CN117327630A - 热带根瘤菌fm-19及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株热带根瘤菌(Rhizobium tropici)菌株FM‑19及其应用，该菌株于2023年4月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.63403。本发明所述的根瘤菌FM‑19菌株接种毛鸡骨草具有高效结瘤和固氮能力，可促进毛鸡骨草生长及黄酮类活性成分积累，提高毛鸡骨草的品质和生物量，具有广阔的应用前景。

Description

热带根瘤菌FM-19及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种热带根瘤菌FM-19及其应用。

背景技术

微生物与药用植物间存在复杂的互作关系，根际微生物可直接作用于药用植物影响其产量及质量。根瘤菌是一类广泛分布于土壤中的有益固氮微生物，为革兰氏阴性细菌，可以与豆科植物形成根瘤或茎瘤共生固氮***，将氮气转化成植物需要的氮素营养，是最高效的生物固氮体系。毛鸡骨草(Abrus mollis Hance)被收录于《广西中药材标准》，因其与鸡骨草功效相似并且生长速度快，在民间常将毛鸡骨草代替鸡骨草药材入药。随着鸡骨草药材需求量不断增加，也导致了人工栽培成为常态化。但是传统农业大量使用农药化肥的种植模式也被用于中药种植，造成了药材有效成分降低、土壤肥力下降等问题。因此，为了充分发挥根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用，减少化肥施用，提高药材产量和质量，需要筛选高效固氮菌株进行人工接种。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明的一个目的是提供一种热带根瘤菌菌株FM-19，该菌株能够显著提高毛鸡骨草生物量、结瘤数、单株根瘤重量、根瘤固氮酶活性及藤茎中总黄酮的含量。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一株热带根瘤菌(Rhizobiumtropici)FM-19，其特征在于，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.63403。

一种促进毛鸡骨草生长和黄酮类活性成分积累的菌剂，包含有所述的热带根瘤菌FM-19。

一种毛鸡骨草的种植方法，毛鸡骨草种子催芽，芽苗长至1-2cm时移栽到栽培介质中，待长出真叶后，在栽培介质中接种所述热带根瘤菌FM-19。

优选的是，毛鸡骨草种子表面消毒处理后再进行催芽处理。

优选的是，消毒处理方法为：用0.1％升汞溶液浸泡5-15min进行表面消毒，然后浸泡于40-60℃的热水中，自然冷却至室温。

优选的是，每隔10-15d接种1次，接种3-6次。

优选的是，热带根瘤菌FM-19的接种OD₆₀₀为0.8-1.0。

一种热带根瘤菌FM-19在提高毛鸡骨草藤茎中总黄酮含量上的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

第一、本发明提供了一株热带根瘤菌FM-19，该菌株于2023年4月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.63403。

第二、本发明提供的热带根瘤菌菌株FM-19，能达到改善毛鸡骨草氮营养，促进毛鸡骨草生长及毛鸡骨草中黄酮化合物积累的作用。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明热带根瘤菌(Rhizobium tropici)菌株FM-19在YMA培养基上的菌落形态图；

图2为本发明热带根瘤菌(Rhizobium tropici)菌株FM-19经革兰氏染色后在显微镜下的观察图；

图3为本发明热带根瘤菌(Rhizobium tropici)菌株FM-19的16S rDNA序列分析***发育树状图；

图4为接种根瘤菌对生物量影响图；

图5为接种根瘤菌对植物结瘤数量、单株根瘤重和根瘤固氮活性影响图；

图6为接种根瘤菌对植物藤茎中总黄酮含量影响图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

<试验内容>

一、菌株的分离纯化

2022年6月在广西玉林制药有限责任公司福绵种植基地采集毛鸡骨草根瘤。将采集的根瘤用水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分，在95％的乙醇中浸泡30s以消除表面张力，倒去乙醇再用0.2％ HgCl₂消毒5min，进行表面的消毒，最后用无菌水冲洗5-6次，用无菌滤纸吸干水分。取0.5g消毒后的根瘤置于灭菌的研钵中，加入4.5mL无菌水研磨，梯度稀释至10^-3，将10^-2和10^-3稀释液各100μL涂布在YMA培养基，YMA培养基的配方如表1，倒置于28℃培养箱中黑暗培养，直到单菌落出现。待长出单菌落后观察，菌落形态：根瘤菌的菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐，快生型根瘤菌在YMA平板上培养3-5天菌落直径为2-4mm，其代时为2-4h；慢生型根瘤菌在YMA平板上培养5-7天内菌落直径不超过1mm，其代时为6-8h。菌体形态：挑取单菌落菌苔图片进行革兰氏染色，油镜下观察，杆状，0.5～0.9μm×1.2～6.0μm，一般含有聚-β-羟基丁酸盐颗粒，革兰氏阴性，无芽孢。

表1YMA(Yeast Mannitol Agar)培养基配方(/L)

本实施例的菌株为快生型，在菌落形态上呈乳白色半透明圆形，粘质较多，在YMA平板上生长3天后直径为1.0-2.0mm(图1)；最适生长条件为：30℃，转速200r/min；经革兰氏染色反应镜检为阴性(G^-)，呈小短杆状(图2)。

二、分子鉴定

使用试剂盒提取菌株总DNA，使用通用引物P1-P6扩增菌株16S rDNA片段，PCR扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收送到上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，测序结果如SEQ ID No.1所示；将所得到的序列在NCBI进行BLAST检索，从中选择了10个相似性高的模式菌株作为参比菌株，利用MEGA软件中NJ法进行16S rDNA基因***发育树的构建。由对比结果和***发育树(图3)可知，根瘤菌FM-1916S rDNA基因序列与热带根瘤菌(Rhizobium tropici)菌株的模式菌株Rhizobium tropici strain BF-R18的序列相似性达到99.92％，并位于同一进化分支，从而确定根瘤菌FM-19为根瘤菌属Rhizobium的新菌株系。

该菌株与2023年4月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.63403。

SEQ ID No.1序列如下所示：

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<实施例1>

一种毛鸡骨草的种植方法，包括以下步骤：

1)用0.1％升汞溶液浸泡10min进行表面消毒，然后浸泡于50℃的热水中，自然冷却至室温，种子吸胀后置于无菌发芽盒内，在25℃培养箱内催芽；

2)芽苗长至1-2cm时移栽到栽培介质中，待长出真叶后，在栽培介质中接种所述热带根瘤菌FM-19，热带根瘤菌FM-19的接种OD₆₀₀为0.8，每隔10d接种1次，接种3次，持续种植，即得毛鸡骨草。

<效果试验>

毛鸡骨草种子灭菌培养：挑选饱满、大小一致的毛鸡骨草种子，用0.1％升汞溶液浸泡10min进行表面消毒，然后浸泡于50℃的热水中让其自然冷却。种子吸胀后置于无菌发芽盒内，在25℃培养箱内催芽。

菌体培养：配置YMA液体培养基分装，每瓶100mL，121℃灭菌20min；接种已纯化并达到对数生长期的根瘤菌菌液，接种量为1％，在30℃的摇床200r/min震荡培养，菌液吸光值OD₆₀₀达到0.8-1.0时做接种使用。

试验于广西中医药大学温室大棚中进行，将蛭石、商品育苗基质按1：2混合均匀后高温灭菌，选取芽长1-2cm的芽苗移入盆栽中，每盆移栽5棵，生长两周后间苗，并进行接菌处理，接种量为10mL/株，每隔10d接种1次，共接种3次，并在植株生长60天后，测定各项指标，结果如图4、图5、图6所示。图中的数据是具有标准误差的三个生物学重复的平均值。。

由图4可知，接种根瘤菌FM-19对毛鸡骨草地上部和地下部生物量积累具有显著影响，即与不接种根瘤菌相比，接种处理的毛鸡骨草植株地上部鲜重和干重分别增加了157.42％和126.46％，地下鲜重和地下干重分别增加了154.32％和98.0％

由图5可见，接种根瘤菌FM-19对毛鸡骨草结瘤数、单株根瘤重和根瘤固氮酶活性具有显著影响，与不接种根瘤菌相比，接种处理的毛鸡骨草结瘤数、单株根瘤重和根瘤固氮酶活性分别增加了242.82％、980.45％和121.48％。

由图6可见，接种根瘤菌FM-19对毛鸡骨草藤茎中总黄酮积累具有显著影响，与不接种根瘤菌相比，接种处理的毛鸡骨草藤茎中总黄酮含量增加了42.70％。

本发明所述的一种热带根瘤菌(Rhizobium tropici)菌株FM-19，经试验表明：使用菌株FM-19具有明显的增产效果，毛鸡骨草的生物量、结瘤数、单株根瘤重、根瘤固氮酶活性和藤茎中总黄酮含量均显著高于不接种的植株。可见热带根瘤菌(Rhizobium tropici)菌株FM-19可以用于毛鸡骨草生产上大面积推广使用。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (8)

1.一株热带根瘤菌(Rhizobium tropici)FM-19，其特征在于，该菌株于2023年4月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.63403。

2.一种促进毛鸡骨草生长和活性成分积累的菌剂，其特征在于，包含有权利要求1所述的热带根瘤菌FM-19。

3.一种毛鸡骨草的种植方法，其特征在于，毛鸡骨草种子催芽，芽苗长至1-2cm时移栽到栽培介质中，待长出真叶后，在栽培介质中接种权利要求1所述热带根瘤菌FM-19。

4.根据权利要求3所述的毛鸡骨草的种植方法，其特征在于，毛鸡骨草种子表面消毒处理后再进行催芽处理。

5.根据权利要求4所述的毛鸡骨草的种植方法，其特征在于，消毒处理方法为：用0.1％升汞溶液浸泡5-15min进行表面消毒，然后浸泡于40-60℃的热水中，自然冷却至室温。

6.根据权利要求3所述的毛鸡骨草的种植方法，其特征在于，每隔10-15d接种1次，接种3-6次。

7.根据权利要求3所述的毛鸡骨草的种植方法，其特征在于，热带根瘤菌FM-19的接种OD₆₀₀为0.8-1.0。

8.如权利要求1所述的热带根瘤菌FM-19在提高毛鸡骨草藤茎中总黄酮含量上的应用。