CN114381379B

CN114381379B - 一株具有提高石斛幼苗萌蘖能力的胶膜菌菌株tp-8及其应用

Info

Publication number: CN114381379B
Application number: CN202210026007.5A
Authority: CN
Inventors: 高江云; 吴益花; 陈德赟
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2022-01-11
Filing date: 2022-01-11
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2042-01-11
Also published as: CN114381379A

Abstract

本发明提供了一株具有提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力的胶膜菌菌株TP‑8及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供了一株具有提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力的胶膜菌(Tulasnella sp.)菌株TP‑8，保藏编号为CCTCC NO：M 20211283。真菌提高铁皮石斛萌蘖的能力各不相同，接种TP‑8菌株处理的幼苗，其萌蘖数增加显著。同时，TP‑8菌株与铁皮石斛幼苗共生，能一定程度促进幼苗新叶、新根以及促进幼苗节茎***壮。铁皮石斛幼苗与本发明菌株TP‑8表现出有益的共生关系，利用TP‑8菌株和铁皮石斛幼苗共生，实现铁皮石斛幼苗菌根化，可作为铁皮石斛栽培的生物菌剂原料。

Description

一株具有提高石斛幼苗萌蘖能力的胶膜菌菌株TP-8及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力的胶膜菌菌株TP-8及其应用。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)又被称为铁皮枫斗、黑节草，是我国的特有种，野生资源主要分布于我国湖南、云南、贵州、四川等喀斯特地形，喜温暖湿润气候，适宜在凉爽、湿润、空气畅通的半阴半阳的环境。作为传统中药材的珍品，其化学成分多糖、生物碱、苷类、酚类和木质素等，具有调节免疫功能、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、抗菌等多种药理作用。然而，自然条件下，其繁殖力弱，生长周期长，加上过度采集，同时生境破坏严重，导致铁皮石斛的野生资源极度濒危。因此，如何以现有知识、资源、技术，保护恢复铁皮石斛种群，同时实现恢复友好栽培，满足消费需求成为难点。

虽已获得大量促进种子萌发的共生真菌，且萌发率高，但生长瓶颈在萌发到幼苗阶段之间，种子萌发后无法实现幼苗建成。即使能形成幼苗，但矮小，分化能力弱，不能形成新芽，无萌蘖能力。

然而，现有技术报道了从铁皮石斛成年植株根分离获得的真菌菌株，有些菌株能够对石斛种子和原球茎致死，有些菌株则能够促进铁皮石斛生长，主要体现在提高幼苗鲜重增长、叶绿素含量、促进营养元素的吸收以及提高幼苗中植物生长激素的水平(菌根真菌对铁皮石斛萌发及生长的影响,吴慧凤,海南大学学位论文.2011.5.30)。现有技术研究表明，铁皮石斛在各生长阶段所需的真菌种类不一样，通过测定铁皮石斛原球茎和组培苗的生理指标发现，内生真菌主要通过产生内源激素来调节铁皮石斛的生长发育的。与具有提高萌蘖能力的真菌共生的幼苗能够突破生长瓶颈，快速生长，植株壮大，在自然环境中有较强的适应能力，大大提高存活率。有效真菌的获得目前多采用从兰科植物野生成年植株的根或者原球茎分离，但由于成年植株中存在着大量作用未知的内生真菌，这使得提高幼苗萌蘖能力的有效真菌的筛选和分离变得复杂而繁琐，而野生原球茎又极难获取。因此，获得提高幼苗萌蘖的有效共生真菌是开展铁皮石斛保护、恢复种群资源以及实现恢复友好栽培的关键环节。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株具有提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力的胶膜菌菌株TP-8及其应用。

本发明提供了一株具有提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力的胶膜菌(Tulasnellasp.)菌株TP-8，保藏编号为CCTCCNO:M20211283。

优选的，所述胶膜菌菌株TP-8的ITS序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供了一种提高石斛幼苗萌蘖能力的菌肥，包括所述胶膜菌菌株TP-8和可接受的营养成分。

本发明提供了所述胶膜菌菌株TP-8或所述菌肥在提高石斛幼苗萌蘖能力中的应用。

本发明提供了一种提高石斛幼苗萌蘖能力的方法，将石斛幼苗移栽至共生培养基上生长，将所述胶膜菌菌株TP-8或所述菌肥接种至共生培养基上，使胶膜菌真菌定殖于石斛幼苗根部，培养。

优选的，所述共生培养基包括燕麦琼脂培养基；

所述燕麦琼脂培养基包括4g·L^-1燕麦和10g·L^-1琼脂，培养基pH为5.6～5.8。

优选的，所述胶膜菌菌株TP-8的接种量为每120ml燕麦培养基接种0.4～0.6cm³胶膜菌菌株TP-8菌块。

优选的，所述培养的温度为23～27℃。

优选的，所述培养的光周期为12L/12D；光照强度为2000～3000Lx。

优选的，所述石斛包括铁皮石斛。

本发明提供的具有提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力的胶膜菌(Tulasnellasp.)菌株TP-8，保藏编号为CCTCCNO:M20211283。与从铁皮石斛幼苗的根中分离获取的其他胶膜菌菌株TP-8相比，菌株TP-8能够提高石斛幼苗的萌蘖能力，且达到显著性差异。利用胶膜菌菌株TP-8将铁皮石斛幼苗菌根化，增加幼苗的萌蘖数量，可获得适应性强、生长能力强、成活率高的优质共生幼苗，有望实现重建铁皮石斛种群，实现药用铁皮石斛高效栽培。

同时，本发明工艺简单，操作容易，成本低，适于推广应用，在珍稀濒危兰科植物的回归保护、种群重建实践、药用兰科植物的生态栽培、解决铁皮石斛栽培产业的优质幼苗来源瓶颈问题等方面都具有巨大的推广价值。

附图说明

图1为本发明提供的胶膜菌菌株TP-8菌株及对照菌株在铁皮石斛幼苗萌蘖能力的形态图。

生物材料的保藏信息

胶膜菌菌株TP-8(Tulasnellasp.)菌株于2021年10月15日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:M20211283，菌株编号为TP-8。

具体实施方式

本发明提供了一株具有提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力的胶膜菌菌株TP-8保藏编号为CCTCCNO:M20211283。

在本发明中，胶膜菌菌株TP-8是从铁皮石斛幼苗迁地诱导获得的形成共生关系的幼苗菌根中分离获得。胶膜菌菌株TP-8的形态特征如下：在PDA平板上培养10天，其菌落呈白色毯状，形成较薄的气生菌丝，规则圆形发散生长，菌落表面粗糙、干燥，形成层次较明显的三个同心圆。胶膜菌菌株TP-8的菌丝特征如下：使用盖玻片插片培养法观察菌株显微形态特征，在25±2℃条件下培养箱内黑暗培养10天，光学显微镜下观察，菌丝粗2.99-4.62μm，分枝近直角，新菌丝着生于老菌丝，新菌丝具更明显隔膜，且隔膜数量更多，老菌丝细胞壁具有加厚现象，隔室较长。所述胶膜菌菌株TP-8的ITS序列优选如SEQ ID NO:1所示。胶膜菌菌株TP-8的分子鉴定结果如下：根据ITS片段比对结果发现胶膜菌属菌株TP-8的nrDNAITS序列与真菌Tulasnellasp.(登陆号KX587486.1)最为相似，最大相似度达到98％。综合形态学、分子鉴定结果表明，Tulasnellasp.TP-8属于胶膜菌属的一株真菌。

在本发明中，所述胶膜菌菌株TP-8的扩大培养方法，优选将菌株TP-8接种在PDA培养基上黑暗培养至真菌菌丝长满培养皿。所述黑暗培养的温度优选为23～27℃，更优选为25℃。

本发明提供了一种提高石斛幼苗萌蘖能力的菌肥，优选包括所述胶膜菌菌株TP-8和可接受的营养成分。

在本发明中，所述菌肥中包括胶膜菌菌株TP-8。所述菌肥的制备方法，优选将胶膜菌菌株TP-8接种至营养成分形成的培养基上，培养，待菌丝均匀长满培养基时，混合均匀得到菌肥。所述营养成分包括麦麸、米糠、10％葡萄糖溶液等。所述麦麸、米糠、质量浓度10％葡萄糖溶液的体积比为2：3：3。每500ml培养基添加10片0.5cm³体积大小的菌块。所述培养的温度优选为23～27℃，更优选为25℃。所述培养优选为黑暗培养。所述培养的时间优选为14～16d，更优选为15天，直至辅料具有大量菌丝附着。

本发明对所述营养成分不做具体限定，采用本领域所熟知的菌肥营养成分即可，例如大量元素、重量元素、微量元素、促进土壤团粒形成、降低土壤板结等的成分。

在本发明中，所述菌肥的制备方法，优选包括以下步骤：将胶膜菌菌株TP-8经过活化与可接受的营养成分混合即可。

在本发明中，所述共生培养基优选包括燕麦琼脂培养基。所述燕麦琼脂培养基优选包括4g·L^-1燕麦和10g·L^-1琼脂，培养基pH为5.6～5.8。

在本发明中，所述胶膜菌菌株TP-8的接种量优选为每120ml燕麦培养基接种0.4～0.6cm³胶膜菌菌株TP-8菌块，更优选为每120ml燕麦培养基接种0.5cm³胶膜菌菌株TP-8菌块。胶膜菌菌株TP-8菌块参见上述扩大培养方法获得即可。

在本发明中，所述培养的温度优选为23～27℃，更优选为25℃。所述培养的光周期优选为12L/12D。光照强度优选为2000～3000Lx，更优选为2500Lx。

本发明提供的方法对石斛属植物均使用，本发明实施例中，以铁皮石斛为例具体说明胶膜菌菌株TP-8提高石斛幼苗的萌蘖能力，但不能理解为对本发明的限制。

下面结合实施例对本发明提供的一株具有提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力的胶膜菌菌株TP-8及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

胶膜菌菌株(Tulasnellasp.)TP-8菌株的分离、纯化、保存及鉴定

1-迁地诱导铁皮石斛幼苗菌根

(1)2018年7月底至9月，团队实地调研多个地方，采访当地采药人，最终确认云南广南(23°58′N,105°11′E；1428malt.)、湖南崀山喀斯特地貌(26°30′N,111°10′E；340malt.)与丹霞地貌(26°20′N,110°46′E；455malt.)、重庆罗田(30°31′N,108°33′E；1200malt.)，四川泸定(29°23′N,102°21′E；1382malt.)和石棉(29°22′N,105°11′E；3596malt.)六个地方是铁皮石斛原生境，因为历史上采药人于此采集到过野生铁皮石斛。期间采集六个原生境基质带回实验室，将野外带回来的基质与无菌混合基质(树皮、泥炭土、火山石以2:1:1比例混合)等体积混合，然后用无菌水浇灌至饱和，后分装至塑料花盆(半径5cm，高10cm)备用。

(2)选取长势良好的无菌铁皮石斛幼苗，五株为一丛，将其移植到装有诱导基质的塑料花盆，于25±2℃室温条件下光照培养(光周期为12/12hL/D)，保持花盆内基质的湿度，并每隔15天采集幼苗根组织，在显微镜下检查根组织是否有真菌定殖。

(3)移栽60天后，幼苗根组织上发现菌丝团，采集幼苗根样，用于后续真菌分离实验。

2.TP-8菌株的分离、纯化、保存及鉴定

(1)根样的获得：铁皮石斛幼苗迁地诱导获得的形成共生关系的幼苗菌根

(2)根样内生真菌的诱导、分离、纯化及保存：在自来水下将用于真菌分离的根样冲洗干净。在超净工作台上，根样放入75％酒精消毒30s，再移入盛有2％次氯酸钠(NaClO)溶液的无菌平板中，轻轻搅拌消毒3min，后用无菌尖镊取出，无菌水冲洗3～4次。用无菌手术刀将根样切成约0.1mm根片段，将其置于PDA培养基中25℃培养箱黑暗培养。待根片段周围长出真菌菌丝，不断地切取菌丝尖端到新的PDA培养基上作系列转移，转移3～5次后，可得纯菌落，共获得27株共生真菌。

(3)真菌保存：利用常规的试管斜面法对已纯化的真菌进行保存。将配制好的适量PDA培养基倒入规格为18×20mm的玻璃试管中，培养基倒入量约为试管体积的1/3。硅胶塞后，放入高压灭菌锅内灭菌(121℃，20min)。灭菌后将试管置于超净工作台内摆成斜面待用。在超净工作台上，将纯化后的菌株用无菌接种针挑取边缘菌丝接种于PDA斜面上，并注明菌种、编号、日期。将接种后的试管置于人工气候箱内25±2℃黑暗培养。待菌丝要长满PDA斜面时，将试管取出存入4℃冰箱内保存。

(4)鉴定

A.所述胶膜菌属菌株TP-8主要有以下微生物学特征：

①形态特征

该胶膜菌属菌株在PDA平板上培养10天，其菌落呈白色毯状，形成较薄的气生菌丝，规则圆形发散生长，菌落表面粗糙、干燥，形成层次较明显的三个同心圆。

②菌丝生长特征

使用盖玻片插片培养法观察菌株显微形态特征，在25±2℃条件下培养箱内黑暗培养10天，光学显微镜下观察，菌丝粗2.99～4.62μm，分枝近直角，新菌丝着生于老菌丝，新菌丝具更明显隔膜，且隔膜数量更多，老菌丝细胞壁具有加厚现象，隔室较长。

B.分子鉴定

分子生物学鉴定涉及的真菌总DNA提取采用CTAB法；PCR扩增所用引物为真菌通用引物ITS1和ITS4；PCR反应体系和条件参照相应的产品说明书进行；扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序；在美国国立生物技术信息中心数据库对所测序列进行比对分析，结合形态学特征确认其分类学地位，具体如下。采用CTAB法提取真菌DNA，PCR扩增所用引物为ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG，SEQ ID NO:2)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC，SEQ ID NO:3)；PCR反应体系(25μl)包括：2.5μl 10×PCR缓冲液，0.4μl dNTP，1.5μl Mg²⁺，1.5μl ITS1，1.5μl ITS4，0.2μlTaq酶，15.4μl ddH₂O，2μl DNA模板；扩增反应在PCR仪Perkin Elmer上进行，如下PCR循环：94℃预变性3min，循环1次；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，30次循环；最后72℃延伸10min；PCR扩增产物为上海生工生物工程有限公司进行测序；对所测序列提交美国国立生物技术信息中心数据库进行比对，初步确认其分类下地位。

菌株TP-8鉴定结果表明，该菌株TP-8与真菌Tulasnella sp.(登录号KX587486.1)最为相似，最大相似度达到98％。

根据形态特征及分子生物学手段，将所涉及真菌菌株TP-8鉴定为胶膜菌(Tulasnella sp.)。将分离得到的菌株TP-8于2018年12月5日保藏在云南大学植物繁殖适应与进化生态学重点实验室兰科植物菌根真菌库，该菌株分类命名为胶膜菌(Tulasnellasp.)菌株TP-8；并已于2021年10月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:M20211283。

对比例1

按照实施例1的方法分离纯化不同的筛选菌株(TP-2、TP-3、TP-5、TP-6、TP-9、TP-10、TP-12、TP-13、TP-14、TP-15、TP-19、TP-25)，采用对比文件1公开的鉴定方法鉴定筛选菌株的分类地位。

结果表明，菌株TP-2(SEQ ID NO:4)、菌株TP-3(SEQ ID NO:5)、菌株TP-5(SEQ IDNO:6)、菌株TP-6(SEQ ID NO:7)的鉴定结果为胶膜菌。菌株TP-10(SEQ ID NO:8)、TP-12(SEQ ID NO:9)、TP-13(SEQ ID NO:10)被鉴定为瘤菌根菌属(Epulorhizasp.)。菌株TP-14(SEQ ID NO:11)被鉴定为蜡壳耳菌(Sebacina sp.)。菌株TP-15(SEQ ID NO:12)被鉴定为Sebacinales sp.。菌株TP-19(SEQ ID NO:13)被鉴定为斜盖菇(Clitopilus sp.)。菌株TP-25(SEQ ID NO:14)被鉴定为Muscodor sp.。

实施例2

胶膜菌菌株TP-8菌株提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力的有效性实验

利用无菌铁皮石斛幼苗与真菌在培养基内的共生实验来验证该真菌是否能提高幼苗的萌蘖能力，比较不同真菌处理组幼苗的萌蘖数量：

(1)配制共生培养基：共生萌发培养基为燕麦琼脂培养基，包括4g·L^-1燕麦和10g·L^-1琼脂，培养基pH为5.6～5.8；

(2)将用于验证促生长功能的15株菌根真菌及本发明所诉胶膜菌(Tulasnellasp.)TP-8取出，接种在PDA培养基上，置于人工气候箱内，在温度为25±2℃黑暗培养活化至真菌菌丝长满培养皿得到共生菌株材料；

(3)将长势大约一致(叶：4～5片，萌蘖数：0个，根：2条，株高：1.7～2.5cm，茎粗：1.2～1.5mm)的无菌铁皮石斛幼苗移栽到装有燕麦琼脂培养基的组培瓶中，每组处理230株苗，46个重复；

(4)将用于共生菌株接种至栽有无菌幼苗的组培瓶中，再置于组培室，在温度为25±2℃条件下恒温培养，光照周期L/D＝12/12，光照强度为2500Lx；

(5)真菌对铁皮石斛幼苗萌蘖能力的提升效果和数据统计分析：统计两个时期(共生30天和90天)，每次统计幼苗萌蘖数量，萌蘖的统计方法是统计新萌芽的小芽，按式I计算平均萌蘖数(T)；

T＝mean(Tt)±SE式I

其中Tt为各时期幼苗的萌蘖数，SE为标准误。

利用广义线性模型(GLMs)比较不同真菌接种处理对萌蘖数的影响，并用最小显著性差异(LSD)比较各处理平均值，P<0.05。

共生培养90天截止实验时，利用广义线性模型(GLMs)比较不同真菌接种处理对萌蘖数的影响，并用最小显著性差异(LSD)比较各处理平均值，P<0.05；任意真菌接种处理对铁皮石斛幼苗萌蘖能力具有不同程度的提升效果(见表1)。

表1不同真菌对铁皮石斛幼苗萌蘖的影响(30天、90天统计)

注意：小写字母表示不同真菌处理间的显著性。

由表1可知，铁皮石斛幼苗与共生真菌共生培养30天后，不同真菌处理包括不接菌处理的PDA对照均有新增萌蘖，但除了TP-8菌株处理之外，其他组真菌处理萌蘖能力与不接菌处理PDA对照没有显著差异，接种TP-8菌株处理的实验组，其平均萌蘖数高达0.703±0.108。共生培养90天截止实验时，虽所有真菌处理组的平均萌蘖数都较30天时有所提高，但同30天统计分析结果一致，除TP-8显著提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力，其他真菌处理虽比PDA对照组高一些，但是提高效果不显著。因此，Tulasnellasp.TP-8真菌能够显著提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力。

对比例2

为了探究胶膜菌菌株TP-8菌株在铁皮石斛幼苗其他生长特性方面的作用，本实施例分别测定了TP-2、TP-3、TP-5、TP-6、TP-8、TP-10和无菌对照处理铁皮石斛幼苗90天的茎粗、株高，其中测定方法如下：株高：培养90天统计时，利用直尺测量植株的长度；茎粗：利用游标卡尺(数显卡尺，0-150mm)测量株高1cm处的节茎直径。结果见表2。

表2不同真菌处理对铁皮石斛幼苗茎粗和株高的影响(90天)

注意：小写字母表示不同真菌处理间的显著性。

由表2结果可知，TP-8菌株与其他胶膜菌菌株(TP-2、TP-3、TP-5、TP-6)相比，在株高和茎粗方面未表现出明显的优势，推测TP-8菌株与铁皮石斛幼苗共生，通过分泌促进铁皮石斛幼苗的萌蘖成分，从而实现促进铁皮石斛幼苗生长的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 云南大学

<120> 一株具有提高石斛幼苗萌蘖能力的胶膜菌菌株TP-8及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 602

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggaaggatca tagtaatcgt ctttgacgtt cgctttttcc gttgtcctcg ggacgttaat 60

gcgctctggt cgaggataaa cgacccctct gaccgaggta aaacccgtcg ctctgtgtta 120

cctcgacgag gcacacgtta aagatcgttc cgcgttgtga gtctaacacc agttgtataa 180

actttttaca accggtagcg atggatccct tggcacgtca ttcgatgaag accgttgcaa 240

attgcgataa agtgatgtga tgcgcaagtc caccacttat acgtgaatca tcgagttgtt 300

gaacgcattg caccgcgccc taaaccggct gcggtatgcc cctttgagcg tcattgtatc 360

ccttcgggag tccttttcca aaggacccga gttcagagtc ctcggtcctc ttctggatcg 420

tgttctctta gatgcgtcgc accgatcgcc tgatgggtcc tctaatgcct aagcgtggag 480

ttccttcaga gtccgagacg tgcttgaccg ggtgttgagc tcgcgtcgcc aagtctgcct 540

taaccagcag gactacaacg catgacctca ttggggtagg acaacccgct agacttaagc 600

at 602

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 4

<211> 608

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcggaaggat catagtaatc gtctttgacg ttctatctcc atcgtcctcg ggacgttaag 60

gcgctctggt cgaggataaa ggacccctct gaccgaggct aaacggtcgc ttgcctgtgt 120

tacctctttg gaggcacacg ttaaagatcg ttccgcgttg tgagtctaac accagttgta 180

aactttctac aaccggcagc gctggatccc ttggcacgtc attcgatgaa gaccgttgca 240

aattgcgata aagtgatgtg atgcgcaagt ccaccactta tacgtgaatc atcgagttgt 300

tgaacgcatt gcaccgcgcc ctaatccggc tgcggtatgc ccctttgagc gtcattgtat 360

tccttcggga gtctttcctt gctgaaagac ccgagctcgg agtcctcggt cctttggatc 420

gtgttctctc agatgcgtcg cgccgatcgc ctgatgggta ctctaatgcc tgagcgtgga 480

gtccctttga gcttgagacg cgcatgaccg gccgttgggc tcgcgtcacc aagtccgcgt 540

ccttctggac gtcggtacta caacgcatga cctcattggg gtaggacaac ccgctagact 600

taagcata 608

<210> 5

<211> 611

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgcggaagg atcatagtaa acgtctttga cgcacttcgt tccgtcgtcc tccggacgtt 60

aaggcgctct ggtcgaggat aaacgacccc tctgaccgag gctaacccgt cgcgcttccg 120

tgttaccgtc cgcggcacac gttaaagatc gttccgcgtt gtgagtcttg ctggttgtaa 180

taaactgttt acaaccggta gcgctggatc ccttggcacg tcattcgatg aagaccgttg 240

caaattgcga taaagtgatg tgatgcgcaa gtccaccact tatacgtgaa tcatcgagtt 300

gttgaacgca ttgcaccgcg ccctaaaccg gctgcggtat gcccctttga gcgtcattac 360

atccttcggg agtctccttt tctggagacc cgagttcgga gtcctcggtc ccttgggatc 420

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gagtccctct gaagtcgaga cgcgtttgac cgggtggtga gcccgcgtcg gcaagtccac 540

gtccgctgcg acgtcggtac tacaaccaca tgacctcatt ggggtaggac aacccgctag 600

acttaagcat a 611

<210> 6

<211> 622

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttattgatat gcttaagtct agcgggttgt cctaccccaa tgaggtcatg cgttgtagta 60

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catctgagag aacacgatcc aaaggaccga ggactccgag ctcgggtctt tcagcaagga 240

aagactcccg aaggaataca atgacgctca aaggggcata ccgcagccgg attagggcgc 300

ggtgcaatgc gttcaacaac tcgatgattc acgtataagt ggtggacttg cgcatcacat 360

cactttatcg caatttgcaa cggtcttcat cgaatgacgt gccaagggat ccagcgctgc 420

cggttgtaga aagtttacaa ctggtgttag actcacaacg cggaacgatc tttaacgtgt 480

gcctccaaag aggtaacaca ggcaagcgac cgtttagcct cggtcagagg ggtcctttat 540

cctcgaccag agcgccttaa cgtcccgagg acgatggaga tagaacgtca aagacgatta 600

ctatgatcct tccgcaggtt ca 622

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaaaactgg ggtgtctccc caatgaggtc atgcgttgta gtaccgacgt cccagaggaa 60

cgcggacttg gcgacacgag ctcaacgctc ggtcaagcgc atctccactc cgagggactc 120

cacgctcagg cattagagtg acccatcaga caatcagcgc gacgcatcta agagaacacg 180

gtccacagac cgaggactcc gaactcgggt ctaagaaaga ctcccgaagg gatacaatga 240

cgctcaaagg ggcataccgc agccggatta gggcgcggtg caatgcgttc aacaactcga 300

tgattcacgt ataagtggtg gacttgcgca tcacatcact ttatcgcaat ttgcaacggt 360

cttcatcgaa tgacgtgcca agggatccag cgctaccggt tgtaattgtt tttacaactg 420

gtgttagact cacaacgcgg aacgatcttt aacgtgtgcc tcggcaaaga ggtaacacca 480

ggacggattc acctctgtca gaggggtcgt ttatcctcga ccagagcacc ttaacgtccc 540

gaggacgatg gaaacagcac gtcaaagacg attacttatg atccttccgc aggtaccctt 600

acggaaagc 609

<210> 8

<211> 613

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcttaagtct agcgggttgt cctaccccaa tgaggtcatg cgttgtagta ccgacgtcca 60

ggaggacgcg gacttggtga cgcgagccca acggccggtc aagcgcgtct caagctcaga 120

gggactccac gctcaggcat tagagtaccc atcaggcgat cggcgcgacg catctgagag 180

aacacgatcc aaaggaccga ggactccgag ctcgggtctt tcagcaagga aagactcccg 240

aaggaataca atgacgctca aaggggcata ccgcagccgg tttagggcgc ggtgcaatgc 300

gttcaacaac tcgatgattc acgtataagt ggtggacttg cgcatcacat cactttatcg 360

caatttgcaa cggtcttcat cgaatgacgt gccaagggat ccagcgctgc cggttgtaaa 420

gtttacaact ggtgttagac tcacaacgcg gaacgatctt taacgtgtgc ctccgaggag 480

gtaacacaga ctggcgaccg tttaacctcg gtcagagggg tcgtttatcc tcgaccagag 540

cgccttaacg tcccgaggac gatggagata gaacgtcaaa gacgattact atgatccttc 600

cgcaggttca cct 613

<210> 9

<211> 619

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccgcttatt gatatgctta agtctagcgg gttgtcctac cccaatgagg tcatgcgttg 60

tagtaccgac gtccagaagg acgcggactt ggtgacgcga gcccaacggc cggtcaagcg 120

cgtctcaagc tcaaagggac tccacgctca ggcattagag tacccatcag gcgatcggcg 180

cgacgcatct gagagaacac gatccagagg accgaggact ccgaactcgg gtctttcagc 240

aaggaaagac tcccgaagga atacaatgac gctcaaaggg gcataccgca gccggattag 300

ggcgcggtgc aatgcgttca acaactcgat gattcacgta taagtggtgg acttgcgcat 360

cacatcactt tatcgcaatt tgcaacggtc ttcatcgaat gacgtgccaa gggatccagc 420

gctgccggtt gtagaaagtt tacaactggt gttagactca caacgcggaa cgatctttaa 480

cgtgtgcctc cagagaggta acacaggcaa gcgaccgttt aacctcggtc agaggggtcg 540

tttatcctcg accagagcgc cttaacgtcc cgaggacgat ggagatagaa cgtcaaagac 600

gattactatg atccttccg 619

<210> 10

<211> 610

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggctgggtaa gtctttgagt tcgctttttc cgttgtcctc gggacgttaa tgcgctctgg 60

tcgaggataa acgacccctc tgaccgaggt aaaacccgtc gctctgtgtt acctcgacga 120

ggcacacgtt aaagatcgtt ccgcgttgtg agtctaacac cagttgtata aactttttac 180

aaccggtagc gatggatccc ttggcacgtc attcgatgaa aaccgttgca aattgcgata 240

aagtgatgtg atgcgcaagt ccaccactta tacgtgaatc atcgagttgt tgaacgcatt 300

gcaccgcgcc ctaaaccggc tgcggtatgc ccctttgagc gtcattgtat cccttcggga 360

gtccttttcc aaaggacccg agttcagagt cctcggtcct cttctggatc gtgttctctt 420

agatgcgtcg caccgatcgc ctgatgggtc ctctaatgcc taagcgtgga gttccttcag 480

agtccgaaac gtgcttgacc gggtgttgag ctcgcgtcgc caagtctgcc ttaaccaaca 540

ggactacaac acatgacctc attggggtag gacaacccgc tagacttaag catatcaata 600

agcggaggaa 610

<210> 11

<211> 888

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctttttgatc aattcggtct tctgtgctgg tggcaacaca tgtgcacgtc gatcgtaatt 60

ccatcctcct cccaaccgtc catgtgtgtg tttggtcgac ctcggtcgaa gagttgtggc 120

ccttggcctc gattcgttcc agatgcacct tggttatttc acccactctg ggtactagaa 180

acaaagaaca ttttatataa actatacaac tttcaacaac ggatctcttg gctctcgcat 240

cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc 300

gaatctttga acgcaccttg caccctttgg tattccgaag ggtacgcccg tttgagtgtc 360

attgtaatct caatcccacg actttatgtt gtgtgattgg acttggatcc tgtcgctttt 420

gtgactgatc cgaaatgcat cagcgtgtgt ccgtcgtgac gataaaccga ttgttaaact 480

tcatcgggct cgctctgtcg aggttgtctg gcgaaagcac atgctaaacc cccctacatt 540

ttgacaattt gacctcaaat cgggtgggat cacccgctga acttaagcat atcaaacggg 600

ggggagaaag aaaattttat tgtacaattc cggtagaaca gtgctaggtg gcaacacatg 660

gtgcacgtcg atccgtaatt tccatcctcc tccaaggttc atggtgtgtg gtttggtcga 720

cctcggtcga aagagttgtg ggccctttgg cctcatttct ttcacatgcg cttaggttat 780

ttcaccctct ggggactaaa aacaaaaaaa atgttatata aactatacaa ctttcaacac 840

cggatctcct tggctcgctc gatgaagaag acaccaaatg ctcataag 888

<210> 12

<211> 618

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tatgcttaag ttcagcgggt agtcccaccc gatttgaggt caaattgtca aacttgtcac 60

aaagacggtt cgcagcgcag agcccacttt gcttacgtgt ccataaggaa ctttgatcag 120

tgaagatgtt tatcacactg aagacgctgc aacagcaggg tacactcatg catttaaggc 180

cagtcgtmat tacacgacat tgcccaagtc cacttcytay racaaaagtc gtagaggtga 240

gattacaatg acactcaaac gggcgtaccc ttcggaatac caaagggtgc aaggtgcgtt 300

caaagattcg atgattcact gaattctgca attcacatta cttatcgcat ttcgctgcgt 360

tcttcatcgg tgcgagagcc aagagatccg ttgttgaaag ttgtatttat atgcgttatg 420

caaagacatt ccattacatt cagagtgtgt aaaaatacca tgagacccca gtcaaacacg 480

acgttcaacc agctgctcgt cagagacaag cggacctcac agtcaaaggt gcacaggtgt 540

gtggatttgc aatcgacgtg cacatgtgtt tccaccagca cagacgaccg cttatgattc 600

attaatgatc cttccgca 618

<210> 13

<211> 646

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcggaaggat cattaatgaa taaacttggt caagctgttg ctggtccttc ggggcatgtg 60

cacgcttgcc accaatttta accacctgtg caccttttgt agactgaaaa caaattctcg 120

aggaaactcg gattgagaac tgctgtgcgc aagccagctc ttcttgtgtt tctcagtcta 180

tgtctttaca taccccaaat gaatgtataa gaatgtattg ctaggccttt gtgcctttaa 240

atcaaataca actttcaaca acggatctct tggctctcgc atcgatgaag aacgcagcga 300

aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacct 360

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tatcctcaaa tgcattagca gagcttttgc cgctaactat tagtgtgata attatcaacg 540

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<210> 14

<211> 592

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tatgcttaag ttcagcgggt attcctacct gatccgaggt caacctttga tatagggggt 60

tttacggcag gggccggaac cactacagag gcgagataga tttactacgc ctagagtgag 120

aaccaactcc gccaatcact ttagggagct acgggcagtg ccgtaggctc ccaacgctaa 180

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ggcgcaatgt gcgttcaaag attcgatgat tcactgaatt ctgcaattca cattacttat 300

cgcatttcgc tgcgttcttc atcgatgcca gaaccaagag atccgttgtt gaaagtttta 360

acttattaag tttataattc agaatgccat aaaaacagag tttagttagc cgccggcggg 420

gagggccacc gggtagctag tcgtagacga taagacgttg agcacgatct agcacctggg 480

actacagggt aaccactacg tggtatcccc tatagggtag cctccgccgc cgaagcaaca 540

aaggtaagtt cacatagggt tgggagttta gaaaactctg taatgatccc tc 592

Claims

1.一株具有提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力的胶膜菌(Tulasnella sp.)菌株TP-8，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO:M 20211283。

2.一种提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力的菌肥，其特征在于，包括权利要求1所述胶膜菌菌株TP-8和可接受的营养成分。

3.权利要求1所述胶膜菌菌株TP-8或权利要求2所述菌肥在提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力中的应用。

4.一种提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力的方法，其特征在于，将铁皮石斛幼苗移栽至共生培养基上生长，将权利要求1所述胶膜菌菌株TP-8或权利要求2所述菌肥接种至共生培养基上，使胶膜菌真菌定殖于铁皮石斛幼苗根部，培养。

5.根据权利要求4所述提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力的方法，其特征在于，所述共生培养基包括燕麦琼脂培养基；

6.根据权利要求5所述提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力的方法，其特征在于，所述胶膜菌菌株TP-8的接种量为每120ml燕麦琼脂培养基接种0.4～0.6cm³胶膜菌菌株TP-8菌块。

7.根据权利要求4所述提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力的方法，其特征在于，所述培养的温度为23～27℃。

8.根据权利要求4所述提高铁皮石斛幼苗萌蘖能力的方法，其特征在于，所述培养的光周期为12L/12D；光照强度为2000～3000Lx。