CN108795794B - 一种短小芽孢杆菌及其筛选方法、菌剂的制备方法和应用 - Google Patents
一种短小芽孢杆菌及其筛选方法、菌剂的制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种短小芽孢杆菌及其应用，该菌株的保藏号为CGMCC No.13448，所述短小芽孢杆菌命名为短小芽孢杆菌BP16，其16S rDNA序列如SEQ ID No：1所示，该短小芽孢杆菌具有很好的解钾作用，对人、畜、农作物安全，对环境友好。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种短小芽孢杆菌及其筛选方法、菌剂的制备方法和应用。
背景技术
土壤微生物和植物根系形成一个稳定的动态***，在这个***中，他们相互作用，相互影响，植物根系为土壤微生物提供营养，土壤微生物又能提高土壤肥力，促进植物的生长发育，因而土壤、植物和微生物在农业生产中相互作用，且有着密切联系。钾是作物生长发育所必需的大量营养元素，研究土壤中钾的有效化对提高土壤肥力有着极其重要的意义。筛选研究不同土壤中的解钾细菌对于开发微生物菌种资源，提高土壤肥力，增进农产品品质，改善生态环境，具有重要意义。
现有大多数研究都集中于单一功能生物因子或同一功能的不同生物因子的功能菌群的研究，对多功能土壤细菌菌株筛选研究甚少。
发明内容
本发明主要提供了一种短小芽孢杆菌，具有很好的解钾作用，对人、畜、农作物安全，对环境友好。其技术方案如下：
本发明提供的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，已于2016年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏登记号为CGMCC No.13448。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)命名为短小芽孢杆菌BP16。
所述短小芽孢杆菌的菌学特征：革兰氏阳性菌，杆状，圆末端。在LB培养基上培养，菌落颜色为乳白色，四周呈锯齿状，菌落平整无***，无同心圈，无光泽。
所述短小芽孢杆菌16S rDNA序列表如序列表SEQ ID NO.1所示，与genbank上已报道序列进行对比，最终确定菌株为短小芽孢杆菌。
所述短小芽孢杆菌的筛选方法为：(1)取10g烟田土壤样品溶于100ml无菌水中，震荡20min，按10倍稀释法配制土壤悬液，选取10-3和10-5两个梯度在NA平板中涂布，每个梯度设置4个重复，置于28℃恒温培养箱中培养72h，挑取单菌落在NA平板中划线培养，得芽孢杆菌；(2)所得细菌接种到解钾初筛培养基中，28℃培养120h，得到具有解钾活性菌株，转到LB平板上培养保存。
一种短小芽孢杆菌菌剂，由短小芽孢杆菌经活化、种子培养、发酵后得到。其中，优选的，所述活化的方法为将短小芽孢杆菌接种于LB培养基中，于28℃培养24h。所述种子培养的方法为将活化后的短小芽孢杆菌接种于培养基中，于28℃、150r/min振荡培养12h。所述发酵的方法为将培养后的短小芽孢杆菌以1％体积比接种于培养基中，于28℃、150r/min振荡培养72h，得到的菌剂稀释100倍后使用。
短小芽孢杆菌可以应用为解钾和促进植物生长使用，制成的短小芽孢杆菌菌剂可以促进植物生长使用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明中的短小芽孢杆菌是一株烟田土壤细菌，对人、畜、农作物安全，对环境友好；
(2)短小芽孢杆菌具有很好的解钾作用，所述解钾指的是将植物不能利用的钾(例如钾长石中矿物质形成的钾)转变成植物所能利用的可溶性钾，对提高土壤肥力有着极其重要的意义，具有促进植物生长的作用，所述植物为小白菜或烟草。所述促进植物生长体现为促进叶长、叶宽、叶片数、茎粗和根总长度指数中至少一项增加，对于植物栽培尤其是经济植物的栽培具有重大应用价值。
附图说明
图1为短小芽孢杆菌BP16在LB培养基上生长的菌落形态；
图2为短小芽孢杆菌BP16革兰氏染色显微镜(×1,000)观察图；
图3为短小芽孢杆菌BP16***进化树图。
具体实施方式
一、短小芽孢杆菌的获得
从山东省诸城市和昌乐县采集烟田土壤，采用土壤稀释法共分离纯化出31株细菌，以备后续实验。
二、菌株筛选
将从烟田土壤中分离纯化的细菌接种到解钾初筛培养基中。28℃培养120h，观察记录具有透明圈的菌落，测量透明圈直径(D)和菌落直径(d)。
经解钾初筛平板法得到菌株Zcg具有良好的解无机磷及解钾效果。
表1：菌株Zcg解钾效果统计表
三、菌株Zcg的鉴定
1、菌株Zcg的形态鉴定
在LB固体培养基上28℃培养48h后的单菌落形态照片见图1，形成乳白色不透明，四周呈锯齿状，表面平整无***，无同心圈，无光泽的近圆形菌落。挑取少量菌株，对其进行革兰氏染色，显微镜下观察染色结果，见图2所示。
2、菌株Zcg的分子鉴定
以菌体DNA为模板，用通用引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-CGGTGTGTACAAGGCCC-3'扩增16SrDNA片段测序分析。反应在体系：95℃预变性5min；30个循环(94℃40S，56℃40S，72℃90S)；72℃延伸10min。通用引物测序，得到的16S rDNA基因序列用BLAST搜索程序从GenBank中进行同源性分析。同时根据GenBank中与菌株的16S rDNA序列相似性较高的序列用MEGA4.0软件进行***发育树构建，该菌株***进化树如图3所示。
菌株Zcg的16S rDNA的编码序列如序列SEQ ID No：1所示。
四、菌株的保藏
基于步骤三中的形态鉴定及分子鉴定结果，菌株Zcg属于短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，于2016年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13448，命名为短小芽孢杆菌BP16。
五、菌剂制备
挑取短小芽孢杆菌BP16单菌落接种于LB培养基中于28℃、150r/min振荡培养24h，将活化后的短小芽孢杆菌接种于培养基中，于28℃、150r/min振荡培养12h，以1％的比例接种于培养基中28℃、150r/min振荡培养72h，得到的菌剂使用时可以稀释100倍使用。
按以上步骤即得短小芽孢杆菌BP16菌剂。
六、短小芽孢杆菌菌剂在促进植物生长中的应用
1、小白菜促生实验
采用盆栽法培养小白菜5d移栽至新的育苗盘中3d后，分别吸取稀释100倍后的上述菌剂15mL和100mL浇灌于小白菜苗根际土壤中。
室温环境中培养20d后测量小白菜叶宽、叶长、株高。
表2：小白促生实验测量统计表
2、烟草促生实验
采用盆栽法培养烟草30d移栽至新的育苗盘中3d后，吸取稀释100倍后的上述菌剂100mL浇灌于烟草苗根际土壤中。
室温环境中培养30d后测量烟草叶宽、叶长、叶片数、株高、茎粗、根长、根总面积和根直径。
表3：烟草促生实验地上部分测量统计图
表4：烟草促生实验地下部分测量统计图
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 潍坊市烟草专卖局
<120> 一种短小芽孢杆菌及其筛选方法、菌剂的制备方法和应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1443
<212> DNA
<213> 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)
<400> 1
gaatctgcac ttcggcggct ggctcataaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttgcaaa 60
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agg 1443
Claims (6)
1.一种短小芽孢杆菌菌剂，其特征在于：所述菌剂为短小芽孢杆菌经活化、种子培养、发酵后得到的菌剂，所述短小芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.13448，所述短小芽孢杆菌命名为短小芽孢杆菌BP16。
2.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌菌剂，其特征在于：所述短小芽孢杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID No：1所示。
3.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌菌剂，其特征在于：所述活化的方法为将短小芽孢杆菌接种于LB培养基中，于28℃培养24h。
4.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌菌剂，其特征在于：所述种子培养的方法为将活化后的短小芽孢杆菌接种于培养基中，于28℃、150r/min振荡培养12h。
5.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌菌剂，其特征在于：所述发酵的方法为将培养后的短小芽孢杆菌以1％体积比接种于培养基中，于28℃、150r/min振荡培养72h，得到的菌剂稀释100倍后使用。
6.如权利要求1所述的短小芽孢杆菌菌剂在促进植物生长中的应用。
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| CN102978130A (zh) * | 2012-11-01 | 2013-03-20 | 无锡亚克生物科技有限公司 | 一种短小芽孢杆菌gbsc66及其应用 |
| CN105274026A (zh) * | 2015-10-30 | 2016-01-27 | 湖北大学 | 一种解钾微生物及其在作物种植中的应用 |
| CN105925497A (zh) * | 2016-04-20 | 2016-09-07 | 华南农业大学 | 一株短小芽孢杆菌及其在解磷解钾产酸中的应用 |
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2017
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