CN113755340B - 一种哈茨木霉菌及其运用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum‑GXMD‑hs‑g5)，其在2021年3月4日以保藏编号为GDMCC NO：61869，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，该菌种易于保存。本发明克服了现有技术的不足，设计合理，结构紧凑，通过实验证明，哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum‑GXMD‑hs‑g5)能与柑橘根系共生，形成菌根，并对柑橘有明显促进生长的效果。菌株的发现丰富了我国的可利用微生物资源，其促生效果稳定、高效、环境友好的优势，在柑橘的种植方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种哈茨木霉菌及其运用。
背景技术
柑橘种植园区因为地势、地形等复杂问题导致土地肥力分布差异大，针对性施肥效果差，从而导致果园产量低下、果实品质下降等诸多问题，而农民对于此问题往往进行盲目施肥，加剧了果园化肥污染问题的发生，影响柑橘产业可持续发展。柑橘根系根毛又少又短，过干或过湿的土壤都会对柑橘产生严重影响。
菌根共生有助于植株的支持与固定，水分和氧气的供给，改善植物营养状况，还可以帮助植物吸收土壤中的矿质养分，提高植物在金属环境、盐碱地带、高温干旱、低温冷冻、水淹环境的抗逆性、增强植株抗病能力，并在抵抗入侵植物、恢复生态***等方面发挥重要作用。
在植株根系发育过程中如能与适宜的菌根真菌形成良好的菌根结构，可提高产量，改善品质。丛枝菌根帮助植物抵御不良环境胁迫及病虫害，促进植物健康生长，可减少化学肥料、杀虫剂施用量，以减少对环境、生态不利的化学物质施用量。丛枝菌根共生体可加速根系生长，提高对移动性低的无机离子吸收，加速养分循环利用，增强植物对不良胁迫(生物与非生物)因素的耐受力，形成良好的土壤结构，提高植物群体的多样性。
为了提高柑橘的产量，我们提出一种哈茨木霉菌及其运用。
发明内容
本发明的目的在于解决或者至少缓解现有技术中存在的问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum-GXMD-hs-g5），其在2021年8月12日以保藏编号为GDMCC NO：61869，保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
可选地，所述该哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum-GXMD-hs-g5）的保存方法为试管斜面保存，冰箱4℃保存，采用的培养基为PDA培养基。
可选地，所述哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum-GXMD-hs-g5）的采样柑橘根系地点为广西南宁市西乡塘区江西镇沃柑地，拨开表层土，采沃柑根系。
可选地，一种哈茨木霉菌的分离纯化方法，包括如下步骤：
步骤一、材料准备；样品采样：采样柑橘根系地点为广西南宁市西乡塘区江西镇沃柑地，拨开表层土，采沃柑根系，用FAA固定液保存，带回实验室进行下一步处理；
步骤二、配制分离纯化培养基：
步骤三、菌株分离纯化
将采回来的沃柑根系用清水冲洗干净，剪成2~4cm一段；在超净台中先用无菌水清洗5~6次，再用75%的酒精消毒30s，继续用无菌水冲洗5~6次，再用0.1%升汞消毒1~10min，设置几个时间梯度，最后再用无菌水冲洗5~6次；将消毒完成的根系剪成0.5cm一段并置于PDA培养基上，于30℃培养箱中培养；
将PDA培养基上长出的真菌，挑取其边缘菌丝，接种至新的PDA培养基中纯化，传代培养，直至菌株纯化完成。
可选地，步骤二中的配制分离纯化培养基为PDA培养基和PDB培养基；PDA培养基的配方包括如下重量份的：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL；
PDB培养基的配方包括如下重量份的：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，蒸馏水1000mL。
可选地，一种哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum-GXMD-hs-g5）发酵液的制配方法，将保存的菌株用接种环转接到PDA培养基平板上，置于28~32℃培养箱培养，待菌株长满半个平板面积后，用接种环转接到灭过菌的PDB培养基中，置于28~32℃、150~200r/min摇床中震荡培养2~3天即可。
可选地，一种哈茨木霉菌发酵液促进枳壳苗生长的应用，包括如下步骤：
缓苗：将枳壳实验苗移栽至装有土+基质（1：1）的花盆中，确保原始的土营养相对一致；
选苗：缓苗一段时间后，挑取长势相对一致的枳壳苗开展实验；作实验组和对照组，其中实验组用本发明提供的菌株发酵液浇灌，对照组用等量的PDB液体培养基浇灌；做好标记后，随机摆放；
浇菌：实验组每株实验苗浇5ml菌株发酵液，对照组每株实验苗浇5mlPDB液体培养基；每两周浇一次；
测量：使用直尺、游标卡尺等测量实验苗的株高、地径等指标；在浇灌菌剂前，测量初始数据，两个月后再次测量相关指标，并将实验苗拔出测量根系长度。
本发明实施例提供了一种哈茨木霉菌及其运用。具备以下有益效果：该菌株筛选简单、容易培养，发明人还建立了相应培养方法。通过实验证明，哈茨木霉菌（Trichodermaharzianum-GXMD-hs-g5）能与柑橘根系共生，形成菌根，并对柑橘有明显促进生长的效果。菌株的发现丰富了我国的可利用微生物资源，其促生效果稳定、高效、环境友好的优势，在柑橘的种植方面具有很好的应用前景。
附图说明
图1 是哈茨木霉菌在PDA培养基上第三天的生长形态图；
图2 是哈茨木霉菌在PDA培养基上第七天生长形态图；
图3 是用显微镜观察哈茨木霉菌侵染柑橘根系后的根系图；
图4 是枳壳苗株高增量柱形图；
图5 是枳壳苗地径增量柱形图；
图6 是枳壳苗叶片数增量柱形图；
图7 是枳壳苗根系长度柱形图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明公开的一种哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum-GXMD-hs-g5），其在2021年8月12日以保藏编号为GDMCC NO：61869，保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
该哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum-GXMD-hs-g5）的保存方法为试管斜面保存，冰箱4℃保存。采用的培养基为PDA培养基。
该哈茨木霉菌的采样柑橘根系地点为广西南宁市西乡塘区江西镇沃柑地，拨开表层土，采沃柑根系
实施例2
哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum-GXMD-hs-g5）的分离纯化方法包括如下步骤
步骤一、材料准备
样品采样：采样柑橘根系地点为广西南宁市西乡塘区江西镇沃柑地，拨开表层土，采沃柑根系，用FAA固定液（38%甲醛5ml、冰醋酸5ml、70%酒精90ml）保存，带回实验室进行下一步处理。
步骤二、配制分离纯化培养基：
PDA培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。
PDB培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，蒸馏水1000mL。
步骤三、菌株分离纯化
将采回来的沃柑根系用清水冲洗干净，剪成2~4cm一段。在超净台中先用无菌水清洗5~6次，再用75%的酒精消毒30s，继续用无菌水冲洗5~6次，再用0.1%升汞消毒1~10min，设置几个时间梯度，最后再用无菌水冲洗5~6次。将消毒完成的根系剪成0.5cm一段并置于PDA培养基上，于30℃培养箱中培养。
将PDA培养基上长出的真菌，挑取其边缘菌丝，接种至新的PDA培养基中纯化，传代培养，直至菌株纯化完成。
实施例3
该哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum-GXMD-hs-g5）发酵液的制配
将保存的菌株用接种环转接到PDA培养基平板上，置于28~32℃培养箱培养，待菌株长满半个平板面积后，用接种环转接到灭过菌的PDB培养基中，置于28~32℃、150~200r/min摇床中震荡培养2~3天即可。
实验例1
该哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum-GXMD-hs-g5）侵染柑橘根系测定
使用枳壳苗开展实验，测定菌株的根系侵染率。将枳壳苗种植在装有高温灭菌过的基质花盆中，置于培养室中缓苗。将本发明提供的哈茨木霉菌用PDB培养基培养，形成菌球后，对实验苗进行灌根处理，每株实验苗浇灌5ml上述菌剂。一个月后将实验苗拔出，用其根系测量菌株对枳壳苗根系的侵染率。
使用醋酸墨水染色法进行菌株对枳壳苗根系的侵染率的测定。将根系用无菌水冲洗干净，剪成0.5cm一段，置于含有纯白醋的5%醋酸墨水溶液中100℃水浴3min，用清水或白醋清洗脱色后，用于镜检。选取100段染色后的根系，在显微镜下观察根系是否被真菌侵染，形成菌根。侵染率的计算公式如下：
实验结果表明，本发明提供的哈茨木霉菌对枳壳苗根系的侵染率高达47%，其显微镜下的菌根图如附图1-2所示，图1为3天时，菌株在PDA培养基上的形态，图2为7天时，菌株在PDA培养基上的形态，图3为显微镜下的侵染根系的图。
实验例2
该哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum-GXMD-hs-g5）对枳壳苗的应用
缓苗：将枳壳实验苗移栽至装有土+基质（1：1）的花盆中，确保原始的土营养相对一致。
选苗：缓苗一段时间后，挑取长势相对一致的枳壳苗开展实验。作实验组和对照组，其中实验组用本发明提供的菌株发酵液浇灌，对照组用等量的PDB液体培养基浇灌。做好标记后，随机摆放。
浇菌：实验组每株实验苗浇5ml菌株发酵液，对照组每株实验苗浇5mlPDB液体培养基。每两周浇一次。
测量：使用直尺、游标卡尺等测量实验苗的株高、地径等指标。在浇灌菌剂前，测量初始数据，两个月后再次测量相关指标，并将实验苗拔出测量根系长度。
实验结果表明，本发明提供的菌株发酵液对枳壳苗具有明显的促生长效果。同时枳壳苗是柑橘的常用砧木，枳壳也是柑橘的一个品种因此同样也会提高对柑橘的促进作用，在两个月，浇灌上述菌株发酵液的枳壳苗相比于对照组的枳壳苗株高增加47.29%、地径增粗19.82%，叶片数增多40.76%。除此之外，上述菌株发酵液还使枳壳苗根系长度较对照组增加3.81%。实验结果如附图4-7所示。
实验例3
菌株基因鉴定
对菌株进行序列鉴定，具体步骤如下：采用CTAB法提取菌株DNA，挑出少许菌丝，用液氮研磨，用0.7mlDNA提取液浸泡研磨后的菌丝，水浴30min后加0.7ml氯仿-异戊醇混合液（24/1）,振荡使其浑浊，后离心机12000/min离心15min取上清液，往上清液加入1mlDNA沉淀缓冲液，室温沉淀30min后12000/min离心15min取沉淀，加入0.5mlNaCl溶液和2倍体积无水乙醇置于冰箱沉淀30min，12000/min离心15min离心取沉淀，用1ml70%的酒精洗涤沉淀后12000/min离心15min，重复3次，得到DNA沉淀。将提取的菌株DNA使用PCR技术扩增测序目的片段后，由武汉奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序服务，将所得序列在NCBI（美国国立生物技术信息中心官网）上进行匹配。
哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum-GXMD-hs-g5 ）18S rRNA基因序列： 序列表
<110> 广西绿友农生物科技股份有限公司
广西民族大学
<120> 一种哈茨木霉菌及其运用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 418
<212> RNA
<213> 哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum-GXMD-hs-g5)
<400> 2
aggaacgacc aaacggcccg gcgggaccgc cccggggcgc gcagccccgg accaaggcgc 60
ccgccggagg accaaccaaa accgaacccc ccgcgggaaa cgagccccgg cgccccgagg 120
cgcgaaaaga acaaaaccaa caacggaccg gcggcacgag aagaacgcag cgaaagcgaa 180
agaaggaagc agaacaggaa cacgaacgaa cgcacagcgc ccgccagacg gcgggcagcc 240
gccgagcgca caaccccgaa ccccccgggg ggcggcgggg gacggcccgc ccggcggggc 300
cgcccgaaaa cagggcggcc gccgcagccc ccgcgcagag gcacaccgca cgggagcgcg 360
gcgcgccaca gccgaaacac ccaaccgaaa ggacccggac aggaggaaac ccgcgaac 418
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (2)
1.一种哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum），其在2021年8月12日以保藏编号为GDMCC NO：61869，保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
2.如权利要求1所述的一种哈茨木霉菌发酵液促进枳壳苗生长的应用，其特征在于，包括如下步骤：
缓苗：将枳壳实验苗移栽至装有土和基质的花盆中，确保原始的土营养相对一致；
选苗：缓苗一段时间后，挑取长势相对一致的枳壳苗开展实验；作实验组和对照组，其中实验组用菌株发酵液浇灌，对照组用等量的PDB液体培养基浇灌；做好标记后，随机摆放；
浇菌：实验组每株实验苗浇5ml菌株发酵液，对照组每株实验苗浇5mlPDB液体培养基；每两周浇一次；
测量：使用直尺、游标卡尺测量实验苗的株高、地径指标；在浇灌菌株发酵液前，测量初始数据，两个月后再次测量相关指标，并将实验苗拔出测量根系长度。
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