CN113406235A - 一种基于uplc-ms/ms检测色氨酸及其代谢物的试剂盒和方法 - Google Patents

一种基于uplc-ms/ms检测色氨酸及其代谢物的试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于超高效液相色谱串联质谱法（UPLC‑MS/MS）同时检测生物样本中色氨酸及其代谢物的试剂盒和方法，属于UPLC‑MS/MS检测技术领域。所述试剂盒包括色氨酸及其代谢物的标准品，其中，所述色氨酸及其代谢物包括：3‑羟基犬尿氨酸、5‑羟色胺、犬尿氨酸、黄尿酸、色氨酸、犬尿喹啉酸、3‑羟基邻氨基苯甲酸、5‑羟基吲哚乙酸、3‑吲哚乙酸和3‑吲哚丙酸。所述方法利用UPLC‑MS/MS对所述色氨酸及其代谢物进行检测，根据峰面积建立标准曲线，从而得到所述色氨酸及其代谢物的含量。利用本发明检测色氨酸及其代谢物，操作简单，具有灵敏度高，选择性好等特点，可准确、快速地同时检测色氨酸及其代谢物，具有广泛的应用价值。

Description

一种基于UPLC-MS/MS检测色氨酸及其代谢物的试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)检测技术领域，具体地，涉及一种基于UPLC-MS/MS检测色氨酸及其代谢物的试剂盒和方法。
背景技术
色氨酸(Tryptophan，TRP)是人体的必需氨基酸之一，其可作为多种重要的生物活性分子的前体而在蛋白质生物合成和体内代谢调节网络中起重要作用。据研究，癌症、冠心病、阿尔兹海默症、肠易激综合征等疾病都与色氨酸的代谢紊乱有关。摄入的色氨酸主要通过以下三种途径在体内代谢：犬尿氨酸(Kynurenine，KYN)，血清素(Serotonin)途径和细菌降解途径。
大约95％的色氨酸通过犬尿氨酸途径代谢，转化为一系列下游代谢产物，包括犬尿氨酸、犬尿喹啉酸(Kynurenic acid，KYNA)、3-羟基犬尿氨酸(3-Hydroxykynurenine，3-HK)，3-羟基邻氨基苯甲酸(3-Hydroxyanthranilic acid，3-HAA)和黄尿酸(Xanthurenicacid，XA)。犬尿氨酸途径又可分为肝脏途径和非肝脏途径，90％的色氨酸在肝脏中被色氨酸-2,3-双加氧酶(Tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO)催化代谢，非肝脏途径中代谢色氨酸的酶主要为吲哚胺-2,3-双加氧酶(Indoleamine-2,3-dioxygenase，IDO)，TDO与IDO均是TRP转化为N-甲酰基犬尿氨酸(N-formylkynurenine，NFK)的关键限速酶，NFK可进一步通过犬尿氨酸甲酰胺酶水解生成犬尿氨酸(Kynurenine，KYN)。犬尿氨酸主要通过两条通路代谢，一条通路是在犬尿氨酸-3-单加氧酶(Kynurenine3-monooxygenase，KMO)催化下生成3-羟基犬尿氨酸，然后分别通过犬尿氨酸酶(Kynureninase，KYNU)和犬尿氨酸氨基转移酶(Kynurenine amino-transferases，KAT)催化生成3-羟基邻氨基苯甲酸(3-Hydroxyanthranilic acids，3-HAA)和黄尿酸(Xanthurenic acid，XA)，最后经多级酶促反应生成喹啉酸(Quinolinic acid，QA)、吡啶羧酸类及尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)等活性分子。另一条通路是在犬尿氨酸氨基转移酶的作用下生成犬尿喹啉酸。犬尿氨酸代谢通路的代谢物在免疫调节，神经兴奋性和血管舒张等生理机能上有着重要作用。据报道，血浆中犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的病理性水平增加与冠心病患者的死亡和心血管事件风险升高相关。此外，作为一种可促进肿瘤增殖的内源性配体，犬尿氨酸与芳香烃受体(AHR)结合并激活AHR通路，从而促进肿瘤细胞的生长和迁移。
大约1％-2％的色氨酸通过色氨酸羟化酶(TPH)和脱羧酶催化生成神经递质5-羟色胺(5-HT)，一部分5-羟色胺可经肝脏单胺氧化酶(MAO)催化生成5-羟基吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid，HIAA)。作为单胺激素和神经递质，5-羟色胺参与多种生理过程，特别是在调节神经传递，血压调节和生长刺激功能中起重要作用。血清素的异常释放可引发病理生理过程，如抑郁症，肠道易激综合征和血栓形成。
色氨酸在肠道菌群作用下代谢生成3-吲哚丙酸(3-Indolepropionic acid，IPA)和3-吲哚乙酸(3-Indoleacetic acid，IAA)。3-吲哚丙酸是一种强效抗氧化剂，具有神经保护作用。其可激活PXR，清除氢氧自由基，减少神经元细胞的DNA损害和脂质过氧化，并抑制β淀粉样蛋白的生成，因此对于缺血导致的神经损伤具有保护作用，被认为是有效清除自由基的吲哚胺。
基于色氨酸及其代谢物在疾病发生发展、能量代谢及维持机体稳态中的关键作用，开发同时定量人血浆中上述10个代谢物的检测方法是非常重要的。但色氨酸及其代谢物用常规分析方法很难测定，因为：(1)机体含量较低，对方法灵敏度要求较高；(2)生物样本中组成复杂，干扰组分对定量样本的代谢物浓度产生干扰。
目前，基于液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)联用技术的遗传代谢小分子诊断是分离检测复杂体系中组分的较为有效的方法，其具有灵敏度高、选择性好、线性范围宽等特点，对于样本量少且基质复杂的混合物分析，优势非常明显。国内外曾报道过同时测定人血浆中的色氨酸及其代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，但已报道方法主要存在如下问题：(1)考虑分析物为内源性物质，因此不存在无分析物的生物基质，用于构建标准曲线的纯溶液或人工基质可能无法确保对标准样品和研究样品中存在的同等浓度的分析物产生相同的质谱响应；(2)用于确定基质效应的背景扣除法可能不适用于人血浆中具有较高浓度的内源性代谢物；(3)采用固相萃取或真空吹干复溶的样品制备方法对于高通量检测而言是复杂且耗时的；(4)已报道的分析方法多需要较高血浆消耗量或较长的分析时间来实现色氨酸代谢物的定量分析，且同时可准确定量色氨酸代谢物较少，从而不能更好的考察色氨酸代谢通路中的多个代谢物与机体健康状况的关联。这些方法不仅工作效率低，而且加大了对样本的需求量，不适用于临床大规模样本检测。
因此，本技术领域亟需开发基于具有高灵敏度，准确度，稳定性的液相色谱串联质谱技术的方法及其检测试剂盒，用于同时检测人血浆色氨酸及其下游代谢物浓度，有助于相关疾病的诊治、病情检测等工作的开展，同时为日后研究药物对基于色氨酸代谢通路关联的相关疾病的作用机制提供分析方法和试剂盒。
发明内容
本发明的目的是针对现有的色氨酸代谢物检测方法存在的检测代谢物种类较少、耗时长、耗血量高，前处理繁琐等不足，提供一种可以检测人体血浆色氨酸及其代谢物的准确、方便和高通量的试剂盒和方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于超高效液相色谱串联质谱法同时检测生物样本中色氨酸及其代谢物的试剂盒，包括色氨酸及其代谢物的标准品，其中，所述色氨酸及其代谢物包括：3-羟基犬尿氨酸(3-HK)、5-羟色胺(5-HT)、犬尿氨酸(KYN)、黄尿酸(XA)、色氨酸(TRP)、犬尿喹啉酸(KYNA)、3-羟基邻氨基苯甲酸(3-HAA)、5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)、3-吲哚乙酸(IAA)和3-吲哚丙酸(IPA)。
在本发明的一些实施方案中，所述标准品为所述色氨酸及其代谢物的标准品的混合标准品。
在本发明的一些实施方案中，所述色氨酸及其代谢物的标准品利用甲醇(色谱级)，二甲基亚砜(DMSO，分析纯)或超纯水作为配制溶液。在本发明的一些具体实施方案中，所述色氨酸及其代谢物的标准品的配制方法如下：精密称取上述10个标准品，加甲醇配制5-HT(0.1mg/mL)、KYN(1mg/mL)、TRP(2mg/mL)、3-HAA(0.1mg/mL)、5-HIAA(1mg/mL)、IPA(1mg/mL)、IAA(1mg/mL)的储备液。加DMSO/甲醇(1：9，v/v)配制KYNA(0.1mg/mL)的储备液。优选加水/甲醇(9：1，v/v)配制3-HK(0.1mg/mL)和XA(0.1mg/mL)的储备液，保存于-80℃条件下。
优选地，将每种储备溶液的等分试样混合并用乙腈连续稀释成8个不同浓度的标准品溶液。
3-HK：15、30、75、150、300、750、1500、3000ng/mL；
5-HT：7.5、15、37.5、75、150、375、750、1500ng/mL；
KYN：125、250、625、1250、2500、6250、12500、25000ng/mL；
XA：5、10、25、50、100、250、500、1000ng/mL；
TRP：500、1000、2500、5000、10000、25000、50000、100000ng/mL；
KYNA：25、50、125、250、500、1250、2500、5000ng/mL；
3-HAA：10、20、50、100、200、500、1000、2000ng/mL；
5-HIAA：12.5、25、62.5、125、250、625、1250、2500ng/mL；
IPA和IAA：50、100、250、500、1000、2500、5000、10000ng/mL。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括内标准品。在本发明的一些具体实施方案中，所述内标准品包括色氨酸-d5和卡马西平。在本发明的一些优选实施方案中，所述内标准品的制备方法如下：精密称取色氨酸-d5和卡马西平，加甲醇分别配制成200μg/mL和100μg/mL的储备液作为内标物，将两个内标物储备液用甲醇最终稀释至含20μg/mL色氨酸-d5和1μg/mL卡马西平的混合内标溶液，保存于-80℃条件下。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括洗脱液A和洗脱液B，其中，洗脱液A为0.1％甲酸水溶液(v/v)；洗脱液B为100％乙腈。
在本发明中，所述生物样本选自血浆样本、血清样本和/或尿液样本。
在本发明的一些实施方案中，所述生物样本为血浆样本。进一步地，所述试剂盒还包括蛋白沉淀液，优选地，所述蛋白沉淀液为乙腈。
更进一步地，所述试剂盒还包括质控品。所述质控品的制备方法为：在空白血浆基质溶液中加入所述色氨酸及其代谢物的标准品溶液，优选配制成定量下限、低、中和高浓度的LLOQ、LQC、MQC和HQC。
LLOQ：准确移取含有所述色氨酸及其代谢物的最低定量下限的混合标准品工作液10μL，用稀释液稀释至50μL；
LQC：准确移取含有所述色氨酸及其代谢物的第二个标准浓度的混合标准品工作液10μL，用稀释液稀释至50μL；
MQC：准确移取含有所述色氨酸及其代谢物的对应于50％的分析物标准范围的混合标准品工作液10μL，用稀释液稀释至50μL；
HQC：准确移取含有所述色氨酸及其代谢物的对应于75％的最高标准浓度的混合标准品工作液10μL，用稀释液稀释至50μL。
其中，所述空白血浆基质溶液的配制方法如下：取1g活性炭加入10mL健康人血浆中，4℃下用试管翻转器旋转6小时。于4℃下，16,128×g离心20分钟后，取上清液，再经由0.22μm微孔滤膜过滤2次，得到的上清液即为空白血浆基质溶液，作为稀释液用于稀释配制上述质控品。
本发明的第二方面提供一种基于超高效液相色谱串联质谱法同时检测生物样本中色氨酸及其代谢物的方法，包括以下步骤：
利用超高效液相色谱仪的流动相及色谱柱对生物样本进行洗脱分离，利用质谱仪对色氨酸及其代谢物的母离子-子离子对进行扫描，获得分析物的峰面积，以各分析物浓度为X轴，以分析物响应峰面积与内标响应峰面积比值为Y轴，建立标准曲线，计算所述色氨酸及其代谢物的含量，其中，所述色氨酸及其代谢物包括3-羟基犬尿氨酸、5-羟色胺、犬尿氨酸、黄尿酸、色氨酸、犬尿喹啉酸、3-羟基邻氨基苯甲酸、5-羟基吲哚乙酸、3-吲哚乙酸和3-吲哚丙酸。
在本发明的一些实施方案中，所述方法的具体步骤包括：
S1，获得待测生物样本；
S2，色谱分离：将步骤S2获得的生物样本利用色谱柱进行梯度洗脱，洗脱液A为0.1％甲酸水溶液(v/v)，洗脱液B为100％乙腈；
S3，质谱检测：选择正离子电喷雾电离模式，离子源参数分别为：毛细管电压为2.24kV；溶剂气体温度为450℃；锥/去溶剂化气体流速为150/900L/h进行检测。
在本发明的一些实施方案中，在步骤S1中，进一步包括对样本进行预处理的步骤：将生物样本使用乙腈除去蛋白，取上清液进行下一步操作。在本发明的具体实施方案中，所述预处理的步骤包括：取生物样本置于EP管中，加入混内标溶液，再加入冰冷的乙腈沉淀蛋白，涡旋混合后，于-20℃下放置使蛋白沉淀完全。于4℃，16,128×g下离心，取上清液到96孔板中，进样检测。
在本发明的一些实施方案中，在步骤S1中，色谱柱的型号为：Waters AcquityUPLC HSS T3反相色谱柱(3.0mm×100mm，1.8μm)。
在本发明的一些实施方案中，在步骤S1中，流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：2μL。
在本发明的一些实施方案中，所述梯度洗脱的具体程序如下表所示：
Figure BDA0003121814480000061
在本发明的一些实施方案中，利用三重四极质谱仪进行质谱检测。
在本发明的一些具体实施方案中，质谱条件如下：
(1)离子源：电喷雾电离
(2)离子源参数：毛细管电压，2.24kV；去溶剂气体温度，450℃；锥/去溶剂化气体(氮气)流速，150/900L/h。
在本发明中，离子源参数可根据实际仪器型号不同而有所不同。
(3)扫描模式：正离子多反应模式监测(MRM)分析，母离子→子离子通道分别选择为：
3-HK：225.07→110.06；
5-HT：177.00→160.00；
KYN：209.10→94.07；
XA：206.00→159.99；
TRP-d5：210.08→192.20；
TRP：205.13→145.97；
KYNA：190.00→143.99；
3-HAA：154.00→108.00；
5-HIAA：192.04→146.02；
IAA：176.04→130.02；
IPA：190.04→130.03；
CAR：237.20→194.20。
在本发明的一些实施方案中，所述色氨酸及其代谢物的质谱参数如下表所示：
Figure BDA0003121814480000071
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)利用本发明，通过特异的梯度洗脱程序以及双内标定量方法，选择性、线性、精密度、准确度、基质效应，回收率和稳定性均满足定量分析要求。
(2)本发明所述方法使用超高效液相色谱串联质谱仪进行检测，相较背景技术所阐述的已报道方法，前处理操作简便，血浆消耗量低，5min可实现血浆中色氨酸及其9个代谢物的定量分析，使临床检测更加简便快捷，具有高通量的优势，有利于大样本量的测定。
(3)本发明所述试剂盒提供的稀释液通过活性炭吸附法获得无分析物的血浆以去除生物基质中的内源性干扰，使稀释液中分析物的质谱响应更接近原生物基质，提高定量分析结果的准确性并用于构建标准曲线、方法验证和临床应用。
附图说明
图1示出了血浆中色氨酸及其9个代谢物、2个内标物的色谱图。
图2示出了色氨酸及其9个代谢物、2个内标物的质谱图。
图3示出了100个健康人的色氨酸及其9个代谢物的血浆直方分布图。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中未作具体说明的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例 超高效液相色谱串联质谱法同时检测血浆中色氨酸及其代谢物的方法和试剂盒的操作方法
一、仪器、试剂、标准品和内标
(1)仪器：ACQUILY UPLC超高效液相色谱仪(Waters，美国)，Xevo TQ-S三重四极质谱仪(Waters，美国)，高速冷冻离心机(Allegra X-30R，Beckman Coutler，德国)，超纯水仪(EMD Millipore，Billerica，美国)，旋涡仪(其林贝尔仪器制造公司，中国)等。
(2)试剂：活化炭(100目粒径)购自Sigma-Aldrich。色谱级甲醇和乙腈购自ThermoFisher Scientific(Waltham，MA，USA)，色谱级甲酸购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)，超纯水为自制。
(3)标准品：L-色氨酸(99％，纯度)，3-吲哚丙酸(98％，纯度)，3-吲哚乙酸(99％，纯度)和5-羟色胺(97.5％，纯度)购自J&K Scientific(中国北京)。L-犬尿氨酸(>98％，纯度)和黄尿酸(96％，纯度)购自Aladdin(中国上海)。犬尿喹啉酸(99％，纯度)和3-羟基犬尿氨酸(99％，纯度)购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。5-羟基吲哚乙酸(>98.0％，纯度)购自Tokyo Chemical Industry(Tokyo，Japan)。3-羟基邻氨基苯甲酸(>98.0％，纯度)购自Macklin(中国上海)。
(4)内标：L-色氨酸-d5(98％，纯度)和卡马西平(99.7％，纯度)购自TorontoResearch Chemicals(Toronto，Canada)和中国药品检验所(中国北京)。
二、储备溶液、混合标准品溶液、质控品和混合内标溶液的制备
(1)储备液的制备
精密称取3-羟基犬尿氨酸(3-HK)、5-羟色胺(5-HT)、犬尿氨酸(KYN)、黄尿酸(XA)、色氨酸(TRP)、犬尿喹啉酸(KYNA)、3-羟基邻氨基苯甲酸(3-HAA)、5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)、3-吲哚乙酸(IAA)、3-吲哚丙酸(IPA)对照品后，加甲醇配制5-HT(0.1mg/mL)、KYN(1mg/mL)、TRP(2mg/mL)、3-HAA(0.1mg/mL)、5-HIAA(1mg/mL)、IPA(1mg/mL)和IAA(1mg/mL)的储备液；加DMSO/甲醇(1：9，v/v)配制KYNA(0.1mg/mL)的储备液；加水/甲醇(9：1，v/v)配制3-HK(0.1mg/mL)和XA(0.1mg/mL)的储备液，保存于-80℃条件下。
(2)混合标准品溶液的制备
将每种储备溶液的等分试样混合并用乙腈连续稀释成8个浓度梯度的混合标准品溶液。3-HK：15、30、75、150、300、750、1500、3000ng/mL；5-HT：7.5、15、37.5、75、150、375、750、1500ng/mL；KYN：125、250、625、1250、2500、6250、12500、25000ng/mL；XA：5、10、25、50、100、250、500、1000ng/mL；TRP：500、1000、2500、5000、10000、25000、50000、100000ng/mL；KYNA：25、50、125、250、500、1250、2500、5000ng/mL；3-HAA：10、20、50、100、200、500、1000、2000ng/mL；5-HIAA：12.5、25、62.5、125、250、625、1250、2500ng/mL；IPA和IAA：50、100、250、500、1000、2500、5000、10000ng/mL。保存于-80℃条件下。
(3)质控品的制备
在空白血浆基质溶液中加入上述10个混合标准品溶液，配制成最低定量下限、低、中、高浓度的LLOQ，LQC，MQC，HQC。
LLOQ：准确移取含有10个分析物的最低定量下限的混合标准品工作液10μL，用稀释液稀释至50μL；
LQC：准确移取含有10个分析物的第二个标准浓度的混合标准品工作液10μL，用稀释液稀释至50μL；
MQC：准确移取含有10个分析物的对应于50％的分析物标准范围的混合标准品工作液10μL，用稀释液稀释至50μL；
HQC：准确移取含有10个分析物的对应于75％的最高标准浓度的混合标准品工作液10μL，用稀释液稀释至50μL。
(4)混合内标溶液的制备
精密称取色氨酸-d5和卡马西平对照品后，加甲醇分别配制成200μg/mL和100μg/mL的储备液。
将两个内标储备液用甲醇最终稀释至含20μg/mL色氨酸-d5和1μg/mL卡马西平的混合内标溶液，保存于-80℃条件下。
三、空白血浆基质的制备
取1g活性炭加入10mL健康人血浆中，4℃下用试管翻转器旋转6小时。于4℃下，16,128×g离心20分钟后取上清液，再经由0.22μm微孔滤膜过滤2次，得到的上清液即为稀释液。
四、血浆样品预处理
取50μL的血浆置于1.5mL EP管中，加入10μL混合内标溶液，再加入150μL冰冷的乙腈沉淀蛋白，涡旋混合4min后，于-20℃下放置10min使蛋白沉淀完全。于4℃，16,128×g下离心20min，取上清液100μL到96孔板中，进样检测。
五、色谱条件
(1)流动相A：0.1％甲酸水溶液，v/v，甲酸纯度为色谱纯；
(2)流动相B：100％乙腈，纯度为色谱纯；
(3)色谱柱型号：Waters Acquity UPLC HSS T3反相色谱柱(3.0mm×100mm，1.8μm)；
(4)流速：0.3mL/min；
(5)柱温：30℃；
(6)进样量：2μL；
(7)洗脱方式：梯度洗脱，具体程序如表1所示。
表1 梯度洗脱程序
Figure BDA0003121814480000121
检测得到的色谱图如图1所示，结果显示的是血浆中色氨酸及其9个代谢物，2个内标物在本方法的色谱条件中的图谱，所有化合物已获得最佳的对称峰和分离度。。
六、质谱条件
(1)离子源：电喷雾电离
(2)离子源参数：毛细管电压，2.24kV；去溶剂气体温度，450℃；锥/去溶剂化气体(氮气)流速，150/900L/h。
(3)扫描模式：正离子多反应模式监测(MRM)分析，母离子→子离子通道分别选择为3-HK：225.07→110.06；5-HT：177.00→160.00；KYN：209.10→94.07；XA：206.00→159.99；TRP-d5：210.08→192.20；TRP：205.13→145.97；KYNA：190.00→143.99；3-HAA：154.00→108.00；5-HIAA：192.04→146.02；IAA：176.04→130.02；IPA：190.04→130.03；CAR：237.20→194.20。
(4)质谱参数：12个化合物的质谱参数如表2所示。
表2 色氨酸及其代谢物和2个内标的采集离子对及质谱参数
Figure BDA0003121814480000122
Figure BDA0003121814480000131
检测得到的质谱图如图2所示。结果显示，12个化合物的质谱检测均在正离子模式下进行，经优化12个化合物的母离子→子离子对，获得各个化合物最佳的质谱响应。
实施例2 实施例1建立的方法的选择性验证
通过分析来自6个不同个体来源的空白血浆与最低定量下限的分析物和内标物出峰处的响应来检测实施例1建立的方法的选择性。
结果显示，空白血浆分析物的峰面积不超过最低定量下限的20.0％而且内标物不超过5.0％，表明不存在干扰成分，本发明方法的选择性良好。
实施例3 实施例1建立的方法的线性验证
以8个分析物的质量浓度为横坐标x，分析物与内标物峰面积的比值为纵坐标y，用加权最小二乘法进行线性回归分析(权重系数为1/x2)，选择含有色氨酸-d5和卡马西平作为混合内标溶液。根据两个内标与分析物在本发明方法中的色谱行为和电离效率，色氨酸-d5作为犬尿氨酸和色氨酸的内标，卡马西平作为其他分析物的内标，并运用双内标法计算血浆中色氨酸及其代谢物的浓度。
结果显示，10个分析物在以下范围内线性较好，相关系数(r2)>0.99，满足定量要求。3-HK：3-600ng/mL；5-HT：1.5-300ng/mL；KYN：25-5000ng/mL；XA：1-200ng/mL；TRP：100-20,000ng/mL；KYNA：5-1000ng/mL；3-HAA：2-400ng/mL；5-HIAA：2.5-500ng/mL，IAA和IPA：10-2000ng/mL。
实施例4 实施例1建立的方法的精密度和准确度试验
按照实施例1的方法配制含10个分析物的最低定量限、低、中，高4个浓度的质控品，按“血浆样品预处理”项操作。每种质量浓度平行制备6份样品，每批均随行一条标准曲线，连续测定3天。根据当日的标准曲线，计算质控样品的测定浓度，并通过计算测量值的相对标准偏差(RSD％)和相对误差(RE％)判定精密度和准确度。结果显示：LLOQ的日内和日间精度(％RSD)和准确度(％RE)在20％以内，其他三个QC水平均在15％以内，测定结果见表3。
表3 色氨酸及其代谢物的日内精密度、日间精密度及准确度
Figure BDA0003121814480000141
Figure BDA0003121814480000151
实施例5 基质效应和回收率试验
按照实施例1的方法配制含10个分析物的低、中，高3个浓度的质控品，按“血浆样品预处理”项操作，得到峰面积A；将空白血浆按“血浆样品预处理”进行前处理，取上清液，分别加入含10个分析物的低、中、高3种浓度的混合标准品溶液，加入混合内标溶液，涡旋混匀后，进样分析得峰面积B；配制含10个分析物的低、中、高3种浓度的混合标准品溶液，溶剂为含40％的乙腈溶液，加入混合内标工作液，进样分析得到峰面积C。
基质效应＝B/C×100％
绝对提取回收率＝C/B×100％
相对提取回收率＝A/B×100％
结果显示：发明人先使用活性炭吸附制得的空白血浆作为模拟实际生物样本的替代基质，来自6个不同来源的血浆样品中观察到血浆中两个内标TRP-d5和CAR的基质效应分别为109.86％和108.44％，分析物的基质效应在86.57％-109.95％范围内，除了3-HK的HQC观察到轻微的离子抑制现象(基质效应为83.60％)，3-HAA的LQC中观察到离子增强现象(基质效应为128.17％)。然而如先前研究，健康人血清中正常的3-HK浓度接近4.79ng/mL。而且在本发明方法中3-HAA中观察到的离子增强现象是恒定的(在6种不同的空白血浆源中相对标准偏差为4.02％)。然而这些离子抑制或者增强现象不会影响本发明方法的精确度和准确度，同时本发明方法的基质效应也不会影响实际血浆样品中两种分析物的定量，说明空白血浆基质溶液可以代替人血浆作为基质来配制质控品和构建标准曲线。
血浆中10种分析物的相对回收率为68.65％～100.72％，绝对回收率为57.39％～106.84％，两个内标TRP-d5和CAR在血浆中的相对回收率分别为76.76％±3.41％和75.70％±5.61％，绝对回收率分别为84.32％±3.86％和82.11％±6.76％，表明本发明方法的前处理方法适用于生物样品的测定。基质效应和回收率的测定结果见表4。
表4 色氨酸及其代谢物的基质效应、绝对回收率及相对回收率
Figure BDA0003121814480000161
Figure BDA0003121814480000171
实施例6 稳定性试验
配制低、中，高三种浓度的质控样品，分别按“血浆样本处理”项下处理样本，考察室温放置3.5h，进样器内放置12h，24h内反复冻融三次的稳定性，每个质控品平行6次。结果显示10个分析物在不同条件下浓度偏差小于15％。说明在测定和储存条件下稳定，测定结果见表5。
表5 色氨酸及其代谢物的稳定性
Figure BDA0003121814480000172
Figure BDA0003121814480000181
实施例7 血浆样品检测
图3是测定100个正常人血浆中色氨酸及其代谢物浓度所得到的直方分布图，测得的浓度与文献报道(Henykova,E.,et al.,Stable isotope dilution ultra-highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry quantitativeprofiling of tryptophan-related neuroactive substances in human serum andcerebrospinal fluid.J Chromatogr A,2016.1437:p.145-157.；Amirkhani,A.,et al.,Quantitation of tryptophan,kynurenine and kynurenic acid in human plasma bycapillary liquid chromatography-electrospray ionization tandem massspectrometry.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2002.780(2):p.381-7.)参考值范围基本一致，说明本发明方法测定结果准确，具有可比性。同时本发明方法除了适用于血浆中色氨酸及其代谢物的检测外，也适用于血清，尿液等其它体液中色氨酸等代谢物的检测，具有普适性。
实施例2：试剂盒组成，配方和规格
Figure BDA0003121814480000191
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种基于超高效液相色谱串联质谱法同时检测生物样本中色氨酸及其代谢物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括色氨酸及其代谢物的标准品，其中，所述色氨酸及其代谢物包括：3-羟基犬尿氨酸、5-羟色胺、犬尿氨酸、黄尿酸、色氨酸、犬尿喹啉酸、3-羟基邻氨基苯甲酸、5-羟基吲哚乙酸、3-吲哚乙酸和3-吲哚丙酸。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品为所述色氨酸及其代谢物的标准品的混合标准品。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括内标准品。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内标准品包括色氨酸-d5和卡马西平。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述试剂盒还包括洗脱液A和洗脱液B，其中，洗脱液A为0.1％甲酸水溶液(v/v)；洗脱液B为100％乙腈。
6.一种基于超高效液相色谱串联质谱法同时检测生物样本中色氨酸及其代谢物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用超高效液相色谱仪的流动相及色谱柱对生物样本进行洗脱分离，利用质谱仪对色氨酸及其代谢物的母离子—子离子对进行扫描，获得分析物的峰面积，以各分析物浓度为X轴，以分析物响应峰面积与内标响应峰面积比值为Y轴，建立标准曲线，计算所述色氨酸及其代谢物的含量，其中，所述色氨酸及其代谢物包括3-羟基犬尿氨酸、5-羟色胺、犬尿氨酸、黄尿酸、色氨酸、犬尿喹啉酸、3-羟基邻氨基苯甲酸、5-羟基吲哚乙酸、3-吲哚乙酸和3-吲哚丙酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤包括：
S1，获得待测生物样本；
S2，色谱分离：将步骤S2获得的生物样本利用色谱柱进行梯度洗脱，洗脱液A为0.1％甲酸水溶液(v/v)，洗脱液B为100％乙腈；
S3，质谱检测：选择正离子电喷雾电离模式，离子源参数分别为：毛细管电压为2.24kV；溶剂气体温度为450℃；锥/去溶剂化气体流速为150/900L/h进行检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，进一步包括对样本进行预处理的步骤：将生物样本使用乙腈除去蛋白，取上清液进行下一步。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体程序如下表所示：
Figure FDA0003121814470000021
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述色氨酸及其代谢物的质谱参数如下表所示：
Figure FDA0003121814470000022
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