CN106370744A - 8‑羟基脱氧鸟苷作为尿液标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供8‑羟基脱氧鸟苷作为尿液检测标志物的应用,所述的8‑羟基脱氧鸟苷的分子式:C10H13O5N5。本发明在检测中,其标本的采集具有无创性,获取容易,获取量多等优点,且相较于FOBT试验更易被检测者接受,可减少工作人员的精神负担,让普通大众更易接受,利用优化的离线固相萃取术联合超高效液相色谱串联质谱的方法来精确定量被测试者尿液中的DNA氧化损伤标志物8‑羟基脱氧鸟苷浓度,通过建立的结直肠癌发病预测模型对被测试者进行发病风险分析。采用本发明的尿液标志物进行筛查结直肠癌具有无创、快速、高通量等特点,检测方法不仅适用于结直肠癌早期的检测,也可用于结直癌转移非转移的检测,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域,涉及恶性肿瘤检测技术,尤其涉及一种结直肠癌早期筛查用尿液标志物及其应用,是一种新的非侵入性筛查方法,在体外对结直肠癌进行早期发现与检测。
背景技术
结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤,是近年来发病率上升最快的肿瘤之一。在世界范围内的发病率男性为第三位,女性为第二位。随着经济的发展、生活水平的提高和生活方式的改变,其发病率还将呈不断上升的趋势。尽管近年来结直肠癌的诊断和治疗有了很大的进步,但结直肠癌的总体疗效并无明显改善,这主要是由于目前到医院就诊的患者中,一大半已为晚期。而早期结直肠癌患者预后较好,手术后5年生存率可高达90%以上,而晚期则不足10%。早发现、早诊断和早治疗是结直肠癌的重要防治策略之一。但是处在早期时,患者通常无明显症状,也不会来医院就诊。目前,结直肠癌的早期诊断率非常低,提高其早期诊断率将显著提升结直肠癌的总体治疗效果。
目前,我国结直肠癌的筛查主要是运用序贯筛查法,即采用高危因素问卷调查配合粪便潜血检测(FOBT)。问卷调查阳性或者FOBT阳性的筛查人群,接受肠镜检查。但粪便潜血漏检率很高,而且不是所有出血者都是结直肠癌,假阳性的出现会增加受检个体接受结肠镜等检查的痛苦。此外,粪便会对测试人员造成视觉和心理上的负担。
相对于粪便而言,尿液相对容易被检测人员接受,此外,与血清等其它生物基质相比,尿液具有无创采样、易于获得大体积样本的特点,非常适合大量样本的临床研究和实践。因而,开发基于尿液样本的结直肠癌早期筛查方法,不仅能减轻群众的检查痛苦,也将有助于结直肠癌的早期精准发现和诊断。
尿液中含有大量的无机盐,如钠离子,钾离子,氯离子,固相萃取技术能有效地对尿液样本进行脱盐,浓缩和富集。超高效液相色谱质谱联用技术结合了色谱强大的分离能力和质谱优异的定量和结构鉴定功能,被广泛应用于化学、生命科学、医疗卫生等众多领域。
8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG),来源于活性氧物种如羟基自由基攻击DNA链中鸟嘌呤碱基第8位碳原子所生成的产物,通常被用来评估生物体DNA氧化损伤的程度。损伤的DNA在经过一系列的修复机制后,8-羟基脱氧鸟苷被从DNA链上切除下来,并最终***到尿液中。
发明内容
本发明的目的是提供一种8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)作为尿液检测标志物的应用,所述的8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的分子式:C10H13O5N5,结构式:
本发明8-羟基脱氧鸟苷作为标志物的应用,通过以下步骤实现:
1.样品的预处理:将待测的尿液样本保存于-80℃冰箱中,实验前取出于4℃下解冻,离心后取0.5ml上清液加0.5ml水稀释,并加入10pmol同位素内标[15N5]8-OHdG,所述的固相萃取为向HLB Oasis柱子中加入1.0ml甲醇进行活化,再加入1.0ml水进行平衡,再加入尿液样本,随后用1.0ml 5%甲醇进行清洗,最后用1.0ml 50%甲醇进行洗脱,收集洗脱液并用真空离心机干燥,随后加0.2ml水复溶待测;
2.经固相萃取前处理后的尿液利用液相色谱进行分离:为使尿液样本中的复杂组分尤其是鸟苷能尽可能地与8-羟基脱氧鸟苷分离,所用的色谱条件是:色谱柱为WatersBEH C18柱(1.7μm,2.1×100mm),柱温为40℃,流动相为0.1%乙酸水溶液-甲醇(92.5:7.5,V/V),流速为0.25mL/min,上样量为5微升,随后将分离后的目标物引入质谱中进行定量检测;
3.利用质谱进行目标物的定量:所述质谱扫描方式为多反应监测,所述的质谱检测相关参数,离子源温度设定为550℃,喷雾电压设定为5.5kv,离子源气体1为60psi,离子源气体2为40psi,气帘气为35psi,8-羟基脱氧鸟苷的定量离子对为m/z 284.1>168.0,定性离子对为m/z 284.1>117.0,同位素内标[15N5]8-OHdG的定量离子对m/z 289.1>173.0,碰撞能量分别为18V,22V和18V,解簇电压为45V;驻留时间为150ms。
通过配制1nM-300nM范围不同浓度的标准品,绘制标准曲线,得到线性方程为y=0.0278x+0.0515,所述的x代表8-羟基脱氧鸟苷的浓度,所述的y代表8-OHdG/[15N5]8-OHdG质谱峰面积比。通过测得的质谱峰面积来计算尿液中8-羟基脱氧鸟苷浓度。
8-OHdG是一种内源性的诱变剂,具有突变倾向,导致DNA复制过程中碱基错配,诱发DNA突变,为一种反应致突变和癌变危险的很好的标记物。它作为内源性及外源性因素对DNA氧化损伤作用的生物标志物,是一个极有前途的指标。通过8-OHdG的检测可以评估体内氧化损伤的程度,氧化应激与DNA损伤的相互关系。8-OHdG在体内稳定存在,为代谢的终产物,不会被生物体再次利用。并且尿液中8-OHdG的含量比较稳定,不受饮食、细胞更新等外界条件的影响。
本发明的检测方法应用于早期结直肠癌信息预警,从被测试者的尿液样品中检测8-羟基脱氧鸟苷,所述的8-羟基脱氧鸟苷通过固相萃取进行前处理,随后用液相色谱质谱联用技术进行定量检测。根据尿液8-羟基脱氧鸟苷浓度和年龄建立结直肠癌发病风险预测模型对被测试者进行结直肠癌发病风险分析,从而实现结直肠癌无创型的早期筛查。发病概率计算公式:
当尿液8-羟基脱氧鸟苷浓度大于等于或小于1.5nmol/mmol肌酐时,grade ofurinary8-OHdG值分别为1和0。当计算出的概率值大于0.5时,表明其结直肠癌发病风险高于概率值小于0.5的人群。建立了logistic回归模型并进行了ROC曲线分析,得到的曲线下面积值为0.853,表明该模型对结直肠癌的发病风险有着很好的预测效果。
本发明提供的检测方法,其标本的采集具有无创性,获取容易,获取量多等优点,且相较于FOBT试验更易被检测者接受,不仅可以减少工作人员的精神负担,还会让普通大众更易接受,利用优化的离线固相萃取术联合超高效液相色谱串联质谱的方法来精确定量被测试者尿液中的DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)浓度,通过建立的结直肠癌发病预测模型对被测试者进行发病风险分析。为结直肠癌的早期发现与诊断提供一个有意义的新的筛查检测手段。本发明根据被测试者尿液中目标物8-羟基脱氧鸟苷浓度的检测,由此来预测结直肠癌的发病风险。
本发明运用固相萃取技术对尿液样本进行前处理,随后运用超高效液相色谱技术对尿液样本进行分离,然后进到线性离子阱串联三重四级杆质谱中进行定量检测。本发明将尿液8-羟基脱氧鸟苷作为一种无创型液体标志物,成功应用到结直肠癌的早期筛查中。
与现有的结直肠癌标志物及其检测方法相比,本发明具有以下的优点:
1.本发明的检测标本为尿液,相对于血液、唾液、痰液及粪便等其他标本,其标本的收集简便,收集量大,非常适合大量样本的临床研究与实践;相较于血液样本其采集无创;相较于肠镜检查,群众更易接受,配合程度更高,对于筛查工作的顺利开展获益更大;相较于痰液、粪便标本其在生物性状上更易为检查工作人员生理以及心理上所接受,更具人文情怀。
2.与以往的血液标志物相比,尿液检测的8-羟基脱氧鸟苷在体内稳定存在,为代谢的终产物,而且只能通过DNA氧化损伤形成,故其定量检测更能准确反映结直肠癌的发病风险。
3.血液,粪便等其它体液标本易受饮食等外在条件的影响,假阳性率与假阴性率较高,而尿液8-羟基脱氧鸟苷则很好地避免了这一难点,其不受饮食等的影响,故检测真阳性率高,假阳性率低。
4.与以往检测方法相比,本发明提供的超高效液相色谱串联质谱的方法来检测尿液中标志物,其具有很很高的灵敏度,测量小分子化合物精确度与准确度高,分析时间短,通量高,方法重现性好。
附图说明
图1:流动相添加剂乙酸、甲酸、碳酸氢铵对8-羟基脱氧鸟苷的质谱检测灵敏度的影响(流动相包括流动相A与流动相B,B为纯的乙醇,等梯度洗脱模式为92.5%A与7.5%B,速率为0.25ml/min,8-羟基脱氧鸟苷浓度为20nM,进样量为5.0ul)。
图2:流动相添加剂甲酸铵、pH 3.5的甲酸铵/甲酸、pH 9.5的甲酸铵/氨水对8-羟基脱氧鸟苷的质谱检测灵敏度的影响(流动相包括流动相A与流动相B,B为纯的乙醇,等梯度洗脱模式为92.5%A与7.5%B,速率为0.25ml/min,8-羟基脱氧鸟苷浓度为20nM,进样量为5.0ul)。
图3:流动相添加剂乙酸铵、pH 5.0的乙酸铵/乙酸、pH 9.0的乙酸铵/氨水对8-羟基脱氧鸟苷的质谱检测灵敏度的影响(流动相包括流动相A与流动相B,B为纯的乙醇,等梯度洗脱模式为92.5%A与7.5%B,速率为0.25ml/min,8-羟基脱氧鸟苷浓度为20nM,进样量为5.0ul)。
图4:超高效液相色谱串联质谱法鉴定尿液样本中的8-羟基脱氧鸟苷。
图5:人尿液样本中8-羟基脱氧鸟苷的定量与统计学分析;其中a:142例健康志愿者以及84例大肠癌患者的尿液中8-羟基脱氧鸟苷的含量,b:大肠癌I到IV期患者的尿液中8-羟基脱氧鸟苷的含量,c:大肠癌I、II期未发生转移的患者与III、IV期发生转移的患者尿液中8-羟基脱氧鸟苷的含量,d:尿液中8-羟基脱氧鸟苷的ROC曲线分析。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
本发明中,提供的用于测定的8-羟基脱氧鸟苷的体液标本为尿液。
A.步骤A所述的为测定前的尿液样品的预处理,先将尿液于4摄氏度下以13000r/min离心15min后取上清液0.5ml,用水稀释至1ml,所述的稀释液加入同位素内标10pmol。
B.步骤B所述的为对尿液进行固相萃取前处理。所述的固相萃取为向HLB Oasis柱子中加入1.0ml甲醇进行活化,再加入1.0ml水进行平衡,再加入尿液样本。随后先用1.0ml5%甲醇进行清洗,最后用1ml 50%甲醇进行洗脱。收集洗脱液并用真空离心机干燥,随后加0.2ml水复溶待测。
C.步骤C所述为将前处理后待测的尿液应用超高效液相色谱法进行分离。本发明中的超高效液相色谱分离方法的色谱柱为Waters BEH C18柱(1.7μm,2.1×100mm);柱温为40℃;流动相为0.1%乙酸水溶液-甲醇(92.5:7.5,V/V);流速为0.25mL/min;上样量为5微升。
其中0.1%乙酸在电喷雾电离过程中有利于[8-OHdG+H]+离子的形成,抑制8-OHdG与金属离子形成络合物。申请人还选用了其它溶液如0.1%甲酸;2mM碳酸氢铵;2mM甲酸铵;2mM甲酸铵/甲酸,pH 3.5;2mM甲酸铵/氨水,pH 9.5;2mM醋酸铵;2mm醋酸铵/醋酸,pH5;2mM醋酸铵/氨水,pH 9,结果显示,在电喷雾电离过程中这些流动相会促进[8-OHdG+Na]+和[8-OHdG+K]+离子的形成,而抑制了[8-OHdG+H]+离子的生成。因此,本发明使用的流动相0.1%乙酸水溶液-甲醇(92.5:7.5,V/V),可以使8-羟基脱氧鸟苷的信号响应强度提高2.7-5.3倍。
D.步骤E所述的为将步骤C中的分离出的目标物引入质谱中进行检测,本发明中质谱检测方法为多反应监测,所述的质谱检测相关参数为:离子源温度设定为550℃,喷雾电压设定为5.5kv,离子源气体1为60psi,离子源气体2为40psi,气帘气为35psi。8-羟基脱氧鸟苷的定量离子对为m/z 284.1>168.0,定性离子对为m/z 284.1>117.0,同位素内标[15N5]8-OHdG的定量离子对m/z 289.1>173.0,碰撞能量分别为18V,22V和18V,解簇电压为45V;驻留时间为150ms。
E.由步骤E最后的得到的质谱峰面积来计算尿液中8-羟基脱氧鸟苷浓度,标准曲线线性方程为y=0.0278x+0.0515,所述的x代表8-羟基脱氧鸟苷的浓度,所述的y代表8-OHdG/[15N5]8-OHdG质谱峰面积比。得到的浓度值与阈值1.5nmol/mmol肌酐水平进行比较,高于阈值水平的被测试者被认为其患结直肠癌的风险是低于阈值水平的被测试者的3.68倍。同时,根据8-羟基脱氧鸟苷浓度值与年龄计算发病概率,概率值大于0.5的被测试者被认为是具有较高的结直肠癌发病风险。概率计算公式为:
本发明中,阈值水平的设定为84例结直肠癌患者与142例未发生结直肠癌的正常个体所测得的8-羟基脱氧鸟苷浓度值的统计分析学结果。
F.超高效液相色谱质谱联用技术方法学评估:精密度是通过测量日内与日间差异的相对标准误差来评估的,所述的日内精密度为1.0%至1.9%,所述的日间精密度为0.9%至1.4%。准确度为98.0%至101.7%,都在可接受的范围内。基质效应通过斜率比值考察,其为91.5%,所述的斜率值表明基质效应的影响是可以忽略的。
G.本发明的产业实用性:根据本发明所提供的筛查结直肠癌的方法,能够通过尿液中8-羟基脱氧鸟苷的浓度来预测检测者患结直肠癌的风险,能够依此采取相关手段进行早期干预,从而阻止结直肠癌的进展,提高了我国了卫生经济水平,因此该发明是有效的。
实施例2
试验例1(应用固相萃取技术、超高效液相色谱串联质谱术来检测正常人尿液中8-羟基脱氧鸟苷含量)
应用来自浙江大学附属第二医院国际保健中心的142位健康志愿者的尿液来检测目标物8-羟基脱氧鸟苷的含量。
检测尿液在测定前进行预处理,将尿液于4摄氏度下以13000r/min离心15min后取上清液0.5ml,用水稀释至1.0ml,所述的稀释液加入同位素内标10pmol,而后向加入1.0ml甲醇进行活化与1.0ml水进行平衡后的HLB Oasis柱子中注入1.0ml稀释后的尿液样品,上样后先用1.0ml 5%甲醇进行清洗,最后用1.0ml 50%甲醇进行洗脱,收集洗脱液并用真空离心机干燥,随后加0.2ml水复溶。
复溶待测的尿液应用超高效液相色谱法进行分离,色谱柱为Waters BEH C18柱(1.7μm,2.1×100mm);柱温为40℃;流动相为0.1%乙酸水溶液-甲醇(92.5:7.5,V/V);流速为0.25mL/min;上样量为5微升;
如图1、2、3所示,九种不同的流动相体系,使用乙酸作为添加剂可以提高8-羟基脱氧鸟苷的质谱响应强度2.7-5.3倍。
最后将分离出的目标物引入质谱中进行检测,子源温度设定为550℃,喷雾电压设定为5.5kv,离子源气体1为60psi,离子源气体2为40psi,气帘气为35psi。8-羟基脱氧鸟苷的定量离子对为m/z 284.1>168.0,定性离子对为m/z 284.1>117.0,同位素内标[15N5]8-OHdG的定量离子对m/z 289.1>173.0,碰撞能量分别为18V,22V和18V,解簇电压为45V;驻留时间为150ms(图4所示)。
测得142位健康志愿者尿液中的8-羟基脱氧鸟苷测量值范围为0.24-2.47nmol/mmol肌酐,平均值为1.07±0.49nmol/mmol肌酐。
试验例2(应用固相萃取技术、超高效液相色谱串联质谱术来检测结直肠癌患者尿液中8-羟基脱氧鸟苷含量)
以与试验例1同样的方法,应用于结直肠癌患者的尿液检测中,测定其尿液中8-羟基脱氧鸟苷的含量。应用来自于浙江大学附属第二医院肿瘤外科的84位结直肠癌患者的尿液标本。
84例结直肠癌患者的尿液中的8-羟基脱氧鸟苷测量值范围为0.51-4.37nmol/mmol肌酐,平均值为1.68±0.85nmol/mmol肌酐。
根据图5a所示,结直肠癌患者的尿液中8-羟基脱氧鸟苷的浓度高于正常人,且有显著性差异,有统计学意义。这表明,通过应用固相萃取技术联合液相色谱串联质谱检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷的浓度方法,对结直肠癌进行筛查和早期诊断是可能的。
如图5b所示,结直肠癌从I到IV期,尿液中的8-羟基脱氧鸟苷的浓度逐渐增高,DNA的氧化损伤呈增强趋势,结直肠癌I期患者尿液中的8-羟基脱氧鸟苷测量值范围为0.68-2.58nmol/mmol肌酐,平均值为1.30±0.61nmol/mmol肌酐;结直肠癌II期患者尿液中的8-羟基脱氧鸟苷测量值范围为0.51-3.66nmol/mmol肌酐,平均值为1.51±0.78nmol/mmol肌酐;结直肠癌III期患者尿液中的8-羟基脱氧鸟苷测量值范围为0.57-4.10nmol/mmol肌酐,平均值为1.78±0.84nmol/mmol肌酐;结直肠癌IV期患者尿液中的8-羟基脱氧鸟苷测量值范围为0.84-4.37nmol/mmol肌酐,平均值为2.29±1.07nmol/mmol肌酐。
如图5c所示,III、IV期结直肠癌肿瘤已发生转移的患者尿液中8-羟基脱氧鸟苷的浓度要显著高于I、II期未发生转移的患者,且有统计学差异;表明通过8-羟基脱氧鸟苷的浓度可以评估结直肠癌是否发生***转移、远处转移如肝脏转移。
如图5d所示,进行ROC曲线分析,验证该检测方法的结直肠癌的检测能力,AUC越接近1越显示检测能力高。在应用本发明方法检测8-羟基脱氧鸟苷的浓度的情况下,AUC为0.853,95%的可信区间为0.801-0.905,表明其检测效果较好。
表一.与结直肠癌发病相关的几种风险因子的logistic线性回归分析
根据表一,将结直肠癌的发病风险与尿液8-羟基脱氧鸟苷的浓度、年龄和性别进行logistic线性回归分析,分析表明,尿液中8-羟基脱氧鸟苷浓度越高,年龄越大的个体更易患结直肠癌,而性别与结直肠癌的发病风险并无相关性;此外,根据统计学分析8-羟基脱氧鸟苷浓度高于1.5nmol/mmol肌酐者患结直肠癌的风险是低于1.5nmol/mmol肌酐者的3.68倍,95%的可信区间为1.82-7.45。
此外,建立了以尿液8-羟基脱氧鸟苷浓度与年龄的模型来预测结直肠癌风险,并根据公式计算结直肠癌发病概率。公式如上所述,cutoff值为0.5,表明结直肠癌的预测概率值P高于0.5的患结直肠癌的风险要显著高于预测概率值低于0.5的个体。
根据以上,得出结论8-羟基脱氧鸟苷可以作为一个新的标志物来进行罹患结直肠癌的预测以及风险评估。
本发明的产业实用性,根据本发明所提供的筛查结直肠癌的方法,能够通过尿液中8-羟基脱氧鸟苷的浓度来预测检测者患结直肠癌的风险,能够依此采取相关手段进行早期干预,从而阻止结直肠癌的进展,提高了我国了卫生经济水平,因此该发明是有效的。
本发明是用于对被测试者进行早期大肠癌筛查的方法,应用超高效液相色谱质谱联用的方法来测定尿液中的8-羟基脱氧鸟苷,代入已建立的基于尿液8-OHdG浓度和年龄建立的结直肠癌发病预测模型的发病概率计算公式,评估其结直肠癌的发病风险。具体地,所述方法包含:应用固相萃取对尿液样本进行前处理,实现脱盐、浓缩和富集。(步骤A、B),以超高效液相色谱来分离出尿液中的8-羟基脱氧鸟苷的步骤(步骤C),用线性离子阱串联三重四级杆质谱来定量尿液中的8-羟基脱氧鸟苷的含量的步骤(步骤D、E),以及运用发病概率计算公式来计算结直肠癌发病风险,另外,本说明书中包含了检测结直肠癌发生的疾病进展程度。
本发明研究证实,在液相分离的步骤中在流动相A中加入乙酸,可以提高8-羟基脱氧鸟苷的质谱响应。此外,通过添加同位素内标,从而精确地对尿液中8-羟基脱氧鸟苷进行定量。在结直肠癌患者尿液中8-羟基脱氧鸟苷的含量比正常人要高,存在显著性差异。在I到IV期的结直肠癌患者尿液中,8-羟基脱氧鸟苷的浓度也呈现出上升的趋势,表明随着肿瘤的发展,DNA损伤呈严重趋势。肿瘤已发生转移的患者(III期和IV期)尿液中8-羟基脱氧鸟苷的浓度高于未转移患者(I期和II期),且存在显著性差异。通过由超高效液相色谱串联质谱构成的测定技术,可以对被测试者尿液8-羟基脱氧鸟苷浓度进行检测,结合logistic回归模型分析可以对结直肠癌发病风险进行预测,从而完成本发明。
Claims (2)
1.一种8-羟基脱氧鸟苷作为尿液检测标志物的应用,所述的8-羟基脱氧鸟苷的分子式:C10H13O5N5,其特征在于,通过以下步骤实现:
(1)样品经固相萃取预处理:将待测的尿液样本保存于-80℃冰箱中,应用前取出于4℃下解冻,离心后取上清液加水稀释,并加入10pmol同位素内标[15N5]8-OHdG,作固相萃取,向HLB Oasis柱子中加入甲醇进行活化,再加入水进行平衡,再加入尿液样本,随后用5%甲醇进行清洗,最后用50%甲醇进行洗脱,收集洗脱液并用真空离心机干燥,随后加水复溶待测;
(2)经固相萃取处理后的尿液利用液相色谱进行分离,所用的色谱条件是:色谱柱为Waters BEH C18柱,1.7μm,2.1×100mm,柱温为40℃,流动相为0.1%乙酸水溶液-甲醇,92.5:7.5,V/V,流速为0.25mL/min,上样量为5微升,随后将分离后的目标物引入质谱中进行定量检测;
(3)用质谱进行目标物的定量,所述质谱扫描方式为多反应监测,所述的质谱检测相关参数,离子源温度设定为550℃,喷雾电压设定为5.5kv,离子源气体1为60psi,离子源气体2为40psi,气帘气为35psi,8-羟基脱氧鸟苷的定量离子对为m/z 284.1>168.0,定性离子对为m/z 284.1>117.0,同位素内标[15N5]8-OHdG的定量离子对m/z 289.1>173.0,碰撞能量分别为18V,22V和18V,解簇电压为45V;驻留时间为150ms,通过配制标准品,绘制标准曲线,通过测得的质谱峰面积来计算尿液中8-羟基脱氧鸟苷浓度。
2.根据权利要求1所述的一种8-羟基脱氧鸟苷作为尿液检测标志物的应用,其特征在于,步骤(3)通过配制1nM-300nM范围不同浓度的标准品,绘制标准曲线,得到线性方程为y=0.0278x+0.0515,所述的x代表8-羟基脱氧鸟苷的浓度,所述的y代表8-OHdG/[15N5]8-OHdG质谱峰面积比,通过测得的质谱峰面积来计算尿液中8-羟基脱氧鸟苷浓度。
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