷和神经认知障碍等风险。PAHs、VOCs暴露水平通常采用外暴露法和内暴露法两种方式加以评估：1）外暴露法通过测定环境中PAHs和VOCs原型化合物；2）内暴露法通过测定人体血液中的PAHs和VOCs或测定尿液中的PAHs和VOCs代谢物。当前，针对PAHs和VOCs等环境化学污染物的人体暴露，主要通过外暴露法，分析其在空气、水、土壤等环境样品的浓度，结合暴露模型间接加以评估。该方法采样简单，易于开展，目前已发展较为成熟。然而，人体暴露PAHs和VOCs的途径复杂多样，且环境样品的检测结果无法外推到人体内实际暴露剂量，难以准确反映人体的内暴露负荷水平。其次，血液PAHs和VOCs检测亦可于用评估其人体内暴露特征。其不足之处在于，血液采集属于侵入性采样，对采样过程的要求较高、难度高；此外，血液中VOCs的生物半衰期短，且挥发性强、目标物容易损失，难以准确检测。相比于测量血液VOCs，尿液中VOCs代谢物（mVOCs）因其较长的生物半衰期和不易挥发性，具有更加稳定的优势，并且尿液样本因无创采样过程，更加方便获取。
内暴露通常通过评估生物体尤其是人体内暴露标志物的水平来反映。环境中的PAHs主要通过空气吸入、水和食物摄入等途径进入人体。随后，在各种酶的作用下，PAHs代谢为羟基化代谢物（OH-PAHs），进一步与葡萄糖醛酸或硫酸盐结合，经尿液排出体外。因此，尿液中的OH-PAHs浓度可反映人体PAHs暴露情况，已广泛用于人体PAHs内暴露水平的评估。VOCs进入人体后，可水解成生成醇类（如氯酚），经尿液排出体外；醇也可进一步被氧化成羧酸（如反，反-粘康酸）后排出体外；此外，VOCs的部分主要初级代谢物也可通过巯基代谢途径形成N-乙酰化巯基酸类化合物经尿液消除。因此，尿液中的VOCs代谢产物，也能够有效反映人体VOCs的实际暴露特征。此外，有关研究表明，PAHs和VOCs暴露还可诱导氧化应激效应，尿液中8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-OHdG）作为评估氧化应激和人类致癌物暴露导致的DNA氧化损伤生物标志物，现已被广泛地应用在实验研究和临床诊断中，参与氧化应激与病变的指标检测与机理分析，对心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病（帕金森病，阿尔茨海默氏症）、以及癌症的临床诊疗都具有极大的应用价值。目前市场上主流的8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是使用专门定量试剂盒进行的检测。
由于PAHs 在体内的剂量受多种因素如个体差异、生活***，尤其是致癌性PAHs 如苯并芘在体内的水平，因此越来越多的学者用多种PAHs 代谢物的共同检测来综合反映PAHs 的暴露水平。目前可作为人体内PAHs 暴露生物标志物主要有：尿中PAHs 代谢物、尿中硫醚、尿中致突变物、PAH-DNA 加合物、PAH-蛋白质加合物。但是，目前大部分检测方法是将单羟基PAHs 的葡糖苷酸和硫酸结合产物用β-葡糖苷酸酶或硫酸酯酶水解为游离型OH-PAHs，再进行萃取、浓缩富集等过程。目前尚缺少对OH-PAHs、mVOCs等多种环境化学污染物同步测定的分析方法。如中国发明专利申请CN201610911596.X公开了一种尿液羟基多环芳烃的快速检测方法，包括如下步骤：将尿样离心并对上清液进行酶解处理使OH-PAHs游离，得到预处理的尿样；在预处理的尿样中加入混合均匀的分散剂丙酮和萃取剂正十一醇，混匀后分层，正十一醇层悬浮于表面；将样品冷却至正十一醇层凝固，取出凝固的正十一醇层溶解于有机溶剂中，进行色谱分析。中国发明申请号 202010728067.2公开了一种在线测定尿液中羟基多环芳烃的固相萃取-液相色谱三重四级杆质谱同位素稀释法，该方法是在尿液中加入同位素内标后再加入β-葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶，恒温摇床上进行酶解，酶解后加入有机溶剂沉淀蛋白，冷冻离心，转移离心后的上清液，通过自动阀切换进行在线固相萃取，然后经液相色谱三重四级杆质谱进行定量测定。经过数据处理和定量计算，得到尿液中羟基多环芳烃的含量。中国发明申请号：CN201710918513.4公开了一种利用二氯甲烷诱导质子化反应质谱进行泌尿***疾病相关的尿液特异性VOCs筛查技术，是一种新的液相VOCs检测手段，可直接从人体尿液中快速筛选出与泌尿***疾病相关的特异性VOCs。首先调节二氯甲烷进样***，保证电离器内压力稳定在200Pa；再用一次性微量进样器提取50微升病变尿液并快速注入热导管中，随后载气将气化VOCs带入电离器，在二氯甲烷质子化和真空紫外光作用下，随即被质子化电离；离子经迁移腔进入V型质谱被检测。最后将检测结果与尿液中16种VOCs正常值对比分析，从而确定泌尿***疾病患者尿液中VOCs的浓度范围。该发明在降低膀胱癌和***癌致死率方面具有重要意义。此外，中国专利文献CN103175920A中提供了一种尿液中8种OH-PAHs的液液萃取-气相色谱-质谱联用的检测方法；中国专利文件CN108872415A中也建立了一种固相萃取-液相色谱-串联质谱联用，同时测定人体尿液中10种OH-PAHs的方法；专利CN112198239A中公开了一种结合超高效液相色谱-串联质谱联用（UPLC-MS/MS）技术快速检测尿液中8-OHdG的方法。在这些现有技术采用的气相色谱-质谱联用方法中，样品预处理过程需要对目标化合物衍生化，检测过程繁琐、复杂；更为关键的是，由于这三种方法仅能针对单一的代谢物或者目标检测物进行检测，如果需要对多种代谢物与目标检测物进行检测，则需要多次进行样品预处理及检测。
因此，目前已公开的关于PAHs、VOCs人体生物监测和内暴露水平检测和分析的方法，由于其预处理样品中的可检测的代谢物种类较少或目标检测物单一的不足，或者检测方法、仪器等配合的不足，均是分别对于PAHs、VOCs及8-OHdG中单一种类的标志物进行检测，目前均不能在一次检测过程中完成对PAHs、VOCs及8-OHdG多种检测物进行同步检测，并且获得准确和稳定的检测结果；同时，分三次检测得到的数据，受到样品变化及多种检测条件变化等原因的影响、误差较大，难以用于对PAHs、VOCs及8-OHdG之间的相关性进行准确分析。
现有技术中，分别通过多次对样品进行分析才能分别获得对PAHs、VOCs及8-OHdG的定量检测数据，其处理过程用时长、溶剂量多、处理成本和分析时间多，无法进行流行病学上大量样本的检测和分析，同时也不利于绿色环保，不利于保护检测、分析操作人员的身体健康。
发明内容
针对现有技术的上述不足，特别是针对采用现有的检测方法进行OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG检测时，所采用的样品预处理、检测仪器及分析方法均不相同，需要分三次才能完成检测的问题，提供一种新的尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法，通过改进样品预处理、检测和分析方案，将此三种目标检测物纳入对一个样本的一次检测过程中完成，而且方便、快捷、节省溶剂；同时，采用对一个样本的一次检测同步得到的三种目标检测物数据，由于其样品及检测条件均没有变化，得到的数据不存在误差，可进一步进行PAHs、VOCs及8-OHdG之间的相关性进行准确分析。
本发明还进一步针对目前的临床诊断所需的8-OHdG数据，需要单独使用试剂盒检测或者单独制备样品进行检测的不足，将其纳入与PAHs、VOCs同一个样本的同一次检测过程中完成，从而实现通过一份样本，得到三种目标检测物的检测数据，并构建数学模型分析三种目标检测物检测数据相互之间的关系，研究出群体8-OHdG 与PAHs、VOCs暴露之间的关系，并进一步将其一起用于揭示8-OHdG的升高贡献值、主要影响因素等数据，为相关个体人员健康暴露风险分析与预测，疾病的临床诊断、治疗、流行病学分析与预防提供支持。
本发明为解决上述问题而提供的技术方案为：
一种尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法，其特征在于，选取同一份尿液样品中存在相关性的多种单羟基多环芳烃OH-PAHs、挥发性有机物代谢物mVOCs和暴露效应标志物8-羟基-2-脱氧鸟苷8-OHdG作为目标检测物，进行同步提取、检测、分析，其包括如下步骤：
S1：样品的预处理：将采集的个体尿液样品分别4℃解冻后混匀，取1 mL于15-mLPP离心管中，并向其中加入已知量的内标指示物；随后，加入1 mL的 1 mol/L的pH = 4.5乙酸钠-乙酸缓冲液调节至pH = 5左右，再加入10 μL、30 U/mL的β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶；涡旋混匀，37℃水浴酶解6 h；冷却至室温后，加入50 μL 1%甲酸调节pH，涡旋5 s混匀；
S2：样品的富集与分离：将上述酶解后的溶液转移至依次用6 mL 二氯甲烷、6 mL甲醇及12 mL 0.1%甲酸水溶液活化后的500 mg、6 mL Poly-Sery HLB Pro固相萃取小柱上，进行富集；然后，先使用6 mL体积比甲酸2：甲醇49：乙腈49的溶剂洗脱，再使用8 mL体积比甲醇1：二氯甲烷1的溶剂进行洗脱，将流出的溶液接取至15-mL的玻璃离心管中，得到含两类代谢物OH-PAHs、mVOCs及暴露效应标志物8-OHdG的洗脱液；
S3：样品的浓缩与检测：将上述含两类代谢物及暴露效应标志物的洗脱液氮吹浓缩近干，用180 μL甲醇复溶，加入20 μL 1ppm的回标指示物、即定溶至200 μL，在-20 oC冰箱静置一夜，取上清液，在12000 r/min下离心5 min，再取上清液；采用HPLC-MS/MS分别进行OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG的上机检测，对应分析得到尿液中的目标检测物OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG的含量数据；
S4：重复步骤S1- S3，分别完成同批次多个个体尿液样品中OH-PAHs 与mVOCs、8-OHdG的检测，得到该批次多个尿液的检测数据，然后汇总、分类，进行群体OH-PAHs的健康暴露特征分析：以暴露与非暴露作为自变量，以年龄、性别、岗位、作业时间的因子分为连续变量和分类变量，其中，性别、岗位属于分类变量，年龄、作业时间属于连续变量，OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG含量数据则作为因变量；采用SPSS分析软件，把分类变量与OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG检测数据进行差异性分析，把连续变量与OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG检测数据进行相关性分析，得出三种目标检测物之间的相关性；
S5：以三种目标检测物的检测数据及相互之间的相关性为基础，构建单羟基多环芳烃OH-PAHs个体损伤预测与评估分析的数学模型，将单个个体样本的目标检测物的检测数据代入该数学模型，计算得出导致个体DNA损伤标志物8-OHdG升高的贡献值，以进一步应用于对单个个体进行OH-PAHs健康暴露风险的预测与评估。
前述尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法的应用，其特征在于，将检测得到的尿液样本中的目标物OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG的含量数据，分析相互之间的关系，一起应用于评估环境中普遍存在的两类污染物在人群中的暴露特征或临床诊断，其具体包括如下步骤：
（1）采样对象信息收集：收集采样对象的基础信息，包括年龄、性别、岗位、作业时间；
（2）数据分类：把年龄、性别、岗位、作业时间的因子分为连续变量和分类变量，其中，性别、岗位属于分类变量，年龄、作业时间属于连续变量，OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG含量数据则作为因变量，并相应归类；
（3）关联性分析：采用SPSS分析软件，把分类变量与OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG检测数据进行差异性分析；把连续变量与OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG检测数据进行相关性分析，得到P值；
（4）结果判定：当P＜0.05时，表示暴露特征显著；P＜0.01时，表示暴露特征非常显著；P＞0.05时，表示暴露特征无差异。
所述的同步检测方法的应用，其特征在于，将检测得到的同批次多个个体尿液样本中的目标物OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG的含量数据，分析相互之间的关系，一起应用于评估同批次人群的群体健康暴露风险或流行病学分析，其具体包括如下步骤：
（1）数据获取：获取多个个体人员尿液样本中的多种污染物羟基多环芳烃OH-PAHs、多种挥发性有机物代谢产物mVOCs及暴露效应标志物8-OHdG数据，然后汇总，统一单位，mg/L；
（2）统计分析：以不少于20种污染物及代谢产物作为自变量，8-OHdG作为因变量，则计算导致因变量8-OHdG浓度升高的贡献值y的数学模型为：
y=aX1+bX2+…+nXn （公式1）
式中，a、b…n为系数，X1、X2…Xn为自变量；
再使用logistics回归分析，得出P值；
（3）结果判定：
当P＜0.05时，存在显著性，表示自变量与因变量存在关系，该变量的权重数纳入公式1中计算，当P＞0.05时，无显著性，表示自变量与因变量无关系，不纳入计算，由此可。
所述的同步检测方法的应用，其特征在于，将检测得到的尿液样本中的目标物OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG的含量数据，及进一步分析相互之间的关系，一起应用于对个体人员的个体损伤影响水平进行分析或临床诊断，其具体包括如下步骤：
（1）数据获取：获取待检个体人员尿液样本中多种羟基多环芳烃OH-PAHs、多种挥发性有机物代谢产物mVOCs及暴露效应标志物8-OHdG数据，统一单位，mg/L；
（2）影响分析：将该样本中各目标检测物的检测数据，分别代入所述的公式1中，计算得到导致该个体DNA损伤标志物8-OHdG升高的贡献值y，以进一步判断影响因素和影响水平。
本发明提供的尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法的应用，与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明提供的尿液中多种挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法，克服了现有检测技术的诸多不足，特别是针对采用现有的检测方法，所采用的样品预处理、检测仪器及分析方法均不相同，需要分三次才能完成对PAHs、VOCs及8-OHdG检测，造成检测耗时长、成本高、数据误差大等问题，并且针对具体应用的需求，选取同一份尿液样品中存在相关性的多种单羟基多环芳烃OH-PAHs、挥发性有机物代谢物mVOCs和暴露效应标志物8-羟基-2-脱氧鸟苷8-OHdG作为目标检测物，通过改进样品预处理、检测和分析方案，将此三种目标检测物纳入对一个样本的一次检测过程中完成，进行同步提取、检测、分析，而且方便、快捷、节省溶剂，而且，采用对一个样本的一次检测同步得到的三种目标检测物数据，由于其样品及检测条件均没有变化，得到的数据不存在误差，可进一步进行PAHs、VOCs及8-OHdG之间的相关性进行准确分析。
2、本发明提供的尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法，通过同步改进目标检测物、样品预处理、检测及分析方案，能够一次性同步提取尿液中12种羟基多环芳烃（OH-PAHs）、22种挥发性有机物代谢物（mVOCs）和暴露效应标志物8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-OHdG），并且能够采用同一液相色谱柱及HPLC-MS/MS分别实现两类代谢物及8-OHGD的分离、检测，大幅提高了样品前处理及分析检测的效率。
3、本发明提供的尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法，通过使用同一固相萃取小柱，不仅实现极性差异明显的两类目标物的同步富集和分离，同时，将污染物暴露的效应生物标志物8-OHdG纳入分析范畴，省时、便捷，并使得所有目标化合物最终回收率介于80~120%之间，大大提高了定量分析的准确性。本发明在样品的目标物同步富集、分离步骤中采用Poly-Sery HLB Pro商品小柱，大大节省溶剂的同时，馏分的色谱图同样能保持较高的分离效果。
4、本发明提供的尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法，对同一样品中的OH-PAHs、VOCs代谢产物（mVOCs）及8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-OHdG）进行同步处理、分析，可降低因多次进行前处理而产生的误差，提高了检测结果及评估结果的准确性。
5、本发明提供的同步检测方法的应用，进一步针对目前的临床诊断所需的8-OHdG数据，需要单独使用试剂盒检测或者单独制备样品进行检测的不足，将其纳入与PAHs、VOCs同一个样本的同一次检测过程中完成，从而实现通过一份样本，得到三种目标检测物的检测数据，并进一步将三种目标检测物的检测数据及其相互之间的相关性，一起应用于研究群体8-OHdG 与PAHs、VOCs暴露之间的关系，再更进一步的用于揭示8-OHdG的升高贡献值、主要影响因素等数据，为相关个体人员健康暴露风险分析与预测，疾病的临床诊断、治疗、流行病学分析与预防提供支持。
6、本发明提供的同步检测方法的应用，通过对同一样品中的多种挥发性污染物内暴露标志物和人体损伤标志物进行同步监测，能够更准确判断和评估人体暴露水平和损伤情况。
7、本发明提供的同步检测方法的应用，通过优化目标检测物的特别选择及检测方案设计获得多种无污染或暴露标志物数据，克服了目前对于人群群体及（个体）人体的环境污染物PAHs健康暴露风险采用单一污染物组分进行评估，导致评估结果的准确性不强的不足，采用对尿液中多种挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测，获得了同一个样本同步反映的多种污染物及暴露标志物数据及其相互之间的相关性，将其应用于PAHs和mVOCs的暴露情况评估，可以大幅提高评估结果的准确性。
8、本发明提供的同步检测方法的应用，还进一步针对目前的临床诊断所需的8-OHdG数据，需要单独使用试剂盒检测或者单独制备样品进行检测的不足，将其纳入与PAHs、VOCs同一个样本的同一次检测过程中完成，从而实现通过一份样本，得到三种目标检测物的检测数据，并进一步将三种目标检测物的检测数据及其相互之间的相关性（差异性、相关性），一起应用于研究8-OHdG 与PAHs、VOCs暴露之间的关系，以揭示8-OHdG的来源，为相关疾病的临床诊断、治疗、流行病学分析与预防提供支持。
9、本发明提供的尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用，是基于尿液中PAHs和VOCs代谢产物以及损伤标志物的特点，不仅将尿液中的PAHs代谢物（OH-PAHs）和VOCs代谢物（mVOCs）同时纳入检测范围，也将8-OHdG作为该污染物暴露的效应标志物（多种污染物参与氧化应激与病变的指标）进行同步分析、检测，对于评估环境中普遍存在的两类污染物在人群中的暴露特征及其对人体健康产生的影响具有重要意义。
10、本发明提供的尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用，其中的效应标志物8-OHdG的检测方法、数据及相关性分析模型（差异性、相关性），还可以应用于对单个个体的临床筛查、诊断结直肠癌等疾病，并可以进一步应用于该疾病的诱发因素分析，对因污染物诱发的特定疾病（特别是职业病）的人群及个体诱发影响因素等进行流行病学分析，因此具有广阔的医学应用前景，扩展了该检测数据及健康暴露风险评估结果的应用范围。
附图说明
图1是本发明实施例中尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法的流程示意图。
图2是本发明实施例中HPLC-MS/MS分析OH-PAHs的色谱图。
图3是本发明实施例中HPLC-MS/MS分析mVOCs及8-OHdG的色谱图。
图4是本发明实施例中尿液基质低浓度（LL）、中浓度（ML）和高浓度（HL）加标样品中目标化合物的内标回收率柱状图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行详细说明：
实施例1：
请参见附图1-4，本实施例提供的尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用，是对群体尿液样本的检测方法及应用，具体以华南地区某石化企业年龄介于20至50岁之间的38名男性职业工人（21名办公室人员、17名车间工人）的尿液样品为例，对本发明尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用进行具体描述。
本实施例提供的尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法及应用，先采集38份样品，再按照顺序依次进行分别检测，并选取同一份（每一份）尿液样品中存在相关性的多种单羟基多环芳烃OH-PAHs、挥发性有机物代谢物mVOCs和暴露效应标志物8-羟基-2-脱氧鸟苷8-OHdG作为目标检测物，进行同步提取、检测、分析，其包括如下步骤：
（1）采样对象基本信息获取
收集38名职业工人的暴露影响因素，包括性别、年龄、岗位、入职时间等基本信息。
（2）样品采集
收集38名职工的中段晨尿，用预先处理过的70 mL聚乙烯尿杯于-80℃冰箱冷冻保存，并于12 小时内测定尿比重。
（3）样品的预处理（即步骤S1：）：参见附图1，将分别采集的38份个体尿液样品，每次处理一份：将采集的个体尿液样品分别4℃解冻后混匀，取1 mL于15 mL PP离心管中，并向其中加入已知量的内标指示物；随后，加入1 mL的 1 mol/L的pH = 4.5乙酸钠-乙酸缓冲液调节至pH = 5左右，再加入10 μL、30 U/mL的β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶；涡旋混匀，37℃水浴酶解6 h；冷却至室温后，加入50 μL 1%甲酸调节pH，涡旋5 s混匀；所述内标指示物包括：20 ng 2-OH-Nap-d7, 20 ng 2-OH-Flu-d9, 20 ng 3-OH-Phe-13C6, 20 ng AAMA-d4, 20 ng PGA-d5, 20 ng MA-d5,20 ng BPMA-d7, 20 ng PMA-d5, 20 ng TCVMA-d3, 20ng 8-OHdG-13C,15N2。其中，将1 mL 的1 mol/L、pH = 4.5的乙酸钠-乙酸缓冲液用于调节尿液pH的步骤，是为后续加入的β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶创造最佳pH条件，在37℃下水浴酶解，使β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶发挥最佳酶解效果，充分释放尿液中的结合态代谢物及8-OHdG；其中的冷却至室温后，加入50 μL 1%甲酸调节固相萃取前的pH，是有利于目标代谢物在HLB Pro固相萃取小柱上保留，获得更高的回收率。
（4）样品的富集与分离（即步骤S2）：将上述酶解后的溶液转移至依次用6 mL 二氯甲烷、6 mL甲醇及12 mL 0.1%甲酸水溶液活化后的500 mg、6 mL Poly-Sery HLB Pro固相萃取小柱上，进行富集；然后，先使用6 mL体积比甲酸2：甲醇49：乙腈49的溶剂洗脱，再使用8 mL体积比甲醇1：二氯甲烷1的溶剂进行洗脱，将流出的溶液接取至15-mL的玻璃离心管中，得到含两类代谢物OH-PAHs、mVOCs及暴露效应标志物8-OHdG的洗脱液；所述固相萃取小柱采用Poly-Sery HLB Pro小柱，规格为500 mg，6 ml，通过该设置对较宽范围性质的非极性和极性目标物均有较好的保留，以满足富集、分离和定量研究的条件，同时减少溶剂的使用；
（5）样品的浓缩与检测（即步骤S3）：将上述含两类代谢物及暴露效应标志物的洗脱液氮吹浓缩近干，用180 μL甲醇复溶，加入20 μL 1ppm的回标指示物、即定溶至200 μL，在-20 oC冰箱静置一夜，取上清液，在12000 r/min下离心5 min，再取上清液；采用HPLC-MS/MS分别进行OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG的上机检测，对应分析得到尿液中的目标检测物OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG的含量数据；其中的回标指示物为：20 ng 1-OH-Pyr-d9、20 ngHA-d5；其采用的HPLC-MS/MS是高效液相色谱与质谱的联用，以液相色谱作为分离***，质谱为检测***；其中，HPLC是初分化合物，一级MS是对HPLC谱图中的各峰进行质谱分析，二级MS是对一级MS中的峰进行再一个解离分析以确定一级MS的峰的结构。
（6）重复步骤（3）-（5）（即步骤S4），分别完成同批次38份个体尿液样品中OH-PAHs与mVOCs、8-OHdG的检测，得到该批次38个尿液的检测数据，然后汇总、分类，进行群体OH-PAHs的健康暴露特征分析：以暴露与非暴露作为自变量，以年龄、性别、岗位、作业时间的因子分为连续变量和分类变量，其中，性别、岗位属于分类变量，年龄、作业时间属于连续变量，OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG含量数据则作为因变量；采用SPSS分析软件，把分类变量与OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG检测数据进行差异性分析，把连续变量与OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG检测数据进行相关性分析，得出三种目标检测物之间的相关性；
（7）暴露特征分析（即步骤S5）：以三种目标检测物的检测数据及相互之间的相关性为基础，构建单羟基多环芳烃OH-PAHs、mVOCs个体损伤预测与评估分析的数学模型，将单个个体样本的目标检测物的检测数据代入该数学模型（公式1），计算得出导致个体DNA损伤标志物8-OHdG升高的贡献值，以进一步应用于对个体进行OH-PAHs、mVOCs健康暴露风险的预测与评估，并进行影响因素及影响水平的判断。
对38名职业工人的尿液检测数据进行整理、汇总、分类，以车间工人为暴露组，以办公室工人为对照组，采用SPSS分析软件，对mVOC、OHPAHs的差异性、相关性进行逐项分析，得出P值，见表5和表6。
前述的步骤（1）-（7），本实施例提供的更为详细的步骤为：
1. 材料准备
1.1 仪器与材料：Agilent 1260液相色谱仪，AB SCIEX API 4000三重四极杆质谱仪（应用生物***公司，美国），Agilent InfinityLab poroshell 120 EC-C18（4.6×50mm,2.7μm）液相色谱柱，水浴锅（智诚分析仪器制造，上海），氮吹仪（柏林河西路，美国)，Milli-Q 超纯水***（默克，德国），涡旋振荡器（特朗纳，美国），15 mL PP离心管，15 mL玻璃旋盖离心管（目盛付，日本），短型玻璃巴斯德吸管（上海安谱实验科技，中国），Poly-Sery HLBPro (500 mg, 6 mL)（上海安谱实验科技，中国），称量纸（上海伯奥生物科技，中国）。
1.2 试剂与标准品：色谱纯乙酸铵、乙酸、乙酸钠、甲醇、乙腈（上海安谱实验科技，中国），色谱级二氯甲烷（默克，德国），12种OH-PAHs标准品：1-OH-Nap, 1-OH-Pyr, 6-OH-Chr (Accustandard Inc, New Haven, USA); 2-OH-Nap, 2-OH-Flu (Chiron AS,Trondheim, Norway); 3-OH-Flu, 3-OH-BaP (Toronto Research Chemicals, Toronto,Canada); 1-OH-Phe, 2-OH-Phe, 3-OH-Phe, 4-OH-Phe, 9-OH-Phe (Dr. Ehrenstorfer,Augsburg, Germany); 及其4种同位素标记物：2-OH-Nap-d7, 2-OH-Flu-d9, 1-OH-Pyr-d9(Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada), 3-OH-Phe-13C6 (CambridgeIsotope Laboratories, Andover, MA, USA)；22种挥发性有机物代谢物标准品：AAMA,CYMA, BPMA, DHBMA, MHBMA3, PMA, AMCC, IPMA3, PHEMA, TCVMA, BMA, 2,2-DCVMA(Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada); MU, TTCA, PGA (Sigma-Aldrich,Bornem, Belgium); 1,2-DB (Accustandard Inc., New Haven, USA); 4-CCT, TGA (Dr.Ehrenstorfer, Augsburg, Germany); PPA, MA (Tokyo Chemical Industry Co.,Tokyo, Japan); 2MHA (alfer Aesar, Shanghai, China); HA (Aladdin ChemicalReagent Co., Shanghai, China)；以及7种同位素标记物标准品：AAMA-d4, PGA-d5, MA-d5, BPMA-d7, PMA-d5, TCVMA-d3, HA-d5 (Toronto Research Chemicals, Toronto,Canada); 8-OHdG (alfer Aesar, Shanghai, China)及同位素标记物8-OHdG-13C,15N2(Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada)；同位素标准品2-OH-Nap-d7, 2-OH-Flu-d9, 3-OH-Phe-13C6 用作OH-PAHs定量内标，同位素标准品AAMA-d4, PGA-d5, MA-d5,BPMA-d7, PMA-d5, TCVMA-d3用作mVOCs定量内标，8-OHdG-13C,15N2用作8-OHdG定量内标。同位素标准品1-OH-Pyr-d9用作OH-PAHs回标，HA-d5用作mVOCs回标。各目标分析物的基本信息及仪器分析参数详见表1.
表1. 目标分析物的基本信息及仪器分析参数
Figure 296656DEST_PATH_IMAGE001
Figure 557873DEST_PATH_IMAGE002
Figure 289069DEST_PATH_IMAGE003
Figure 875908DEST_PATH_IMAGE004
2. 分析方法
2.1 样品信息
从华南地区某石化企业招募了38名年龄介于20至50岁之间的男性职业工人。所收集尿液样本均为中段晨尿，用预先处理过的70 mL聚乙烯尿杯于-80℃冰箱冷冻保存，并于12 小时内测定尿比重。
2.2 样品的前处理流程
（1）样品的酶解：将采集的尿液样品4℃解冻后混匀，取1 mL于15 mL PP离心管中，并向其中加入已知量（20 ng）的内标指示物，然后，加入1 mL 的1 mol/L的乙酸钠-乙酸缓冲液（pH=4.5）调节pH，再加入10 μL β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶（30 U/mL），涡旋混匀，37℃水浴酶解6 h，冷却至室温后，加入50 μL 1%甲酸调节pH，涡旋5 s混匀；
（2）样品的富集与分离：将上述酶解后的溶液加载至依次用6 mL 二氯甲烷，6 mL甲醇及12 mL 0.1%甲酸水溶液活化后的Poly-Sery HLB Pro（500mg, 6 mL）固相萃取小柱上，进行富集，然后，先使用6 mL甲酸：甲醇：乙腈（2:49:49，v/v/v），再使用8 mL 甲醇：二氯甲烷（1:1，v/v）进行洗脱，流出溶液接取至15 mL的玻璃离心管中，得到含两类代谢物及8-OHdG的洗脱液；
（3）样品的浓缩与检测：将上述含两类代谢物及8-OHdG的洗脱液氮吹浓缩近干，用180 μL甲醇复溶，加入20 μL 1ppm的回标指示物（即定溶至200 μL），-20oC冰箱静置一夜，取上清液，12000 r/min离心5 min，再取上清液，采用HPLC-MS/MS分别进行OH-PAHs，mVOCs及8-OHdG的上机检测，分析目标物的含量。完整前处理流程详见图1。
2.3 HPLC-MS/MS仪器分析方法
OH-PAHs，mVOCs及8-OHdG均采用高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（HPLC-MS/MS）进行分析，均采用Agilent InfinityLab poroshell 120 EC-C18（4.6×50 mm, 2.7 μm）色谱柱实现目标物的色谱分离，柱箱温度设置为40℃，进样体积为10 μL, 质谱离子源为ESI-，质谱为MRM扫描模式。其他仪器参数如下：干燥气温度为550oC，气体流量为10 mL·min-1，输入电压为-10 V，碰撞池输出电压为-15 V，离子喷雾电压为-4500 V，负电喷雾电离的离子源模式。
（1）OH-PAHs的色谱分离：以甲醇（A相）和超纯水（D相）作为流动相，流速设为0.4mL/min，12种OH-PAHs及其4种同位素标记物的色谱图、流动相洗脱程序分别如下图2和表2所示，整个分析过程为17.1 min。
表2. 12种OH-PAHs的流动相洗脱程序
Figure 958134DEST_PATH_IMAGE005
（2）mVOCs及8-OHdG的色谱分离：以乙腈（A相）和0.1%甲酸水溶液（B相）作为流动相，流速设为0.4 mL/min，22种mVOCs及其6种同位素内标，8-OHdG及8-OHdG-13C,15N2的色谱图、流动相洗脱程序分别如图3和表3所示，整个分析过程为14.1 min。
表3. 22种mVOCs及8-OHdG的流动相洗脱程序
Figure 757462DEST_PATH_IMAGE006
2.4 检测结果与应用
在完成同批次38个个体尿液样品中OH-PAHs 与mVOCs、8-OHdG的检测之后，再分析同批次多个尿液样品中OH-PAHs 与mVOCs、8-OHdG检测数据之间的相关性，作为单羟基多环芳烃OH-PAHs、mVOCs群体健康暴露风险评估的依据，提高群体OH-PAHs、mVOCs健康暴露风险评估结果的准确性。
将所得到的该批次38个尿液的检测数据进行汇总、分类，进行群体OH-PAHs的健康暴露特征分析：以暴露与非暴露作为自变量，以年龄、性别、岗位、作业时间的因子分为连续变量和分类变量，其中，性别、岗位属于分类变量，年龄、作业时间属于连续变量，OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG含量数据则作为因变量；采用SPSS分析软件，把分类变量与OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG检测数据进行差异性分析，把连续变量与OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG检测数据进行相关性分析，得出三种目标检测物之间的相关性；
个体的健康暴露风险预测与评估的步骤是：以三种目标检测物的检测数据及相互之间的相关性为基础，构建单羟基多环芳烃OH-PAHs、mVOCs个体损伤预测与评估分析的数学模型，将待检个体样本的目标检测物的检测数据代入该数学模型中，计算得出导致该个体DNA损伤标志物8-OHdG升高的贡献值，以进一步应用于对个体进行OH-PAHs、mVOCs健康暴露风险的预测与评估，进行影响因素和影响水平的判断。
2.4.1 方法验证
由于缺乏适用于尿液分析的标准参考物质，因此本发明通过加标基质（混合尿液样品）和空白实验验证了该方法的适用性。为保证尿液基质样品中较低的目标分析物背景值，采集了低暴露区域一般人群的中段晨尿样品，充分混合后分成12个等分（每等分取1mL）；其中3个以低浓度（LL，2 ng）的目标化合物加标，3个以中浓度（ML，10 ng）加标，3个以高浓度（HL，40 ng）加标；其余3个重复样品用作非加标对照。另设置三个程序空白样品，以监测实验室背景污染；程序空白和非加标尿液样品中目标化合物的平均浓度用于对加标样品分析结果的校正。通过校准曲线的线性，目标化合物检出限（Limits of detection，LOD）、定量限（Limits of quantification，LOQ）以及每个分析物的准确度和精密度，以评估所开发方法的可靠性和适用性，详述如下。
（1）线性
根据所分析的目标化合物种类，制备了两条校准曲线：12种OH-PAHs标准混合物（1-OH-Nap, 2-OH-Nap, 2-OH-Flu, 3-OH-Flu, 1-OH-Phe, 2-OH-Phe, 3-OH-Phe, 4-OH-Phe, 9-OH-Phe, 1-OH-Pyr, 6-OH-Chr, 3-OH-BaP）；22种mVOCs及8-OHdG标准混合物（AAMA, CYMA, BPMA, DHBMA, MHBMA3, PMA, AMCC, IPMA3, PHEMA, TCVMA, BMA, 2,2-DCVMA, MU, TTCA, PGA, 1,2-DB, 4-CCT, TGA, PPA, MA, 2MHA, HA, 8-OHdG）。校准曲线的浓度范围根据尿液样品中的预期浓度分别设置9个数据点。校准曲线均采取线性模型，通过线性相关系数（R2）加以评估。本发明中，所有目标分析物均具有良好的相关性，R2 ≥0.996。详见表4。
表4. 建立的尿液分析方法的验证结果
Figure 484110DEST_PATH_IMAGE008
Figure 507429DEST_PATH_IMAGE010
（2）定量限（LOD）和检出限（LOQ）
LOD根据最低浓度标准曲线点相应化合物的3倍信噪比（S/N=3）进行计算。LOQ设置为程序空白中检测到的目标化合物的平均值加上三倍标准偏差。对于在程序空白中未检出的目标化合物，LOQ设置为最低浓度标准曲线点目标化合物的10信噪比（S/N=10）。本研究中OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG的LOQ分别为0.010~7.567 ng/mL, 0.036~4.733 ng/mL和0.204ng/mL详见表4。
（3）准确度和精密度
准确度通过尿液基质加标样品中各目标化合物的回收率加以评估，即加标样品中各分析物的检测值（通过程序和基质空白样品中的含量进行校正）与实际加标量的百分比。分析方法的精密度（也称为方法的重复性）为可重复条件下三个重复样品的相对标准偏差（RSD）。
总体而言，验证结果表明，LL，ML和HL组中的分析物均具有良好的准确度和精密度。OH-PAHs，mVOCs及8-OHdG的平均准确度范围，低加标（LL）样品中OH-PAHs，mVOCs和8-OHdG的准确度分别为81~118％（RSD <12％），81~117％（RSD <15％），108％（RSD <4％）；中加标（HL）样品中相应的准确度分别为81~113％（RSD <18％），76~114％（RSD <11％），101％（RSD <6％）；高加标（HL）样品中相应的准确度分别为81~117％（RSD <11％），77~120％（RSD<10％），91％（RSD <3％）（见表4）。本实施例中所有目标物的检测结果准确度和精度均相当或者优于已经公开的文献。OH-PAHs，mVOCs和8-OHdG的加标基质样品中各自的内标（IS）回收率分别为73 ± 2%至101 ± 2%，82 ± 5%至120 ± 2%，以及86 ± 8% 至118 ± 3%（见图4）。
表5 mVOC暴露情况分析表
Figure 217897DEST_PATH_IMAGE011
表6 OHPAHs暴露情况分析表
Figure 820916DEST_PATH_IMAGE012
本实施例提供的前述尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法的应用，是在前述检测数据的基础上，通过分析所检测得到的多个（群体）尿液样本中的目标物OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG的含量数据，以及相互之间的关系，将该数据与关系一起应用于评估环境中普遍存在的两类污染物在人群中的暴露特征或临床诊断，其具体包括如下步骤：
（1）采样对象信息收集：收集采样对象的基础信息，包括收集38名职业工人的暴露影响因素，包括年龄、性别、岗位、作业时间（入职时间）等基本信息；
（2）数据分类：把年龄、性别、岗位、作业时间等因子分为连续变量和分类变量，其中，性别、岗位属于分类变量，年龄、作业时间属于连续变量，OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG含量数据则作为因变量，并相应归类；
（3）关联性分析：采用SPSS分析软件，把分类变量与OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG检测数据进行差异性分析；把连续变量与OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG检测数据进行相关性分析，得到P值；
（4）结果判定：当P＜0.05时，表示暴露特征差异显著；P＞0.05时，表示暴露特征无统计学差异。
进行暴露特征判断结果：依据条件“p＜0.05时，显著，当P＞0.05时，无差异”对暴露情况进行判断，从表5可知，暴露组（车间工人）的TGA、MU、1,2-DB、IPMA3、HA、2MHA、BPMA、2,2-DCVMA、4-CCT、TCVMA、PPA等mVOC的P值小于0.05，暴露组与非暴露组存在差异显著，即车间工人尿液中的GA、MU、1,2-DB、IPMA3、HA、2MHA、BPMA、2,2-DCVMA、4-CCT、TCVMA、PPA比办公室工人高。
同理，根据表6可判断，车间工人尿液中的1-OH-Nap、2-OH-Flu、3-OH-Phe、1-OH-Pyr、6-OH-Chr比办公室人员高。
本发明实施例同步检测方法的另一个应用，是进一步通过分析检测得到的，同批次多个个体尿液样本中的目标物OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG的含量数据及相互之间的关系，一起应用于评估同批次人群的群体健康暴露风险或流行病学分析，其具体包括如下步骤：
（1）数据获取：获取38个个体人员尿液样本中的多种PAHs代谢产物羟基多环芳烃OH-PAHs、多种挥发性有机物代谢产物mVOCs及暴露效应标志物8-OHdG数据，然后汇总，统一单位，mg/L；
（2）统计分析：以32种污染物及代谢产物作为自变量，8-OHdG作为因变量，则计算导致因变量8-OHdG浓度升高的贡献值y的数学模型为：
y=aX1+bX2+…+nXn （公式1）
式中，a、b…n为系数，X1、X2…Xn为自变量；
再使用logistics回归分析，得出P值；
（3）结果判定：
当P＜0.05时，存在显著性，表示自变量是因变量的保护或危险因素，且存在统计学意义，该变量的权重数纳入公式1中计算，当P＞0.05时，无显著性，表示自变量对因变量的影响不存在统计学意义，不纳入计算。
具体的，先整理12种羟基多环芳烃（OH-PAHs）、22种挥发性有机物代谢产物（mVOCs）及8-OHdG数据，统一单位，mg/L或ug/L，以32种污染物代谢产物作为自变量，8-OHdG作为因变量， y=aX1+bX2+…+nXn，其中，a、b…n为系数，X1、X2…Xn为自变量，使用logistics回归分析，得出P值。当P＜0.05时，存在显著性，表示自变量是因变量的保护或危险因素，且存在统计学意义，该变量的权重数纳入计算，当P＞0.05时，无显著性，表示自变量对因变量的影响不存在统计学意义，不纳入计算。其判断结果见表7。
表7 mVOC、OHPAHs与8-OHdG的权重系数及显著性
Figure DEST_PATH_IMAGE013
从表7可知，污染物中的4-OH-Phe、MU、TCVMA的P值＜0.05，4-OH-Phe、MU、TCVMA与8-OHdG存在相关性，即4-OH-Phe、MU、TCVMA对人体健康存在一定危害，是造成8-OHdG浓度升高的重要原因之一。以上因素对8-OHdG的浓度升高的贡献值y y=0.26*X1+0.84*X2+0.72*X3，y值越高，则表明人体受相关因素造成的损伤越大。
实施例2：
本实施例提供的尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用，其与实施例1基本上相同，其不同之处在于，其是在实施例1对38个样品分析得到的群体尿液样本的检测方法、数据及群体应用的基础上，进一步将该数据及相互关系，应用于对单个个体人员的个体损伤影响水平进行分析或临床诊断。即将实施例1中得到的38份样本检测与分析得到的尿液样本中的目标物OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG的含量数据及相互之间的关系，应用于对单个的个体人员的个体损伤影响水平进行分析或临床诊断，其具体包括如下步骤：
（1）数据获取：获取待检的单个个体人员尿液样本（38个样本中的1个）中多种羟基多环芳烃OH-PAHs、多种挥发性有机物代谢产物mVOCs及暴露效应标志物8-OHdG数据，统一单位，mg/L；
（2）影响分析：将该样本的各目标检测物的检测数据，分别代入所述的公式1： y=aX1+bX2+…+nXn 中，计算得到导致该个体DNA损伤标志物8-OHdG升高的贡献值y。y值越高，人体受相关因素造成的损伤越大。
本实施例中，随机抽取38人中的张三的尿液样本检测数据，进行个体损伤预测与评估，将检测数据及分析结果具体代入数学模型y=0.26*X1+0.84*X2+0.72*X3中，对该个体损伤影响水平进行分析。张三尿液样品数据中的4-OH-Phe浓度为0.04 ng/L，MU浓度为2.78ng/L、TCVMA为15.3 ng/L，则以上因素可导致8-OHdG浓度升高的贡献值：y=0.26*0.04+0.84*2.78+0.72*15.3=13.36 ng/L。该贡献值计算结果，表明人体通过MU、4-OH-Phe、TCVMA暴露后，机体受到了一定损伤，其中，TCVMA的损伤贡献最大。
需要说明的是，在本发明其他实施例中，在本发明记载的步骤、组分、配比、工艺参数和条件的范围内，进行具体选择所得到的其他不同方案，均可以达到本发明所记载的技术效果，故本发明不再将其一一列出。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。凡是依据本发明之组分、配比及工艺所作的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法，其特征在于，选取同一份尿液样品中存在相关性的多种单羟基多环芳烃OH-PAHs、挥发性有机物代谢物mVOCs和暴露效应标志物8-羟基-2-脱氧鸟苷8-OHdG作为目标检测物，进行同步提取、检测、分析，其包括如下步骤：
S1：样品的预处理：将采集的个体尿液样品分别4℃解冻后混匀，取1 mL于15-mL PP离心管中，并向其中加入已知量的内标指示物；随后，加入1 mL 的1 mol/L的pH = 4.5乙酸钠-乙酸缓冲液调节至pH = 5，再加入10 μL、30 U/mL的β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶；涡旋混匀，37℃水浴酶解6 h；冷却至室温后，加入50 μL 1%甲酸调节pH，涡旋5 s混匀；
S2：样品的富集与分离：将上述酶解后的溶液转移至依次用6 mL 二氯甲烷、6 mL甲醇及12 mL 0.1%甲酸水溶液活化后的500 mg、6 mL Poly-Sery HLB Pro固相萃取小柱上，进行富集；然后，先使用6 mL体积比甲酸2：甲醇49：乙腈49的溶剂洗脱，再使用8 mL体积比甲醇1：二氯甲烷1的溶剂进行洗脱，将流出的溶液接取至15-mL的玻璃离心管中，得到含两类代谢物OH-PAHs、mVOCs及暴露效应标志物8-OHdG的洗脱液；
S3：样品的浓缩与检测：将上述含两类代谢物及暴露效应标志物的洗脱液氮吹浓缩近干，用180 μL甲醇复溶，加入20 μL 1ppm的回标指示物、即定溶至200 μL，在-20℃冰箱静置一夜，取上清液，在12000 r/min下离心5 min，再取上清液；采用HPLC-MS/MS分别进行OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG的上机检测，对应分析得到尿液中的目标检测物OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG的含量数据；
S4：重复步骤S1- S3，分别完成同批次多个个体尿液样品中OH-PAHs 与mVOCs、8-OHdG的检测，得到该批次多个尿液的检测数据，然后汇总、分类，进行群体OH-PAHs与mVOCs的健康暴露特征分析：把年龄、性别、岗位、作业时间的因子分为连续变量和分类变量，其中，性别、岗位属于分类变量，年龄、作业时间属于连续变量，以OH-PAHs、mVOCs含量数据作为自变量，8-OHdG含量数据则作为因变量；采用SPSS分析软件，把分类变量与OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG检测数据进行差异性分析，把连续变量与OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG检测数据进行相关性分析，得出三种目标检测物之间的相关性。
2.根据权利要求1所述的尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法，其特征在于，其还包括如下步骤：
S5：以三种目标检测物的检测数据及相互之间的相关性为基础，构建单羟基多环芳烃OH-PAHs、mVOCs个体损伤预测与评估分析的数学模型，将单个个体样本的目标检测物的检测数据代入该数学模型，计算得出导致个体DNA损伤标志物8-OHdG升高的贡献值。
3.根据权利要求1所述的尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法，其特征在于，其还包括如下步骤：
步骤S1中所述内标指示物包括：20 ng 2-OH-Nap-d7, 20 ng 2-OH-Flu-d9, 20 ng 3-OH-Phe-13C6, 20 ng AAMA-d4, 20 ng PGA-d5, 20 ng MA-d5, 20 ng BPMA-d7, 20 ngPMA-d5, 20 ng TCVMA-d3, 20 ng 8-OHdG-13C,15N2。
4.根据权利要求1所述的尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法，其特征在于，步骤S1中，将1 mL的 1 mol/L、pH = 4.5的乙酸钠-乙酸缓冲液用于调节尿液pH的步骤，是为后续加入的β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶创造最佳pH条件，在37℃下水浴酶解，使β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶发挥最佳酶解效果，充分释放尿液中的结合态代谢物及8-OHdG；步骤S1中的冷却至室温后，加入50 μL 1%甲酸调节固相萃取前的pH，以有利于目标代谢物在HLB Pro固相萃取小柱上保留，获得更高的回收率。
5.根据权利要求1所述的尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法，其特征在于，步骤S2中所述固相萃取小柱采用Poly-Sery HLB Pro小柱，规格为500 mg，6 ml，通过该设置对较宽范围性质的非极性和极性目标物均有较好的保留，以满足富集、分离和定量研究的条件，同时减少溶剂的使用。
6.根据权利要求1所述的尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法，其特征在于，所述步骤S3中的回标指示物为：20 ng 1-OH-Pyr-d9、20 ng HA-d5。
7.根据权利要求1所述的尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法，其特征在于，步骤S3中所述的HPLC-MS/MS是高效液相色谱与质谱的联用，以液相色谱作为分离***，质谱为检测***；其中，HPLC是初分化合物，一级MS是对HPLC谱图中的各峰进行质谱分析，二级MS是对一级MS中的峰进行再一个解离分析以确定一级MS的峰的结构。
8.一种权利要求1~7之一所述尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物的同步检测方法的应用，其特征在于，将检测得到的尿液样本中的目标物OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG的含量数据，进一步分析出相互之间的关系，一起应用于评估环境中普遍存在的两类污染物在人群中的暴露特征，其具体包括如下步骤：
（1）采样对象信息收集：收集采样对象的基础信息，包括年龄、性别、岗位、作业时间；
（2）数据分类：把年龄、性别、岗位、作业时间的因子分为连续变量和分类变量，其中，性别、岗位属于分类变量，年龄、作业时间属于连续变量，以OH-PAHs、mVOCs含量数据作为自变量，8-OHdG含量数据则作为因变量，并相应归类；
（3）关联性分析：采用SPSS分析软件，把分类变量与OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG检测数据进行差异性分析；把连续变量与OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG检测数据进行相关性分析，得到P值；
（4）结果判定：当P＜0.05时，表示暴露特征差异显著；P＞0.05时，表示暴露特征无统计学差异。
9.根据权利要求8所述的同步检测方法的应用，其特征在于，将检测得到的同批次多个个体尿液样本中的目标物OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG的含量数据，及进一步分析相互之间的关系，一起应用于评估同批次人群的群体健康暴露风险分析，其具体包括如下步骤：
（1）数据获取：获取多个个体人员尿液样本中的多种PAHs代谢产物单羟基多环芳烃OH-PAHs、多种挥发性有机物代谢产物mVOCs及暴露效应标志物8-OHdG数据，然后汇总，统一单位，mg/L；
（2）统计分析：以不少于20种污染物的代谢产物作为自变量，8-OHdG作为因变量，则计算导致因变量8-OHdG浓度升高的贡献值y的数学模型为：
y=aX1+bX2+…+nXn 公式1
式中，a、b…n为系数，X1、X2…Xn为自变量；
再使用logistics回归分析，得出P值；
（3）结果判定：
当P＜0.05时，存在显著性，表示自变量与因变量存在关系，该变量的权重数纳入公式1中计算，当P＞0.05时，无显著性，表示自变量与因变量无关系，不纳入计算。
10.根据权利要求9所述的同步检测方法的应用，其特征在于，将检测得到的尿液样本中的目标物OH-PAHs、mVOCs及8-OHdG的含量数据，及进一步分析相互之间的关系，一起应用于对个体人员的个体损伤影响水平进行分析，其具体包括如下步骤：
（1）数据获取：获取待检单个个体人员尿液样本中多种单羟基多环芳烃OH-PAHs、多种挥发性有机物代谢产物mVOCs及暴露效应标志物8-OHdG的检测数据，统一单位，mg/L；
（2）影响分析：将该单个个体样本各目标检测物的检测数据，分别代入所述的公式1中，计算得到导致该个体DNA损伤标志物8-OHdG升高的贡献值y；y值越高，则表明人体受相关因素造成的损伤越大。
CN202111310594.2A 2021-11-08 2021-11-08 尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用 Active CN113777209B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111310594.2A CN113777209B (zh) 2021-11-08 2021-11-08 尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111310594.2A CN113777209B (zh) 2021-11-08 2021-11-08 尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113777209A CN113777209A (zh) 2021-12-10
CN113777209B true CN113777209B (zh) 2022-02-08

Family

ID=78873614

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111310594.2A Active CN113777209B (zh) 2021-11-08 2021-11-08 尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113777209B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113960220B (zh) * 2021-12-15 2022-03-04 生态环境部华南环境科学研究所 血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法及应用
CN114354807A (zh) * 2021-12-31 2022-04-15 天津诺禾医学检验所有限公司 8-羟基-2-脱氧鸟苷的检测方法
CN115201384B (zh) * 2022-09-16 2022-12-06 生态环境部华南环境科学研究所(生态环境部生态环境应急研究所) 大范围人群头发中多种污染物的暴露风险评估与检测方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101537265A (zh) * 2009-03-18 2009-09-23 南京大学 水中不同极性有机物同柱萃取再分级分离的方法
CN103344718A (zh) * 2013-06-28 2013-10-09 上海大学 快速筛查尿中羟基多环芳烃的方法
CN104391071A (zh) * 2014-12-13 2015-03-04 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构***素F2α的分析方法
CN104458988A (zh) * 2014-11-27 2015-03-25 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一组生物标志物的测定方法
CN106370744A (zh) * 2016-08-25 2017-02-01 浙江大学 8‑羟基脱氧鸟苷作为尿液标志物的应用
CN110487940A (zh) * 2019-08-20 2019-11-22 天津大学 尿液中邻苯二甲酸酯代谢单酯固相萃取前处理方法
CN111983053A (zh) * 2020-07-23 2020-11-24 广东工业大学 一种在线测定尿液中羟基多环芳烃的固相萃取-液相色谱三重四级杆质谱同位素稀释法
CN111983122A (zh) * 2020-08-05 2020-11-24 哈尔滨工业大学 利用气相色谱串联三重四级杆质谱检测环境介质中123种多环芳烃的方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101537265A (zh) * 2009-03-18 2009-09-23 南京大学 水中不同极性有机物同柱萃取再分级分离的方法
CN103344718A (zh) * 2013-06-28 2013-10-09 上海大学 快速筛查尿中羟基多环芳烃的方法
CN104458988A (zh) * 2014-11-27 2015-03-25 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一组生物标志物的测定方法
CN104391071A (zh) * 2014-12-13 2015-03-04 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构***素F2α的分析方法
CN106370744A (zh) * 2016-08-25 2017-02-01 浙江大学 8‑羟基脱氧鸟苷作为尿液标志物的应用
CN110487940A (zh) * 2019-08-20 2019-11-22 天津大学 尿液中邻苯二甲酸酯代谢单酯固相萃取前处理方法
CN111983053A (zh) * 2020-07-23 2020-11-24 广东工业大学 一种在线测定尿液中羟基多环芳烃的固相萃取-液相色谱三重四级杆质谱同位素稀释法
CN111983122A (zh) * 2020-08-05 2020-11-24 哈尔滨工业大学 利用气相色谱串联三重四级杆质谱检测环境介质中123种多环芳烃的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Simultaneous Determination of Multiple Classes of Phenolic Compounds in Human Urine: Insight into Metabolic Biomarkers of Occupational Exposure to E‑Waste;Meiqing Lin et al;《Environmental Science & Technology Letters》;20200408;第7卷(第5期);323-329 *
Simultaneous determination of urinary 31 metabolites of VOCs, 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine, and trans-3′-hydroxycotinine by UPLC-MS/MS: 13C- and 15N-labeled isotoped internal standards are more effective on reduction of matrix effect;Hongxuan Kuang et al;《Analytical and Bioanalytical Chemistry》;20191120;第411卷;7841-7855 *
尿中多环芳烃羟基代谢物分析方法研究进展;秦晓蕾 等;《中国工业医学杂志》;20101231;第23卷(第6期);429-433 *
超高效液相色谱串联质谱法测定人尿中的8-羟基脱氧鸟苷;王丽英 等;《中国卫生检验杂志》;20141231;第24卷(第23期);3370-3372,3375 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113777209A (zh) 2021-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113777209B (zh) 尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用
Rafii et al. High-throughput and simultaneous measurement of homocysteine and cysteine in human plasma and urine by liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry
CN108414660B (zh) 一组与肺癌早期诊断相关的血浆代谢小分子标志物的应用
Wang et al. Newborn screening of phenylketonuria using direct analysis in real time (DART) mass spectrometry
CN111579665B (zh) 一种基于uplc/hrms的代谢组学相对定量分析方法
Kim et al. A sensitive and specific liquid chromatography–tandem mass spectrometry method for the determination of intracellular and extracellular uric acid
Keevil Does the presence of 3-epi-25OHD3 affect the routine measurement of vitamin D using liquid chromatography tandem mass spectrometry?
CN113960220B (zh) 血液中多环芳烃及其衍生物的同步检测方法及应用
CN112630311B (zh) 用于检测情感障碍的代谢标记物和试剂盒及使用方法
Wang et al. A simple method for the analysis by MS/MS of underivatized amino acids on dry blood spots from newborn screening
Chen et al. Targeting amine-and phenol-containing metabolites in urine by dansylation isotope labeling and liquid chromatography mass spectrometry for evaluation of bladder cancer biomarkers
CN113406235A (zh) 一种基于uplc-ms/ms检测色氨酸及其代谢物的试剂盒和方法
CN111458417A (zh) 联合检测待测样品中多种抗生素的方法及试剂盒
CN113567585A (zh) 一种基于外周血的食管鳞癌筛查标志物及试剂盒
CN114965786B (zh) 一种检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法
CN115684451A (zh) 基于代谢组学的食管鳞癌***转移诊断标志物及其应用
CN113252818B (zh) 一种采用基准样品对同系列化合物进行定量和评价的方法
CN112611814B (zh) 一种干血片中1,5-脱水葡萄糖醇的测定方法
KR101552011B1 (ko) 리소포스파티딜콜린 및 호모시스테인산을 포함하는 난소암 진단용 조성물 및 이를 사용하여 난소암을 진단하는 방법
CN113341023B (zh) 一种基于液质联用的血清二氨基庚二酸的检测试剂盒及检测方法与应用
CN112162049B (zh) 一种非诊断目的检测尿液中肌氨酸的方法
CN109187818A (zh) 一种鉴定慢阻肺生物标记物的方法及其检测试剂盒
CN115144517B (zh) 一种检测样本中肌氨酸及其代谢物的方法及其试剂盒和应用
CN109212101A (zh) 一种鉴定哮喘生物标记物的方法及其检测试剂盒
CN109406658A (zh) 一种鉴定贫血生物标记物的方法及其检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant