CN102747006B - 一种解钾菌及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种解钾菌及其制备方法和应用。解钾菌分类命名为单球菌Roseateles.sp，其保藏登记号为CGMCCNo.5856。解钾菌发酵后得到的发酵液可直接作为农用微生物解钾菌剂肥料。本发明的解钾菌生产的具有溶磷、解钾等功能的微生物肥料产品，通过用于烟叶栽培的调查，由于溶磷、解钾等功能微生物的直接作用，改良了土壤品质，提高了土壤中有益微生物的数量，调节土壤中的营养平衡，释放土壤中的不易被吸收的养分，提高烟株的营养吸收。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体地说是一种解钾菌及其制备方法和应用。
背景技术
现代农业的发展伴随着化肥的大量使用，在增产增收的同时却也导致了土壤板结，有机质含量下降，土壤中的微生物失衡，土壤酸化，重金属含量增加，同时肥料流失还会造成水体污染。目前未见一种农用微生物菌剂系列肥料解钾菌的文献报导和应用，农用微生物菌剂系列肥料不仅可以有效改善土壤品质，同时也可以增强作物的抗性，增加作物对肥料的利用率，减少环境污染，调节土壤中的微生物趋于平衡。
发明内容
本发明的目的是提供一种解钾菌及其制备方法和应用，解钾菌发酵后可作为新型多功能具有解钾能力的环保生物肥料。
本发明的解钾菌分类命名为Roseateles sp.，其保藏登记号为CGMCC No.5856。.
解钾菌形态特征：在PDA培养基上淡乳黄色圆形菌落，表面及边缘光滑，无隔膜，菌落半透明，较为浓稠。
序列信息：介于Mitsuaria chitosanitabida和Roseateles depolymerans|两个种属之间，与两个种的部分16S rRNA的Blast比对后，相似性均为99%，从进化树的角度看与Roseateles属更为接近。
解钾菌的制备方法按以下步骤进行：
1）发酵种子的培养：选取试验室中培养出的纯净、优良的目标菌进行种子罐接种，接种后进行振荡培养或搅拌培养1-3d，菌种浓度达到1010以上，培养基为：蛋白胨5-15g、牛肉膏3-8g、氯化钠3-8g、水1000ml、pH7.2-7.4；
2）发酵罐及培养基灭菌：先对发酵罐进行灭菌，加入培养基至发酵罐，并对培养基蒸汽灭菌，控制压力0.1-0.15Mpa，温度121-125℃，灭菌20min-30min，自然冷却至30℃，保压，培养基与上述的种子培养基相同；
3）发酵罐接种：在无菌条件下进行接种，将种子液导入发酵罐中，在接种过程中保持发酵罐内正压0.03-0.05Mpa；
4）发酵过程控制：保持温度30℃，发酵罐内压强0.05Mpa，通过温度计及压力表1-2h检测一次温度、压力，通过调节无菌空气加入量调节其溶氧，通过取样口取样检测菌种纯度、含量及pH值；
5）发酵后放料：观察发酵液浓度不再变化，则可以进行放料，放料保持罐内压力0.03-0.06Mpa，放料后产品放置于阴凉干燥处或0-4℃条件下保存。
本发明的解钾菌具有较强的解钾能力，从以下可以验证：
1、试验室测定菌种解钾能力
试验目的：通过对解钾细菌解钾效果的测定，确定其解钾能力的强弱。
试验原理：采用重量法，将菌种培养前后培养基中的钾长石粉重量进行对比，判定菌种的解钾效果。
试验步骤及方法
1、样品处理
a、将保存在斜面上的目的菌种在牛肉膏蛋白胨平板上划线培养，活化3次；
b、将活化好的菌种取一环接种于100ml的牛肉膏蛋白胨液体培养基，30℃，200r/min,摇床培养2天；
c、取3ml菌种培养液，离心取上清液2.5ml(1%的接种量)加入含不溶性钾的250ml钾长石粉液体培养基，27℃，200 r/min,摇床培养4天，设置不加菌种的培养基作为对照，每个处理三个重复；
d、在第二天、第三天、第四天进行测定。
2、重量法测定不溶性钾的分解率
（1）测定方法
a.钾长石粉称重——培养基中钾长石粉加入量记为m钾。各瓶的加入量均为1.2500g。
b.滤纸称重——将干燥的定量滤纸放入60℃的烘箱中烘干， 2小时后取出放置在干燥器中冷却，冷却半小时后第一次称重，然后继续烘干半小时，冷却半小时后第二次称重，两次重量之差小于0.0003的可以备用，大于0.0003的继续重复上述的烘干、冷却、称重过程，直至质量差小于0.0003，滤纸质量记为m1。
c.过滤——将样品通过滤纸过滤，滤完后清洗三角瓶，把清洗液也并入滤液中进行过滤，再用清水冲洗沉淀物三次，确保沉淀物中基本没有菌种残留。
d.沉淀烘干——将滤纸连同过滤物放入60℃ 
2℃烘箱中烘45分钟。
e.再次称重——烘干后取出，在干燥器中室温冷却30分钟，称重，质量记为m2。
（2）试验结果计算
滤纸连同沉淀物的质量m2减去滤纸的重量m1即为沉淀物的重量，用培养菌种前加入的钾长石粉的重量减去培养后剩余的钾长石粉的重量，即为分解的钾长石粉。
m沉=m2-m1
m分=m钾-m沉
X=m分/m钾×100%
m沉——沉淀物的质量；
m分——分解掉的钾长石粉的质量；
X——钾长石粉分解率。
(3)试验结果记录
对三组重复求平均值，列表如下
对钾长石粉分解率做折线图，如图1所示。
试验结果分析：用重量法进行测定，可以看出加入解钾细菌的培养基钾长石粉分解率不断上升，而未加入菌种的培养基钾长石粉基本未分解。由于样品为液体，在用重量法进行检测的过程中可能不够精确，但基本达到了测定解钾细菌解钾能力大小的效果。
本发明的解钾菌生产的具有溶磷、解钾等功能的微生物肥料产品，通过用于烟叶栽培的调查，由于溶磷、解钾等功能微生物的直接作用，改良了土壤品质，提高了土壤中有益微生物的数量，调节土壤中的营养平衡，释放土壤中的不易被吸收的养分，提高烟株的营养吸收。
附图说明
图1是本发明的解钾菌对钾长石粉分解率折线图。
本发明的解钾菌于2012年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
本发明的解钾菌按以下方法制备获得：
1）发酵种子的培养：选取试验室中培养出的纯净、优良的目标菌进行种子罐接种，接种后进行振荡培养或搅拌培养1-3d，菌种浓度达到1010以上，培养基为：蛋白胨5 g（或15g、牛肉膏3 g（或8g）、氯化钠3 g（或8g）、水1000ml、pH7.2（或7.4）；
2）发酵罐及培养基灭菌：先对发酵罐进行灭菌，加入培养基至发酵罐，并对培养基蒸汽灭菌，控制压力0.1-0.15Mpa，温度121-125℃，灭菌20min-30min，自然冷却至30℃，保压，培养基与上述的种子培养基相同；
3）发酵罐接种：在无菌条件下进行接种，将种子液导入发酵罐中，在接种过程中保持发酵罐内正压0.03-0.05Mpa；
4）发酵过程控制：保持温度30℃，发酵罐内压强0.05Mpa，通过温度计及压力表1-2h检测一次温度、压力，通过调节无菌空气加入量调节其溶氧，通过取样口取样检测菌种纯度、含量及pH值；
5）发酵后放料：观察发酵液浓度不再变化，则可以进行放料，放料保持罐内压力0.03-0.06Mpa，放料后产品放置于阴凉干燥处或0-4℃条件下保存。
发酵后的发酵液可直接作为农用微生物菌剂肥料。
试验情况：解钾菌剂对烤烟生产的影响
针对植烟土壤有机质、微生物区系失衡的问题，从施肥手段补充土壤有机养分，对提高土壤综合肥力，促进土壤中有益微生物的繁殖，提高烟株对矿质营养的平衡吸收，提高烟叶质量和肥料利用率。本次使用的肥料，经好氧充分发酵后生产的具有溶磷、解钾等功能的微生物肥料产品。通过调查其对烤烟经济性状、农艺性状等品质的影响，以期改良土壤品质，提高土壤中有益微生物的数量，调节土壤中的营养平衡，并通过溶磷、解钾等功能微生物的直接作用，释放土壤中的不易被吸收的养分，以提高烟株的营养吸收。
1 材料与方法
1.1、试验材料：云南省微生物发酵工程研究中心有限公司生产的试验二号（解钾菌剂）农用微生物菌剂，具有解钾的功效，有效活菌数大于0.2亿/g。
1.2、试验时间：2011年4月28日——2010年9月16日。
1.3、试验地点：临沧市耿马县勐撒镇丙令村芒播坝。
1.4、前作：冬闲地，小春未种植。
1.5、供试品种：K326。
1.6、试验土壤：红土。
1.7、试验设计：
以施用试验二号（解钾菌剂）农用微生物菌剂的烟草分别作为示范，采用当地常规施肥的烟草作为对照。
1.8、施肥量与施肥方法：
移栽后7天内施菌剂80ml/株，其他的措施同当地，统一栽培管理措施。
1.9、生育期调查：
调查不同处理的烟苗移栽期、团棵期、旺长期、现蕾期、打顶期及最后一次采烤的时间
1.10、农艺性状调查：
于团棵期、旺长期、现蕾期、采烤前一天选取长势基本一致的5株烟测量株高、叶长、叶宽。烟株从第一片底脚叶由下至上顺序编号，只测叶长大于5 cm的叶片。
1.11、产质量调查：
根据烟株成熟情况，充分成熟采烤，调查不同处理的产量、产值、均价及中上等烟比例，比较分析各处理的效果。
2 结果与讨论
2.1 农用微生物菌剂对烟草生育期的影响
表一 生育期调查表
| 处理 | 移栽期 | 团棵期 | 旺长期 | 现蕾期 | 打顶期 | 最后一次采烤时间 |
| 试验二号 | 4月27日 | 6月4日 | 6月19日 | 6月27日 | 7月3日 | 8月19日 |
| 常规对照 | 4月27日 | 6月4日 | 6月21日 | 6月30日 | 7月5日 | 8月22日 |
据以上数据显示，试验一号（溶磷菌剂）、试验二号（解钾菌剂）的生育期要略短于常规对照。
2.2 农用微生物菌剂对烟草农艺性状的影响
表二 农艺性状调查表
据以上数据显示，试验田烤烟生育期符合优质烟生长规律，大田长势良好，烟株根系发达、健壮、抗逆性强。施用菌剂的烟株在株高、茎围、叶面积等方面优于常规施肥。
2.3 农用微生物菌剂对烟草经济性状的影响
表三 经济性状统计表
| 处理 | 亩产量 | 亩产值 | 均价 | 上等烟 | 中上等烟 |
| 试验二号 | 157.10 | 2590.65 | 16.49 | 44.06 | 83.59 |
| 常规对照 | 153.32 | 2384.18 | 15.55 | 46.63 | 80.01 |
从以上数据可以看出，施用试验二号（解钾菌剂）农用微生物菌剂的烟草比常规烟草的亩产量提高2.53%，亩产值提高8.67%，均价提高6.05%，中上等烟比例提高4.47%。
3 总结
3.1 综合以上数据认为，施用农用微生物菌剂的烟株不论在农艺性状方面，还是在经济性状方面都具有一定的优势。
3.2 因农用微生物菌剂含有大量有益菌，对土壤改良有一定的积极作用，其所具有的解钾功能，对改善土壤品质，增强作物对肥料的吸收率等有很大的积极影响。
3.3 施用农用微生物菌剂，对土壤的改良及作物的生长都具有非常大的积极作用。
序 列 表
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省微生物发酵工程研究中心有限公司
<120> 一种解钾菌及其制备方法和应用
<130> /
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 665
<212> DNA
<213> 未知种（Roseateles sp. G05）
<400> 1
cttgcggtta ggctaactac ttctggcaga acccgctccc atggtgtgac gggcggtgtg 60 tacaagaccc gggaacgtat tcaccgcggc aagctgatcc gcgattacta gcgattccga 120 cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc cggactacga ccgggtttct gggattagct 180 ccccctcgcg ggttggcagc cctctgtccc ggccattgta tgacgtgtgt agccctaccc 240 ataagggcca tgatgacctg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca ccggcagtct 300 cattagagtg ccctttcgta gcaactaatg acaagggttg cgctcgttgc gggacttaac 360 ccaacatctc acgacacgag ctgacgacgg ccatgcagca cctgtgtcca ggttctcttt 420 cgagcactcc cacatctctg caggattcct ggcatgtcaa gggtaggtaa ggtttttcgc 480 gttgcatcga attaaaccac atcatccacc gcttgtgcgg gtccccgtca attcctttga 540 gtttcaacct tgcggccgta ctccccaggc ggtcaacttc acgcgttagc tacgttactg 600 agaagaaacc ctcccaacaa ccagttgaca tcgtttaggg cgtggactac cagggtatct 660 aatcc 665
Claims (1)
1.一种解钾菌，其特征在于解钾菌分类命名为单球菌（Roseateles .sp），其保藏登记号为CGMCC No.5856。
2、权利要求1所述的解钾菌的生产方法，其特征在于按以下步骤进行：
1）发酵种子的培养：选取试验室中培养出的纯净、优良的目标菌进行种子罐接种，接种后进行振荡培养或搅拌培养1-3d，菌种浓度达到1010以上，培养基为：蛋白胨5-15g、牛肉膏3-8g、氯化钠3-8g、水1000ml、pH7.2-7.4；
2）发酵罐及培养基灭菌：先对发酵罐进行灭菌，加入培养基至发酵罐，并对培养基蒸汽灭菌，控制压力0.1-0.15Mpa，温度121-125℃，灭菌20min-30min，自然冷却至30℃，保压，培养基与上述的种子培养基相同；
3）发酵罐接种：在无菌条件下进行接种，将种子液导入发酵罐中，在接种过程中保持发酵罐内正压0.03-0.05Mpa；
4）发酵过程控制：保持温度30℃，发酵罐内压强0.05Mpa，通过温度计及压力表1-2h检测一次温度、压力，通过调节无菌空气加入量调节其溶氧，通过取样口取样检测菌种纯度、含量及pH值；
5）发酵后放料：观察发酵液浓度不再变化，则可以进行放料，放料保持罐内压力0.03-0.06Mpa，放料后产品放置于阴凉干燥处或0-4℃条件下保存。
3、权利要求1所述的解钾菌的应用，其特征在于解钾菌发酵后得到的发酵液直接作为农用微生物解钾菌剂肥料。
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