CN113735978B

CN113735978B - 靶向cd19的嵌合抗原受体、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN113735978B
Application number: CN202110437265.8A
Authority: CN
Inventors: 李建强; 刘莹; 王琳
Original assignee: Hebei Senlang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hebei Senlang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-04-22
Filing date: 2021-04-22
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2041-04-22
Also published as: WO2022222846A1; CN113735978A

Abstract

本发明公开了靶向CD19的嵌合抗原受体、制备方法及其应用。本发明的嵌合抗原受体含有针对CD19的全人源的单链抗体。相比目前临床使用的利用针对CD19的鼠源单链抗体构建而成的CAR‑T细胞，本发明的CAR‑T细胞可明显降低免疫原性，可用于复发性CD19+白血病的治疗。

Description

靶向CD19的嵌合抗原受体、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及靶向CD19的嵌合抗原受体、制备方法及其应用。

背景技术

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，嵌合抗原受体修饰的T细胞)为代表的免疫疗法，其原理主要是通过基因工程手段对病人自身提取的T细胞进行嵌合抗原受体的修饰形成CAR-T细胞，该T细胞能特异性地识别肿瘤表面相关抗原(肿瘤细胞标志物)，从而靶向杀伤肿瘤。相对于常规免疫细胞，CAR-T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性都更高，并且可以克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态。该以CAR-T细胞为代表的修饰免疫细胞疗法在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显着的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

CAR-T免疫疗法是目前最具颠覆性潜力的新兴技术之一，欧美及亚洲各国都在积极开展该疗法的临床试验，其中中国开展临床试验项目最多，达204项，占据了全球CAR-T疗法临床试验的50％。宾夕法尼亚大学医院、费城儿童医院、美国癌症研究院(NCI)、FredHutchinson癌症研究中心、纪念斯隆凯特琳癌症中心和西雅图儿童医院等是最早开展CART细胞疗法的研究机构。新兴国际生物制药公司如Juno、Kite、Celgene、Cellectis、Bluebird，传统国际制药巨头如诺华、百时美施贵宝、辉瑞、强生、吉利德等都投入了大量资金和人力到CAR-T疗法的研发中，其中KITE和诺华公司所研发靶向CD19CART新药产品KTE-C19和CTL-019因为突出疗效先后获得FDA批准。

然而到目前为止，靶向CD19的CAR-T产品普遍存在因细胞因子释放综合症引起的发热或神经毒性副反应，为该产品的广泛临床使用和临床治疗带来较大的挑战。合成生物学技术的兴起和应用，为肿瘤的CAR-T免疫治疗提供更多开发安全、高效的CAR-T的选择，为开发更安全CAR-T新疗法和药物的开发提供了启示。

发明内容

本发明提供了一种靶向CD19的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体顺次包括以下组件：胞外抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域、共刺激信号转导结构域、初级信号传导结构域。

优选地，胞外抗原结合结构域为特异性结合CD19的scFv；所述scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，间隔结构域是IgG4铰链区；优选地，所述IgG4铰链区的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

优选地，所述跨膜结构域是CD28的跨膜区；优选地，所述CD28的跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，所述共刺激信号传导结构域是4-1BB的胞内信号传导结构域；优选地，所述4-1BB的胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选地，所述初级信号传导结构域是CD3ζ的胞内信号传导结构域；优选地，所述CD3ζ的胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的序列。

优选地，所述嵌合抗原受体进一步在其N端包含信号肽；优选地，所述信号肽是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体2信号肽。

优选地，所述嵌合抗原受体进一步在其C端包含自裂解肽；优选地，所述自裂解肽是T2A。自裂解肽与初级信号传导结构域的C末端连接。

T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

优选地，所述嵌合抗原受体进一步在其C端包含细胞表面标志物。

细胞表面标志物用于确定嵌合抗原受体是否被表达，具体地，所述细胞表面标志物用于确定所述细胞用于表达所述嵌合抗原受体的转导或工程改造，例如细胞表面受体的截短形式，例如截短的EGFR(tEGFR)。在一些方面中，所述标志物包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体(例如，tEGFR)或其功能变体的全部或部分(例如，截短形式)。

优选地，所述细胞表面标志物是EGFR中的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段(tEGFR)，优选地，tEGFR的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的实施方案的嵌合抗原受体可以包含合成的氨基酸代替一个或多个天然存在的氨基酸。此类合成的氨基酸为本领域已知的，并且包括例如，氨基环己羧酸、正亮氨酸、α-氨基n-癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨甲基-半胱氨酸、反式-3-羟脯氨酸和反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苯甲基-N’-甲基-赖氨酸、N’,N’-二苄基-赖氨酸、6-羟赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸以及α-叔-丁基甘氨酸。

本发明的实施方案的嵌合抗原受体可以被糖基化、酰胺化、羧酸化、磷酸化、酯化、N-酰化、经由例如二硫桥环化、或者转变为酸加成盐和/或任选地二聚化或多聚化。

本发明的实施方案的嵌合抗原受体可以通过本领域已知的方法获得。可以通过制备多肽或蛋白质的任何合适的方法制得嵌合抗原受体。从头合成多肽和蛋白质的合适方法为本领域已知的。另外，可以使用例如Green and Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第4版),Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)中所述的标准重组方法，使用本文所述的核酸重组产生嵌合抗原受体。可选地，本文所述的嵌合抗原受体可以通过公司商业合成。在这方面，本发明的嵌合抗原受体可以是合成的和/或重组的。

本发明提供了一种核酸，所述核酸编码前面所述的嵌合抗原受体。

进一步，所述核酸还包含启动子、和/或位于启动子之后的酶切位点、和/或位于酶切位点之后的kozak序列。

更进一步，启动子位于所述核酸的N端，所述启动子是延长因子1α的启动子；优选地，所述启动子序列如SEQ ID NO.9所示。

更进一步，所述酶切位点是Pac I的识别位点；优选地，所述酶切位点的序列如SEQID NO.10中第1-8位所示。

更进一步，所述kozak序列如SEQ ID NO.10中第9-14位所示。

优选地，所述核酸中信号肽的编码序列如SEQ ID NO.10中第15-78位所示。

优选地，所述核酸中scFv的编码序列如SEQ ID NO.10中第79-822位所示。

优选地，所述核酸中间隔结构域的编码序列如SEQ ID NO.10中第823-846位所示。

优选地，所述核酸中跨膜结构域的编码序列如SEQ ID NO.10中第847-939位所示。

优选地，所述核酸中共刺激信号传导结构域的编码序列如SEQ ID NO.10中第940-1068位所示。

优选地，所述核酸中初级信号传导结构域的编码序列如SEQ ID NO.10中第1069-1404位所示。

优选地，所述T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.10中第1405-1476位所示。

优选地，所述tEGFR的核苷酸序列如SEQ ID NO.10中第1477-2550位所示。

优选地，所述核酸中嵌合抗原受体的编码序列如SEQ ID NO.10中第15-2585位所示。

优选地，所述核酸包括SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种载体，所述载体包含前面所述的核酸。

在实施方案中，本发明的载体可以是任何合适的载体，并且可以被用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括设计以用于增殖和扩增或者用于表达或者用于这两种的那些载体，如质粒和病毒。载体可以选自：pUC系列(Fermentas Life Sciences,GlenBurnie,MD)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,CA)、pET系列(Novagen,Madison,WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)以及pEX系列(Clontech,Palo Alto,CA)。也可使用诸如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149的噬菌体载体。载体的实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

本发明提供了一种重组微生物，所述重组微生物包含前面所述的核酸或前面所述的载体；优选地，所述重组微生物是重组病毒。

本发明提供了一种经改造的免疫细胞，所述经改造的免疫细胞表达前面所述的嵌合抗原受体；优选地，所述免疫细胞含有前面所述的核酸或前面所述的载体。

本发明提供了一种免疫细胞群体，所述免疫细胞群体包括前面所述的经改造的免疫细胞；优选地，所述免疫细胞群体还包括未经改造的或改造不完全的免疫细胞。

本发明提供了一种前面所述的经改造的免疫细胞的制备方法，所述制备方法包括将前面所述的核酸或前面所述的载体导入免疫细胞中。

现有技术已知有数种合适的方法用于将核酸和相应的载体导入宿主细胞。方法包括但不限于磷酸钙转染、电穿孔、脂质体转染、利用转染试剂，例如阳离子脂质，生物射弹介导或多聚体介导的转移。

本发明的免疫细胞可以是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。本发明的免疫细胞可以是B细胞、自然杀伤(NK)细胞或T细胞。

本发明的T细胞可以是任何T细胞，如培养的T细胞，例如原代T细胞；或者是来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupT1等；或者是获自哺乳动物的T细胞。如果获自哺乳动物，T细胞可以获自多种来源，包括但不限于血液、骨髓、***、胸腺或者其它组织或液体。T细胞也可以是富集的或纯化的。T细胞可以是人T细胞。T细胞可以是分离自人的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，并且可以处于任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th 1和Th 2细胞)、CD8+T细胞(例如细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、初始T细胞等。T细胞可以是CD8+T细胞或CD4+T细胞。

本发明提供了一种组合物，所述组合物包括前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的核酸、前面所述的载体、前面所述的重组微生物、前面所述的经改造的免疫细胞、前面所述的免疫细胞群体。

优选地，所述组合物包括药物组合物，所述药物组合物还包括药剂学上可接受的载体。

药学上可接受的载体是在使用条件下，无有害副作用或毒性的载体。制备可施用药物的方法为本领域技术人员已知的或显而易见的，并且更详细地描述于，例如，Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第22版,Pharmaceutical Press(2012)。

载体的选择将部分由具体的本发明的核酸、载体、免疫细胞以及由用于施用本发明的核酸、载体、免疫细胞的具体方法决定。因此，存在多种合适的本发明的药物组合物的制剂。合适的制剂可以包括用于肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、瘤内或腹膜内施用的那些制剂中的任何制剂。可以使用多于一种途径来施用本发明的核酸、载体、免疫细胞，并且在某些情况下，特定途径可以比另一途径提供更直接以及更有效的应答。

本发明的药物组合物还可包括与本发明的核酸、载体、免疫细胞联合施用的其它药学活性剂或药物，所述其它药学活性剂或药物如化疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉酚、利妥昔单抗、长春花碱、长春新碱等。

当将本发明的核酸、载体、免疫细胞与一种或多种另外的治疗剂一起施用时，一种或多种另外的治疗剂可以共施用至哺乳动物。“共施用”意为在时间上足够接近地施用一种或多种另外的治疗剂和本发明的核酸、载体、免疫细胞，以使本发明的核酸、载体、免疫细胞可以增强一种或多种另外的治疗剂的作用，反之亦然。就这点而言，可以首先施用本发明的核酸、载体、免疫细胞，之后施用一种或多种另外的治疗剂，反之亦然。可选地，可以同时施用本发明的核酸、载体、免疫细胞和一种或多种另外的治疗剂。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的核酸、前面所述的载体、前面所述的重组微生物、前面所述的经改造的免疫细胞、前面所述的免疫细胞群体、前面所述的组合物。

本发明提供了一种应用，所述应用包括以下任一项所述的应用：

1)前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的核酸、前面所述的载体、前面所述的重组微生物、前面所述的免疫细胞、前面所述的免疫细胞群体、前面所述的组合物在制备治疗与CD19表达相关的疾病或病症的药物中的应用；

2)前面所述的嵌合抗原受体在制备前面所述的核酸、前面所述的载体、前面所述的重组微生物、前面所述的免疫细胞、前面所述的免疫细胞群体、前面所述的组合物、前面所述的试剂盒中的应用；

3)前面所述的核酸在制备前面所述的载体、前面所述的重组微生物、前面所述的免疫细胞、前面所述的免疫细胞群体、前面所述的组合物、前面所述的试剂盒中的应用；

4)前面所述的载体在制备前面所述的重组微生物、前面所述的免疫细胞、前面所述的免疫细胞群体、前面所述的组合物、前面所述的试剂盒中的应用；

5)前面所述的重组微生物在制备前面所述的免疫细胞、前面所述的免疫细胞群体、前面所述的组合物、前面所述的试剂盒中的应用；

6)前面所述的免疫细胞在制备前面所述的免疫细胞群体、前面所述的组合物、前面所述的试剂盒中的应用；

7)前面所述的免疫细胞群体在制备前面所述的组合物、前面所述的试剂盒中的应用；

8)前面所述的组合物在制备前面所述的试剂盒中的应用。

本发明提供了一种与CD19表达相关的疾病或病症的方法，所述方法包括给有需要者施用前面所述的核酸、前面所述的载体、前面所述的免疫细胞、前面所述的免疫细胞群体、前面所述的组合物。

本发明的与CD19表达相关的疾病或病症包括肿瘤、自身免疫和炎性疾病、感染性疾病。

进一步，所述肿瘤包括B细胞恶性肿瘤，例如B细胞白血病和淋巴瘤，包括B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、幼淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、常见急性淋巴细胞性白血病、非急性淋巴母细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、脾和边缘带淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤。

优选地，所述B胞恶性肿瘤是复发性CD19+白血病。

示例性的自身免疫和炎性疾病包括多发性硬化、类风湿性关节炎，和全身性红斑狼疮(SLE)。

本发明的优点和有益效果：

本发明利用全人源的靶向CD19的scFv构建CAR-T，相比鼠源的scFv，本发明的CAR-T具有更低的免疫原性，尤其适用于对鼠源CAR-T耐受的CD19+白血病的复发患者。

附图说明

图1显示人源H19-CAR基因具体结构示意图；

图2显示鼠源M19-CAR基因具体结构示意图；

图3显示CAR-T细胞扩增曲线图；

图4显示CAR转染率的统计图；

图5显示CAR-T细胞对Nalm-6细胞杀伤能力的结果图；

图6显示CAR-T细胞分泌细胞因子的结果统计图；

图7显示动物活体成像图；

图8显示荧光强度统计图。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了列举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1 CAR-T构建

1、构建慢病毒载体

将全人源或者鼠源CD19的scfv片段克隆至具有4-1BB和CD3ζ的第二代CAR结构骨架中，以T2A连接胞外tEGFR结构域，得到名称为H19-CAR(全人源)或者M19-CAR(鼠源)。H19-CAR基因具体结构为antiHCD19 scFv-IgG4hinge-CD28TM-4-1BB-CD3ζ-T2A-tEGFR，M19-CAR基因具体结构为antiMCD19 scFv-IgG4 hinge-CD28TM-4-1BB-CD3ζ-T2A-tEGFR(如图1和图2)。其中，anti HCD19 scFv是抗全人源CD19单链可变片段(scFv)的编码序列，antiMCD19scFv是抗鼠源CD19单链可变片段(scFv)的编码序列，IgG4 hinge为铰链区，CD28TM是跨膜区，4-1BB是共刺激结构域，CD3ζ为胞内信号转导结构域，通过T2A肽连接表达tEGFR胞外区域，以便病毒转导后检测CAR的表达。

H19-CAR基因编码链的编码序列是SEQ ID NO.10的第15-2585位，SEQ ID NO.10中第1-8位为Pac I的识别位点，第15-78位为信号肽的编码序列，第79-822位为全人源抗CD19单链可变片段(scFv)的编码序列，第823-846位hinge序列，第847-939位为CD28TM基因序列，第940-1068位为4-1BB基因序列，第1069-1404位为CD3ζ基因序列，第1405-1476位为T2A基因序列，第1477-2550位tEGFR基因序列。蛋白质H19-CAR氨基酸序列是序列表中SEQ IDNO.6所示。

H19-CAR基因表达载体(慢病毒表达载体)，为全序列合成，将其命名为Senl-H19，序列是SEQ ID NO.13所示。Senl-H19含有SEQ ID NO.10中第79-2550所示的H19-CAR基因的编码区，能在细胞中表达氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.6所示的蛋白质H19-CAR。

构建成功的慢病毒表达载体经Pac I和SpeI酶切鉴定及序列测定正确后，用于慢病毒包装。

将Senl_H19中全人源CD19的scfv替换成鼠源CD19的scfv(氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)，即制备而成Senl_M19表达载体。

2、慢病毒的制备

将已长到80％-90％的293FT细胞培养瓶(T175)从37℃、5％CO₂的细胞培养箱中取出，加入2mL TrypLE^TM EXPRESS消化后收集洗涤细胞，每145mm细胞培养皿中加入9×10⁶个细胞，加20mL DMEM培养基(Thermo Fisher)，轻轻摇匀，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养。

24h小时后，按照每个145mm平皿，375μl无血清DMEM培养基、15μg慢病毒表达载体Senl_H19或Senl_M19、7.5μg编码Rev蛋白的包装质粒psPAX2、3.75μg编码VSV-G蛋白的包膜质粒pMD2.G的量将以上溶液混合均匀，组成溶液A，315μl无血清DMEM培养基中加入60μlPEI转染试剂，混合均匀，组成溶液B，随后将溶液B加入到溶液A中混合均匀，室温静置20min。将用于包装病毒的293FT细胞从37℃5％CO₂的细胞培养箱中取出，将上述混合液平均加到每平皿中，轻轻摇匀，放入37℃5％CO₂培养箱中。4h-6h后，弃旧培养基，加入5mL已预热的PBS清洗细胞，再加入20ml新鲜的已预热的含10％胎牛血清的DMEM培养基，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。继续培养48h-72h后收取培养上清作为病毒原液，将原液收集到50ml离心管中，2000r/min，离心5min去除细胞沉淀，随后用50ml注射器将病毒原液通过0.45μm滤膜过滤到新的50ml离心管中，4℃，18300g高速离心2h。此即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液按100μl/管分装，另外留取10μl进行病毒滴度测定。将分装好的浓缩液置于-80℃保存。

3、外周血单个核细胞(PBMC)的制备

本外周血可以是健康供者也可以是患者本身的外周血。

将外周血与无菌生理盐水1：1混匀稀释后，缓慢加入到单个核细胞分离液(东方华辉)中(稀释血：分离液＝2:1)，800g，离心20min，升7降4，进行密度梯度离心。离心结束后将白膜层轻轻吸出转移至新的50mL离心管中，加入无菌生理盐水重悬后800g，4℃离心5min，离心结束后将上清液弃掉，用涡旋振荡器震散细胞沉淀层，加入无菌生理盐水定容至50mL，上下颠倒离心管、混匀后移入离心机，800g，4℃离心5min，得到的沉淀即为单个核细胞。

4、T细胞的分离

离心结束后向单个核细胞沉淀中加入细胞分选液(DPBS+0.5％HSA)(1×10⁷个细胞加80μl细胞分选液)和分选磁珠(MASC)(1×10⁷个细胞加20μl分选磁珠)，加入分选磁珠(健康供者外周血分选磁珠为CD3分选磁珠，患者自体外周血根据流式检测结果而定，可以是CD3分选磁珠、CD4和CD8分选磁珠等)，吹吸混匀后放入4℃冰箱避光孵育15分钟，孵育完成后按照每1×10⁷PBMC加入1～2mL细胞分选液，混匀后800g，4℃离心5min。按照1×10⁸PBMC加入500μL缓冲液，吹吸混匀细胞沉淀层。然后将细胞悬液加入已经准备好的磁力柱中，让其自由滴下，等到液体滴完后再加入3mL细胞分选液清洗磁力柱，重复2遍。留在磁力柱中的细胞即为阳性细胞。将磁力柱从磁力架中移出，加入5mL细胞分选液用磁力柱中的活塞用力挤压磁力柱中缓冲液，将磁力柱中的阳性细胞冲洗至离心管中，即为分选阳性细胞。

5、T细胞的活化培养

将装有分选阳性细胞的离心管混匀后800g，4℃离心5min。离心结束后将上清液弃掉，用含有200UI/mL IL-2的TexMACS GMP无血清培养基(MACS)重悬混匀，然后按照T细胞与活化磁珠CD3/CD28(Thermo Fisher)1:1的比例加入活化磁珠，放入37℃、5％CO₂细胞培养箱进行培养。

如无特殊说明，下述细胞培养的培养基均为含有200UI/mL IL-2的TexMACS GMP无血清培养基。

5、表达靶向CD19的CAR的T细胞制备

按照上述T细胞分离活化的方法制备T细胞。将分选出来的T细胞，加入DynabeadsCD3/CD28活化磁珠进行激活，放入37℃、5％CO₂细胞培养箱进行培养(记为Day0)，培养48小时后，用上述制备的病毒浓缩液加入到T细胞中，离心2小时(2000rpm，35℃，升速4，降速4)进行慢病毒转染，转染完成后放入37℃，5％CO₂细胞培养箱进行培养，Day5取样，通过流式细胞术进行CAR+比例检测。Day12到Day14收获细胞，通过洗涤去除培养基，并使用含1％HSA的0.9％生理盐水进行冲悬细胞获得表达靶向CD19的CAR的T细胞，表达全人源scFv的CAR-T细胞称为Senl_H19细胞，表达鼠源scFv的CAR-T细胞称Senl_M19细胞。

6、结果

CAR-T细胞的扩增曲线见图3、CAR转染率见图4。和对照Senl_M19细胞相比，Senl_H19细胞和Senl_M19细胞两者的扩增倍数没有明显差异，培养14天时扩增倍数均＞100倍。培养到14天时，Senl_H19细胞的CAR阳性率为52％±0.14％，与Senl_M19的CAR阳性率53.77％±12.2％无显著差异。结果表明，与鼠源的scFv相比，人源的scFv对细胞的生长和CAR转染没有显著影响。

实施例2 CAR-T细胞的体外功能研究

一、步骤

用培养第14天收获细胞作为效应细胞，用Nalm-6细胞(购买于通派生物细胞库)作为靶细胞。

首先收集靶细胞，2000rpm离心5min，DPBS重悬计数，按照2×10⁶个细胞添加100μl的2μM CFSE工作液的比例加入适量的2μM CFSE工作液，轻轻混匀。在37℃下避光孵育20min。孵育结束后，加入5倍体积的完全培养基(含10％FBS的1640)终止染色，2000rpm离心5min，用完全培养基重悬，37℃下避光孵育10min，孵育结束后2000rpm离心5min，完全培养基重悬细胞，调整靶细胞密度为1×10⁶个/ml，加入96孔板中，每孔100μl，孔密度为1×10⁵个/孔。然后根据不同效靶比下(E：T＝0.3:1、1:1、3:1、10:1)向靶细胞中添加适量的效应细胞，混合后孵育4小时，流式细胞术检测细胞杀伤比例。用2μL 7AAD和Anexxin V对细胞进行染色，避光孵育15min。CFSE标记的靶细胞的杀伤率(％)为Annexin V+/7AAD–、Annexin V+/7AAD+和Annexin V–/7AAD+三者比例之和。

另外取靶细胞，调整细胞密度为1×10⁶个/ml，加入96孔板中，每孔100μl，孔密度为1×10⁵个/孔，按照效应细胞E:T＝3:1，向每孔靶细胞中添加适量的效应细胞，混匀共同孵育18小时，取上清检测细胞因子的分泌(LEGENDplex HU Th1/Th2 Panel(8-plex)(Biolegend)。

二、结果

结果显示如图5和图6，Senl_H19细胞和Senl_M19细胞对Nalm-6细胞均具有强的杀伤力，在效靶比为0.3：1、1：1、3：1、10：1时，Senl_H19细胞对Nalm-6细胞的杀伤均值分别为17.8％、43.6％、76.5％和91.1％；Senl_M19细胞对Nalm-6细胞的杀伤均值分别为16.9％、39.8％、60.1％和89.0％。Senl_H19细胞和Senl_M19细胞上清中IFN-γ的浓度分别为3550.28pg/ml和2205.11pg/ml；TNF-α分别为470.86pg/ml和505.48pg/ml；IL-5的浓度分别为1182.50pg/ml和1483.29pg/ml；IL-13的浓度分别为3112.10pg/ml和3253.56pg/ml；IL-2的浓度分别为1328.96pg/ml和1286.70pg/ml；IL6的浓度分别为9.89/ml和13.45pg/ml；IL-10的浓度分别为31.34pg/ml和45.04pg/ml；IL-4的浓度分别为48.73pg/ml和30.26pg/ml。

实施例3 CAR-T细胞的体内功能研究

一、步骤

用人B淋巴细胞白血病细胞Raji-luc构建小鼠肿瘤模型。将5×10⁵个Raji-luc注射到6-8周龄、体重为20-24g的NCG小鼠(江苏集萃药康生物科技有限公司)的尾静脉中，活体成像检测成瘤后，回输细胞治疗。

将小鼠随机分为2组：Senl_H19细胞组和Senl_M19细胞组，每组6只。用上述CAR-T细胞培养方法分别制备Senl_H19细胞、Senl_M19细胞，将培养第14天收获的细胞做为本实施例使用的Senl_H19细胞、Senl_M19细胞和T细胞对照。每只小鼠通过尾静脉注射1×10⁷个CAR+细胞/只。每天监测小鼠存活情况和每7天用小动物活体成像仪(IVIS Lumina,SeriesIII，PE)观察肿瘤的生长特性并采集发光信号。

二、结果

图7为小动物活体成像仪检测图片，图8为荧光强度图。小鼠在给药后28天内全部存活。Senl_H19细胞组和Senl_M19细胞组小鼠临床症状明显改善，试验期间未出现与药物相关或无关的不良反应，说明Senl_H19细胞和Senl_M19细胞在小鼠体内具有抗淋巴细胞白血病的作用。

需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河北森朗生物科技有限公司

<120> 靶向CD19的嵌合抗原受体、制备方法及其应用

<141> 2021-04-22

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro

130 135 140

Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg

145 150 155 160

Ser Ser Lys Ser Leu Gln Asn Val Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp

165 170 175

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met

180 185 190

Ser Asn Leu Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe

210 215 220

Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly

225 230 235 240

Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met

1 5 10

<210> 3

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 4

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 6

<211> 823

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Thr Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro

130 135 140

Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg

145 150 155 160

Ser Ser Lys Ser Leu Gln Asn Val Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp

165 170 175

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met

180 185 190

Ser Asn Leu Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

195 200 205

Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe

210 215 220

Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Ile Thr Phe Gly

225 230 235 240

Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

245 250 255

Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

260 265 270

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

275 280 285

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

290 295 300

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

305 310 315 320

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

325 330 335

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

340 345 350

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

355 360 365

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

370 375 380

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

385 390 395 400

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

405 410 415

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

420 425 430

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu

435 440 445

Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

450 455 460

Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro

465 470 475 480

His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly

485 490 495

Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys

500 505 510

His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro

515 520 525

Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro

530 535 540

Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu

545 550 555 560

Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu

565 570 575

Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser

580 585 590

Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu

595 600 605

Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu

610 615 620

Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly

625 630 635 640

Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala

645 650 655

Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly

660 665 670

Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg

675 680 685

Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe

690 695 700

Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln

705 710 715 720

Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln

725 730 735

Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala

740 745 750

Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala

755 760 765

Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr

770 775 780

Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser

785 790 795 800

Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala

805 810 815

Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met

820

<210> 7

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg

20

<210> 8

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

35 40 45

Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

100 105 110

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys

165 170 175

Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu

195 200 205

Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys

210 215 220

Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu

225 230 235 240

Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met

245 250 255

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala

260 265 270

His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val

275 280 285

Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His

290 295 300

Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro

305 310 315 320

Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala

325 330 335

Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly

340 345 350

Ile Gly Leu Phe Met

355

<210> 9

<211> 1180

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60

ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120

gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180

gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240

gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300

acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcggggttg gaagtgggtg 360

ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg 420

gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc 480

tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg 540

gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc 600

cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg 660

agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc 720

tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc 780

agtagcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct caaaatggag 840

gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc 900

gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga 960

ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat 1020

ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta 1080

attctccttg gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac 1140

agtggttcaa agtttttttc ttccatttca ggtgtcgtga 1180

<210> 10

<211> 2550

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttaattaagc caccatgctg ctgctggtga ccagcctgct gctgtgcgag ctgccccacc 60

ccgcctttct gctgatccga ggtgcagctg gtggagagcg gcggcggcct ggtgaagccc 120

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cactgggtga gacaggcccc cggcaagggc ctggagtgga tcggctacat caacccctac 240

aacgacggca ccaagtacaa cgagaagttc cagggcagag tgaccatcag cagcgacaag 300

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tactgcgcca gaggcaccta ctactacggc accagagtgt tcgactactg gggccagggc 420

accctggtga ccgtgagcag cggtggtggt ggttctggcg gcggcggctc cggtggtggt 480

ggttctgaca tcgtgatgac ccagagcccc gccaccctga gcctgagccc cggcgagaga 540

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tactggttcc agcagaagcc cggccagagc ccccagctgc tgatctacag aatgagcaac 660

ctgaacagcg gcgtgcccga cagattcagc ggcagcggca gcggcaccga gttcaccctg 720

accatcagca gcctggagcc cgaggacttc gccgtgtact actgcatgca gcacctggag 780

taccccatca ccttcggcgc cggcaccaag ctggagatca aggaatctaa gtacggaccg 840

ccctgccccc cttgccctat gttctgggtg ctggtggtgg tcggaggcgt gctggcctgc 900

tacagcctgc tggtcaccgt ggccttcatc atcttttggg tgaaacgggg cagaaagaaa 960

ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1020

ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgcg ggtgaagttc 1080

agcagaagcg ccgacgcccc tgcctaccag cagggccaga atcagctgta caacgagctg 1140

aacctgggca gaagggaaga gtacgacgtc ctggataagc ggagaggccg ggaccctgag 1200

atgggcggca agcctcggcg gaagaacccc caggaaggcc tgtataacga actgcagaaa 1260

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ggccacgacg gcctgtatca gggcctgtcc accgccacca aggataccta cgacgccctg 1380

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acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc cctaggatgc ttctcctggt gacaagcctt 1500

ctgctctgtg agttaccaca cccagcattc ctcctgatcc cacgcaaagt gtgtaacgga 1560

ataggtattg gtgaatttaa agactcactc tccataaatg ctacgaatat taaacacttc 1620

aaaaactgca cctccatcag tggcgatctc cacatcctgc cggtggcatt taggggtgac 1680

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gaaatcacag ggtttttgct gattcaggct tggcctgaaa acaggacgga cctccatgcc 1800

tttgagaacc tagaaatcat acgcggcagg accaagcaac atggtcagtt ttctcttgca 1860

gtcgtcagcc tgaacataac atccttggga ttacgctccc tcaaggagat aagtgatgga 1920

gatgtgataa tttcaggaaa caaaaatttg tgctatgcaa atacaataaa ctggaaaaaa 1980

ctgtttggga cctccggtca gaaaaccaaa attataagca acagaggtga aaacagctgc 2040

aaggccacag gccaggtctg ccatgccttg tgctcccccg agggctgctg gggcccggag 2100

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gtggccctgg ggatcggcct cttcatgtga 2550

<210> 11

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60

atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120

gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180

cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240

gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300

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gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720

gtgaccgtga gcagc 735

<210> 12

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

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Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

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Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly

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Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

130 135 140

Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn

195 200 205

Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 13

<211> 9919

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

actagtgtcg acaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt 60

aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct 120

attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 180

tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac 240

gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc aactgtcagc tcctttccgg gactttcgct 300

ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 360

ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaagct gacgtccttt 420

ccatggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc 480

ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct 540

cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg 600

cctggaattc gagctcggta cctttaagac caatgactta caaggcagct gtagatctta 660

gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg aagggctaat tcactcccaa cgaagacaag 720

atctgctttt tgcttgtact gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 780

ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag 840

tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 900

cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt catgtcatct tattattcag tatttataac 960

ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga ggaacttgtt tattgcagct tataatggtt 1020

acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 1080

gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggctctag ctatcccgcc 1140

cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg 1200

ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca 1260

gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct agggacgtac ccaattcgcc ctatagtgag 1320

tcgtattacg cgcgctcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc 1380

gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa 1440

gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atgggacgcg 1500

ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca 1560

cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc 1620

gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct 1680

ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg 1740

ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc 1800

ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg 1860

attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg 1920

aattttaaca aaatattaac gcttacaatt taggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg 1980

gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat 2040

aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc 2100

gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa 2160

cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac 2220

tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga 2280

tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag 2340

agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca 2400

cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca 2460

tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa 2520

ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc 2580

tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa 2640

cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag 2700

actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct 2760

ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac 2820

tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa 2880

ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt 2940

aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat 3000

ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 3060

agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 3120

ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 3180

tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 3240

cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 3300

ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 3360

gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 3420

ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 3480

aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 3540

cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 3600

ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 3660

gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 3720

ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc 3780

ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc 3840

gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac 3900

cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact 3960

ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc 4020

aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat 4080

ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg cgcaattaac cctcactaaa 4140

gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg 4200

caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg 4260

ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct 4320

gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct 4380

agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg 4440

ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt 4500

gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt 4560

gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg gaaaccagag 4620

gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg cgaggggcgg 4680

cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag agatgggtgc 4740

gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat tcggttaagg 4800

ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag ggagctagaa 4860

cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca aatactggga 4920

cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata taatacagta 4980

gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga agctttagac 5040

aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc cgctgatctt 5100

cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata aatataaagt 5160

agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag tggtgcagag 5220

agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag cagcaggaag 5280

cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat tgtctggtat 5340

agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc tgttgcaact 5400

cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa gatacctaaa 5460

ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca ccactgctgt 5520

gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaatc acacgacctg 5580

gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct taattgaaga 5640

atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata aatgggcaag 5700

tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat tcataatgat 5760

agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag tgaatagagt 5820

taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga ggggacccga 5880

caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat ccattcgatt 5940

agtgaacgga tctcgacggt atcggttaac ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta 6000

cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat agcaacagac atacaaacta aagaattaca 6060

aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttat cgatgtcgac gataagcttt gcaaagatgg 6120

ataaagtttt aaacagagag gaatctttgc agctaatgga ccttctaggt cttgaaagga 6180

gtgggaattg gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag 6240

aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac 6300

tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat 6360

ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag 6420

gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg 6480

ccttgaatta cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcggggttgg 6540

aagtgggtgg gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt 6600

tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg 6660

tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct 6720

ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt 6780

ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg 6840

gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc 6900

tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg 6960

gtcggcacca gtagcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc 7020

aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag 7080

ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag 7140

gcacctcgat tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt 7200

ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca 7260

cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa 7320

gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgat taattaagcc 7380

accatgctgc tgctggtgac cagcctgctg ctgtgcgagc tgccccaccc cgcctttctg 7440

ctgatccgag gtgcagctgg tggagagcgg cggcggcctg gtgaagcccg gcggcagcct 7500

gaagctgagc tgcgccgcca gcggctacac cttcaccagc tacgtgatgc actgggtgag 7560

acaggccccc ggcaagggcc tggagtggat cggctacatc aacccctaca acgacggcac 7620

caagtacaac gagaagttcc agggcagagt gaccatcagc agcgacaaga gcatcagcac 7680

cgcctacatg gagctgagca gcctgagaag cgaggacacc gccatgtact actgcgccag 7740

aggcacctac tactacggca ccagagtgtt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac 7800

cgtgagcagc ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc ggtggtggtg gttctgacat 7860

cgtgatgacc cagagccccg ccaccctgag cctgagcccc ggcgagagag ccaccctgag 7920

ctgcagaagc agcaagagcc tgcagaacgt gaacggcaac acctacctgt actggttcca 7980

gcagaagccc ggccagagcc cccagctgct gatctacaga atgagcaacc tgaacagcgg 8040

cgtgcccgac agattcagcg gcagcggcag cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag 8100

cctggagccc gaggacttcg ccgtgtacta ctgcatgcag cacctggagt accccatcac 8160

cttcggcgcc ggcaccaagc tggagatcaa ggaatctaag tacggaccgc cctgcccccc 8220

ttgccctatg ttctgggtgc tggtggtggt cggaggcgtg ctggcctgct acagcctgct 8280

ggtcaccgtg gccttcatca tcttttgggt gaaacggggc agaaagaaac tcctgtatat 8340

attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg 8400

ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgcgg gtgaagttca gcagaagcgc 8460

cgacgcccct gcctaccagc agggccagaa tcagctgtac aacgagctga acctgggcag 8520

aagggaagag tacgacgtcc tggataagcg gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa 8580

gcctcggcgg aagaaccccc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc 8640

cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggagg cggggcaagg gccacgacgg 8700

cctgtatcag ggcctgtcca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc 8760

cctgccccca aggctcgagg gcggcggaga gggcagagga agtcttctaa catgcggtga 8820

cgtggaggag aatcccggcc ctaggatgct tctcctggtg acaagccttc tgctctgtga 8880

gttaccacac ccagcattcc tcctgatccc acgcaaagtg tgtaacggaa taggtattgg 8940

tgaatttaaa gactcactct ccataaatgc tacgaatatt aaacacttca aaaactgcac 9000

ctccatcagt ggcgatctcc acatcctgcc ggtggcattt aggggtgact ccttcacaca 9060

tactcctcct ctggatccac aggaactgga tattctgaaa accgtaaagg aaatcacagg 9120

gtttttgctg attcaggctt ggcctgaaaa caggacggac ctccatgcct ttgagaacct 9180

agaaatcata cgcggcagga ccaagcaaca tggtcagttt tctcttgcag tcgtcagcct 9240

gaacataaca tccttgggat tacgctccct caaggagata agtgatggag atgtgataat 9300

ttcaggaaac aaaaatttgt gctatgcaaa tacaataaac tggaaaaaac tgtttgggac 9360

ctccggtcag aaaaccaaaa ttataagcaa cagaggtgaa aacagctgca aggccacagg 9420

ccaggtctgc catgccttgt gctcccccga gggctgctgg ggcccggagc ccagggactg 9480

cgtctcttgc cggaatgtca gccgaggcag ggaatgcgtg gacaagtgca accttctgga 9540

gggtgagcca agggagtttg tggagaactc tgagtgcata cagtgccacc cagagtgcct 9600

gcctcaggcc atgaacatca cctgcacagg acggggacca gacaactgta tccagtgtgc 9660

ccactacatt gacggccccc actgcgtcaa gacctgcccg gcaggagtca tgggagaaaa 9720

caacaccctg gtctggaagt acgcagacgc cggccatgtg tgccacctgt gccatccaaa 9780

ctgcacctac ggatgcactg ggccaggtct tgaaggctgt ccaacgaatg ggcctaagat 9840

cccgtccatc gccactggga tggtgggggc cctcctcttg ctgctggtgg tggccctggg 9900

gatcggcctc ttcatgtga 9919

Claims

1.一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体顺次包括以下组件：胞外抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域、共刺激信号转导结构域、初级信号传导结构域；所述胞外抗原结合结构域为特异性结合CD19的scFv；所述scFv的氨基酸序列如SEQID NO.1或SEQ ID NO.12所示；

所述间隔结构域是IgG4铰链区；所述IgG4铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述跨膜结构域是CD28的跨膜区；所述CD28的跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述共刺激信号传导结构域是4-1BB的胞内信号传导结构域；所述4-1BB的胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述初级信号传导结构域是CD3ζ的胞内信号传导结构域；所述CD3ζ的胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的序列。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括以下组件：自裂解肽、细胞表面标志物。

3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述自裂解肽是T2A；所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述细胞表面标志物是tEGFR；所述tEGFR的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

6.一种核酸，所述核酸编码权利要求1的嵌合抗原受体。

7.根据权利要求6所述的核酸，其特征在于，所述核酸还包含启动子、和/或位于启动子之后的酶切位点、和/或位于酶切位点之后的kozak序列。

8.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述启动子位于所述核酸的N端，所述启动子是延长因子1α的启动子；所述启动子序列如SEQ ID NO.9所示。

9.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述酶切位点是Pac I的识别位点；所述酶切位点的序列如SEQ ID No.10中第1-8位所示。

10.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述kozak序列如SEQ ID NO.10中第9-14位所示。

11.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述核酸中信号肽的编码序列如SEQ IDNO.10中第15-78位所示。

12.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述核酸中scFv的编码序列如SEQ IDNO.10中第79-822位所示。

13.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述核酸中间隔结构域的编码序列如SEQID NO.10中第823-846位所示。

14.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述核酸中跨膜结构域的编码序列如SEQID NO.10中第847-939位所示。

15.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述核酸中共刺激信号传导结构域的编码序列如SEQ ID NO.10中第940-1068位所示。

16.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述核酸中初级信号传导结构域的编码序列如SEQ ID NO.10中第1069-1404位所示。

17.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述核酸中嵌合抗原受体的编码序列如SEQ ID NO.10中第15-2585位所示。

18.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述核酸中T2A的编码序列如SEQ IDNO.10中第1405-1476位所示。

19.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述核酸中tEGFR的编码序列如SEQ IDNO.10中第1477-2550位所示。

20.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述核酸包括SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。

21.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求6-20中任一项所述的核酸。

22.根据权利要求21所述的载体，其特征在于，所述载体序列如SEQ ID NO.13所示。

23.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物包含权利要求6-20中任一项所述的核酸或权利要求21或22所述的载体。

24.根据权利要求23所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物是重组病毒。

25.一种经改造的免疫细胞，其特征在于，所述经改造的免疫细胞表达权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体。

26.根据权利要求25所述的经改造的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞含有权利要求任一项6-20中所述的核酸或权利要求21或22所述的载体。

27.一种免疫细胞群体，所述免疫细胞群体包括权利要求25或26所述的经改造的免疫细胞。

28.根据权利要求27所述的免疫细胞群体，其特征在于，所述免疫细胞群体还包括未经改造的或改造不完全的免疫细胞。

29.一种权利要求25或26所述的经改造的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将权利要求6-20中任一项所述的核酸或权利要求21或22所述的载体导入免疫细胞中。

30.一种组合物，所述组合物包括权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求6-20中任一项所述的核酸、权利要求21或22所述的载体、权利要求23或24所述的重组微生物、权利要求25或26所述的经改造的免疫细胞、权利要求27或28所述的免疫细胞群体。

31.根据权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括药剂学上可接受的载体。

32.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求6-20中任一项所述的核酸、权利要求21或22所述的载体、权利要求23或24所述的重组微生物、权利要求25或26所述的经改造的免疫细胞、权利要求27或28所述的免疫细胞群体、权利要求30所述的组合物。

33.权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求6-20中任一项所述的核酸、权利要求21或22所述的载体、权利要求23或24所述的重组微生物、权利要求25或26所述的经改造的免疫细胞、权利要求27或28所述的免疫细胞群体、权利要求30所述的组合物在制备治疗与CD19表达相关的疾病或病症的药物中的应用。

34.根据权利要求33所述的应用，其特征在于，与CD19表达相关的疾病或病症包括肿瘤、自身免疫和炎性疾病、感染性疾病。

35.根据权利要求34所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括B细胞恶性肿瘤。

36.根据权利要求35所述的应用，其特征在于，所述B胞恶性肿瘤包括B细胞白血病和淋巴瘤。

37.根据权利要求36所述的应用，其特征在于，所述B细胞白血病包括B细胞慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、幼淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、常见急性淋巴细胞性白血病、非急性淋巴母细胞性白血病。

38.根据权利要求36所述的应用，其特征在于，所述淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、脾和边缘带淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤。

39.根据权利要求37所述的应用，其特征在于，所述B胞恶性肿瘤是复发性CD19+白血病。

40.一种应用，所述应用包括以下任一项：

1）权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体在制备权利要求6-20中任一项所述的核酸、权利要求21或22所述的载体、权利要求23或24所述的重组微生物、权利要求25或26所述的经改造的免疫细胞、权利要求27或28所述的免疫细胞群体、权利要求30所述的组合物、权利要求32所述的试剂盒中的应用；

2）权利要求6-20中任一项所述的核酸在制备权利要求21或22所述的载体、权利要求23或24所述的重组微生物、权利要求25或26所述的经改造的免疫细胞、权利要求27或28所述的免疫细胞群体、权利要求30所述的组合物、权利要求32所述的试剂盒中的应用；

3）权利要求21或22所述的载体在制备权利要求23或24所述的重组微生物、权利要求25或26所述的经改造的免疫细胞、权利要求27或28所述的免疫细胞群体、权利要求30所述的组合物、权利要求32所述的试剂盒中的应用；

4）权利要求23或24所述的重组微生物在制备权利要求25或26所述的经改造的免疫细胞、权利要求27或28所述的免疫细胞群体、权利要求30所述的组合物、权利要求32所述的试剂盒中的应用；

5）权利要求25或26所述的免疫细胞在制备权利要求27或28所述的免疫细胞群体、权利要求30所述的组合物、权利要求32所述的试剂盒中的应用；

6）权利要求27或28所述的免疫细胞群体在制备权利要求30所述的组合物、权利要求32所述的试剂盒中的应用；

7）权利要求30所述的组合物在制备权利要求32所述的试剂盒中的应用。