CN1444657A - 用于动物细胞的表达载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于动物细胞的表达载体。特别是，本发明涉及的一种表达载体，pMS载体，pSG载体和pMSG载体，包括人β－珠蛋白5’MAR的互补序列和/或胃泌素基因的转录终止位点。采用本发明的表达载体的表达体系可以成功地在各种动物细胞中生产重组蛋白，并且重组蛋白具有单一的结构和功能。

Description

用于动物细胞的表达载体
技术领域
本发明涉及一种用于动物细胞的表达载体，特别是，含有核基质着丝溢痕成分(在其后称作“MAR成分”)和胃泌素基因的转录终止位点的表达载体。
背景技术
各种各样的表达体系，如微生物，植物，酵母，昆虫细胞和动物细胞通过可获得的所期望的大分子蛋白表达而被普遍的用于药物治疗。在多种多样的表达体系中，微生物最易于用作表达体系，各种各样的微生物体系已被作为表达体系而研究和利用。
然而，微生物表达体系的应用在某些方面是有限的。首先，尽管基因在微生物中被表达，但被表达的蛋白的结构和特性与其动物蛋白的并不同，因为微生物具有不同的表达蛋白的机制和蛋白的修饰机制，如糖基化，磷酸化和胺基化。因此，由微生物产生的重组蛋白几乎没有被修饰，或者它在蛋白质的修饰和结构的差别不足以影响蛋白产物的功能的蛋白质的产生中受限制。另外，使用微生物表达的重组蛋白时，被污染的微生物或毒素的清洗步骤是必要的。
虽然动物细胞适用于动物蛋白的表达，但一般不使用采用动物细胞的表达体系，因为与微生物和动物细胞的表达体系相比，归因于重组蛋白的更低表达效率，采用动物细胞的表达体系会造成更高的生产成本。
用于工业生产的动物细胞，它目前被用于包括CHO(中国鼠的卵巢)、BHK(幼鼠的肾)和骨髓瘤的表达体系，表达载体被导入到这种动物细胞并像在微生物中一样产生希望的外源蛋白。
由于通常表达少量的外源蛋白，因此，通过各种方法修饰基因表达体系。例如，CHO的细胞毒株在含有氨甲蝶呤(其后称作“MTX”)的培养基中培养，氨甲蝶呤是DHFR(二氢叶酸还原酶)的抑制剂，以便获得存活依赖于MTX浓度的CHO的毒株，并且归因于基因复制数的增加更高地表达蛋白。
通常，当外源基因在一种动物细胞中被表达时，外源基因被具有选择性标记物的载体共转染，在选择性培养基培养数小时后选择转化的细胞。然而，能够完成的高表达细胞的克隆的频率是低的。外源基因表达的低频率是由于在动物体系中外源基因的染色体的***不像微生物那样。另外，尽管外源基因的***过程是成功的，但不能期待外源基因的表达，原因是每个基因的***位点不同而且基因表达要依靠***位点。(Grindley等，1987.Trends Genet.3，16-22；Kucherlapati等，1984.Crit.Rev.Biochem.16，349-381；Palmiter等，1986.Annu.Rev.Genet.20，465499)。所以，尽管外源基因是稳定地完整的，其表达量也可能很低，因为在动物细胞中大部分的基因表达被邻近的核苷酸抑制(Eissenberg等，1991.Trends Genet.7，335-340；Palmiter等，1986.AnnuRev.Genet.20，465-499)。
为了保护外源基因的表达不受位置效应，在几个体系中应用核基质成分的可能性已有报道。可效仿的核成分包括绝缘体成分，核基质着丝溢痕(其后称作“MAR”)，支架结构着丝溢痕(其后称作“SAR”)。
Kalos(Kalos等，1995 Mol.Cell.Biol.15，198-207)提出当阿朴脂蛋白BMAR组合最小的启动子反基因构建子时，外源基因被稳定的导入到宿主的染色体，这样转录物的表达量增加了200倍。和上述方法类似，已经报道小鸡溶解酶A MAR和β-干扰素SAR能够增加外源基因在脊椎动物细胞中的表达水平，而不用考虑染色体的***位点(Eissenberg等，1991.Trends Genet.7，335-340；Klehr等，1991.Biochemistry30，1264-1270)。然而，并没有核实MAR和SAR能够增加在CHO细胞毒株中蛋白的产生，或者MAR和SAR适用于常规用途。
当动物细胞基因被表达，mRNA的合成从启动子出现并在终止位点停止。蛋白的表达水平通常受转录终止的效率以及合成mRNA的稳定性的影响。
包含在表达载体中的转录的终止位点控制聚腺苷酸化，并影响mRNA的稳定性。终止位点包括聚-A信号，***位点，终止位点，并且聚腺苷酸化信号是AATAAA，它已经被很好地研究。然而，发生聚腺苷酸化的***位点和基因转录通过RNA聚合酶II完成的终止位点是未知的。另外，尽管报道了除了三种临界区域外富含GU/U的区域控制mRNA的聚腺苷酸化，但其详细机理是未知的。
通常用于动物细胞的表达载体包含SV40病毒和BGH(牛生长素)的聚-A信号，并且没有提出为了使用动物细胞表达载体而研发这种提高mRNA稳定性和表达水平的特别终止子。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种表达载体，它在用于动物细胞体系的外源蛋白的表达中具有增加的外源基因表达效率和水平。
为了达到这些目的，本发明提供一种包括MAR(核基质着丝溢痕)成分或其启动子在5’-末端的互补序列的表达载体。
同样，本发明提供了一种包括SV40病毒的聚-A(聚腺苷酸化)信号和胃泌素基因转录终止位点组成的构建子的动物细胞的表达载体，其中的构建子具有序列SEQ ID No.3。
同样，本发明提供了一种如序列SEQ ID No.8所示的载体pMSGKCCM10202，它包括人β-珠蛋白5’MAR(核基质着丝溢痕)的互补序列，其构建子由SV40病毒的聚-A信号和胃泌素基因的转录终止位点组成。
同样，本发明提供了一种通过使用动物细胞的表达载体制备生物活性物质的方法，载体包括β-珠蛋白MAR成分，或者β-珠蛋白在启动子5’-末端的互补序列，包括如序列SEQ ID No.3所示的SV40病毒的聚-A(聚腺苷酸化)信号和胃泌素基因的转录终止位点的载体，和pMSG载体。
附图说明
图1显示表达载体的结构，载体通过组合SV40启动子和基因表达报道用的β-gal基因制备；
图2显示本发明使用的种种MAR和SAR成分诱导的β-Gal的表达频率；
图3显示表达的β-Gal的活性，它表明本发明的MAR和SAR成分对β-Gal表达的影响；
图4显示基于本发明β-珠蛋白MAR DNA序列的MAR成分的各种突变株构建子形式；
图5显示含MAR成分的载体转染到CHO细胞后，β-Gal蛋白的表达频率和表达数量；
图6显示在以pMS-β-gal或作为对照的pSV-β-gal转化的动物细胞中用于确认β-Gal基因复制数(a：对照组，b：本发明)，RNA数(c：对照组，d：本发明)，以及作为选择性标记的新基因的复制数(e：对照组，f：本发明)的DNA和RNA印迹。
图7显示在以pMS-β-gal或作为对照的pSV-β-gal转化的动物细胞中，表示β-Gal基因的复制数和β-Gal表达产量之间关系的曲线；
图8显示在各种细胞系中pMS-β-gal载体的表达效价；
图9显示在以pMS-β-gal载体或对照载体转化的细胞中依靠MTX浓度的外源蛋白的表达量；
图10显示与对照组相比，scu-PA(单链尿激酶)被***到pMS载体和pMC载体之后，scU-PA的表达效价；
图11显示包括胃泌素基因的转录终止位点和SV40的聚-A信号的构建子；
图12显示在包括含胃泌素基因转录终止位点和SV40聚-A信号的构建子的表达载体中β-Gal的表达量；
图13显示本发明的pMSG的结构；
图14显示通过抗原-抗体反应证实的pMSG载体中TGF-βSRII的表达；
图15显示TGF-βSRII表达量，它通过将TGF-βSRII基因克隆到pMSG载体，在CHO细胞中转染它们，在加入MTX的条件下培养而制备。
具体实施方式
下文将详细地说明本发明。
发明人克服了当外源基因在动物细胞系中表达时特异位点效应引起的问题，并设计增加了基因的表达量的最佳表达载体。
本发明的动物细胞表达载体包括合适的碱基序列，并进一步加入了常规的表达载体。合适的碱基序列包括核基质着丝溢痕(下文称作“MAR”)和支架结构着丝溢痕(下文称作“SAR”)，它们从***位点的位置效应刺激如CHO(中国鼠卵巢)和BHK(幼鼠肾)的宿主外源基因的表达，增加了外源基因的表达量。
MAR或SAR成分加入到启动子5’-末端，分析本发明的表达载体的效率。从细胞分离染色体DNA，接着通过PCR(聚合酶链式反应)和亚克隆在大肠杆菌E.coli中克隆染色体DNA，这样以致于获得含MAR和SAR成分的DNA。
更优选的，MAR或SAR成分从由小鸡溶解酶5’MAR(Phi-Van，L.andStratling，W.H.，Biochemistry35，10735-10742(1996)，gene bank#：X98408)，小鸡pia珠蛋白5’MAR(Krevskii，V.A.，Mikhailov，V.S.andRazin，S.V.，Mol.Biol.26，672-678(1992)，gene bank#：X64113)，人β-珠蛋白5’MAR(Yu，J.，Bock，J.H.，Slightom，J.L.and Villeponteau，B.，Gene139(2)，139-145(1994)，gene bank#：L22754)，CHO DHFR内含子MAR((Kas，E.andChasin，L.A.，J.Mol.Biol.198(4)，677-692(1987)，gene bank#：X06654)，人HPRT内含子MAR(Sykes，R.C.，Lin，D.，Hwang，S.J.，Framson，P.E. and Chinaμlt，A.C.，Mol.Gen.Genet.212.301-309(1988)，genebank#：X07690)，人CSP-B基因旁侧的SAR(Handson，R.D.and Ley，T.J.，gene bank#：M62716)，和人干扰素β-基因旁侧的SAR(Mielke，C.，Kohwi，Y.，Kohwi Shigematsu，T.and Gode，J.，Biochemistry 29，7475-7485(1990)，genen bank#：M83137)组成的组中选择。
在动物细胞表达载体中整合MAR和SAR，为了确定MAR/SAR和表达效价之间的关系，诱导载体的β-Gal表达。
pSV-β-gal启动子的5’-末端通过体外PCR诱变与多克隆位点(下文称作“MCS”)结合，这样获得了重组载体(I和II型载体)，如图1所示。***MAR或SAR至重组载体pSV-β-galI或II型的SV40启动子的5’-末端的前面，准备好试验载体，试验载体被转化到CHO DG44中。在包含G418(新霉素)的培养基上选择转化的CHO DG44，通过着色β-Gal(用IPTG和X-Gal的蓝着色)计算表达效价。为测量表达效价，计算表达频率、表达细胞数量、和β-Gal表达的数量。
图2显示本发明使用的种种MAR和SAR成分诱导的β-Gal的表达频率。pSV-β-gal载体的β-Gal表达频率为大约20到30％，而包括β-珠蛋白MAR，和CSP-B SAR或干扰素βSAR的试验载体增加了在阳性细胞系中的表达频率，更优选，包括β-珠蛋白MAR的试验载体的β-Gal表达频率为大约70到80％。
另外，依照各种MAR成分和SV40启动子组合制备构建子，并且SV40病毒启动子与重组蛋白表达的影响进行比较。为了比较β-Gal产物的产量，实施β-Gal着色法和β-Gal酶计算法，并且在相同数目的阳性细胞系中分析β-Gal活性，原因是表达频率依每个MAR成份而不同；
图3显示使用β-珠蛋白MAR，CSP-B SAR和干扰素β-SAR成分时，与pSV-β-gal的相比，根据各种MAR和SAR成分、每阳性细胞的β-Gal的量或者β-Gal增加的活性，表达的的β-Gal的活性。据观察含β-珠蛋白MAR成分的载体表达量增加了7倍或更多。
从而，在MAR成分中，β-珠蛋白MAR成分在本发明中是更优选的。
为了研究β-珠蛋白MAR成分的影响和效率，分析MAR成分的DNA序列。
β-珠蛋白成分包括2,999个碱基，它们的功能未被详细了解。β-珠蛋白MAR成分包括共有序列和位于800bp区域的3’端的alu成分244个碱基对，并且这里存在富含A+T(腺嘌呤，胸腺嘧啶)的序列。据报道alu位点包括两条直接重复单体单元的300个碱基对，其重组经常发生在这个位点，原因是在真核细胞的染色体中存在成千上万的同源位点。(Jagadeeswaran等，1982.Nature 296，469-470；Rogers.1985.Int.Rev.Cytol.93，187-279)。当β-珠蛋白MAR的alu位于SV40启动子的上游时，细胞进行较长时间的培养，重组可以发生。
因此，发明人设计了没有上述不好的效应的β-珠蛋白MAR突变株。
图4显示了β-珠蛋白MAR突变株，它通过制备MAR的互补序列b，缺失突变体c，d，e，f，g和i，以及将它们整合到pSV-β-GalI型中而生产。
包括β-珠蛋白MAR的突变株的载体被导入到CHO细胞之后，计算β-Gal表达的细胞数和β-Gal的数量，结果如图5所示。大多数的β-珠蛋白MAR突变株的β-Gal表达效价降低；相反，以包括β-珠蛋白MAR互补序列的pMS-β-gal载体转化的细胞系的效价高。图6和7显示重组蛋白表达量和整合基因的复制数之间的关系，pSV-β-Gal的表达量独立于整合基因的复制数，含pMS-β-Gal的转化载体的表达量和整合基因的复制数是成比例的。由于β-珠蛋白MAR的互补序列允许alu存在于启动子的另一侧，载体重组的可能性减少，通过防止***位点的特异性作用使得表达量增加。因此，β-珠蛋白MAR互补序列在本发明是优选的。
经核实MAR或SAR成分位于载体的启动子的常规表达的5’端，并且MAR或SAR突变株，或互补序列被整合到常规的表达载体中，这样外源蛋白的表达效价增加。因此，本发明提供一种包括MAR或SAR成分的表达载体，和包括MAR或SAR突变株的表达载体，或者它们的互补序列。MAR或SAR是从由pi-a MAR(小鸡piα-珠蛋白5’MAR)，β-珠蛋白MAR(人β-珠蛋白5’MAR)，DHFR MAR(CHO DHFR内含子MAR)，HPRT MAR(人HPRT内含子MAR)，  CSP-B SAR(人CSP-B基因旁侧的SAR成分)，干扰素-β SAR成分(人干扰素-β基因旁侧的SAR成分)，和溶MAR(小鸡溶菌酶5’MAR)组成的组中优选。
在它们中间，本发明的载体pMS(KCCM10203)由包含在SV40病毒启动子的5’末端的人β-珠蛋白MAR互补序列和多克隆位点的6287个碱基对组成，并且能够通过基因整合到多克隆位点表达重组蛋白。pMS碱基序列被编译为序列表软件中的序列SEQ ID No.l。
使用β-珠蛋白MAR互补序列时，与仅使用SV40启动子时外源基因的表达频率和表达量相比，外源基因的表达频率和表达量分别增加3到4倍，和7到10倍。此外，pMS-β-gal载体适于图8显示的各种各样的动物细胞，并且pMS-β-gal载体***优选适用于BHK，CHO，NIH3T3，和HEK293。图9表示当外源基因在pMS-β-gal载体***表达时借助于加入MTX(新霉素)的表达效价增量。
为依照MAR或SAR来计算外源蛋白的表达效价，使用CMV启动子(巨细胞病毒)。由于依靠于启动子的种类和细胞株的不同，外源基因的表达效价也不同，因此CMV启动子也在被测试。为了验证β-珠蛋白MAR互补序列对CMV启动子功能的影响，通过与制备pMS相类似的方法制备pMC载体，并将scu-PA基因整合到pMS，pMC，和对照载体中。
图10显示的为scu-PA在由pMSPUK，pMCPUK，pSPUK，和pMCPUK载体转化的CHO中的表达效价，它通过将scu-PA整合到pMS，pMC，pSV，和pCMV中来制备，pMS和pMC的基因表达比pSV和pCMV的增加了4倍。因此，本发明所述的β-珠蛋白MAR互补序列可以通过与所期望的启动子适当的结合用于动物细胞的蛋白表达。
由于本发明包括β-珠蛋白MAR互补序列的载体和外源基因被整合成为宿主细胞，以常规的方法可从动物细胞中获得有用的蛋白。
在本发明中，制备人胃泌素基因的转录聚-A信号、***位点和人胃泌素终止位点，它们被应用于本发明的表达载体中以便增加mRNA的稳定性，从而增加了表达载体的效率。
人胃泌素基因，3’端的转录调节区域包括包含信号聚-A、***位点、终止位点和人胃泌素基因的碱基序列的605个碱基对，3’端的转录调节区域如序列SEQ ID No.2所示。***位点位于从信号聚-A开始下游的第15个碱基对，终止位点位于从信号聚-A开始下游的第220个碱基对。胃泌素在终止位点完成转录，在***位点发生***和mRNA的聚腺苷酸化。
本发明人期望由SV40聚-A和胃泌素基因的转录终止位点组成的构建子如图所示，它能够增加基因的表达效价。
图11显示由胃泌素基因的转录终止位点和SV40聚-A组成的构建子，这类构建子优选从pSV-SPA(SPA；SV40聚腺苷酸化的信号)为″a″，pSV-SPA-GTF(GTF；胃泌素基因的转录终止位点)为″b″，pSV-SPA-GTR(GTR；GTF的互补序列)为″c″，pSV-GPA(GPA；胃泌素的聚腺苷酸化的信号)为″d″，pSV-GPA-GTF为″e″，pSV-GPA-GTR为″f″，pSV-GMPA(GMPA；GPA突变体)为″g″，pSV-GMPA-GTF为″h″，pSV-GMPA-GTR为″i″中选择。SPA-GTF，SPA-GTR，SPA-GPA，SPA-GPMA的基本序列在序列表中分别为S EQ ID No.3，No.4，No.5，和No.6。为了计算β-Gal的表达效价，所有的构建子被分别整合到pSV-β-gal中，并进一步导入到COS-7细胞株中。表达效价是β-Gal的表达量，如图12所示。含有由SV40信号聚-A和胃泌素基因转录终止位点组成的构建子的pSG载体，具有增加蛋白表达量4倍的作用。因此，终止位点优选使表达效价增加的SPA-GTF(SV40信号聚-A和胃泌素基因转录终止位点)。本发明中，构建子用做常规的表达载体的终止位点，这样以致于外源蛋白的表达量增加。可效仿的本发明表达载体包括pSG.。
pSG载体是一种在其终止位点与SPA-GTF整合的载体，含3309碱基对。pSG.载体的碱基序列列于序列表SEQ ID No.7。β-Gal***pSG.载体以便计算表达效价，从通过由胃泌素基因的转录终止位点和SV40病毒的信号聚-A组成的构建子而稳定的mRNA中得到pSG.的表达效价是pSV载体的4倍多。
因此，包含SPA-GRF的载体可以在动物宿主中以常规的方法表达外源基因，可以获得如具有生物活性物质的有用的蛋白。
另外，本发明提供了一种表达载体，它包括两个可以增加外源基因表达效价的位点。这两个位点是以SV40聚-A，和β-珠蛋白MAR互补序列连接胃泌素基因转录终止位点的转录终止位点。
图13显示了本发明的pMSG结构，总碱基序列为6347个碱基对，如序列表列出的SEQ ID No.8，pMSG被保藏在韩国微生物保藏中心KCCM10202。下述表1是pMSG的详细说明图。
    序号     功能
    1-419     SV40的早期的启动子和增强子
    420-448     多克隆位点(MCS)
    449-656     转录终止位点
    3365-6329     β-珠蛋白MAR互补序列
    1272-2132     β-内酰胺酶(AmpR)
表1
TGF-βSRII基因的蛋白，能够通过选择性结合活性人蛋白TGF-β而预防TGF-β副作用。为了分析本发明的pMSG的作用和效率，表达TGF-βSRII。结果如图14所示，由于TGF-βSRII蛋白具有一个糖基化结构，该蛋白具有比其同源蛋白大的分子量，和典型的动物细胞具有的一样。TGF-βSRII初始的表达量为大约100ng/106细胞/天，大部分细胞被相同的表达。另外，如图15所示，当1μM的MTX加入到TGF-βSRII细胞时，至多获得的10μg/106细胞/天。TGF-β在人体中具有许多种功能，特别是，已发现它是导致炎症的因子，如肾小球硬化体，肝硬变，表皮细胞角质化和软骨咬合面，TGF-βSRII可以用于TGF-β-过度表达疾病的治疗。
本发明的pMSG载体克服了一个常见的问题，即低表达产量和获得转化突变型的困难，并且它能够大量产生各种重组蛋白，如具有生物活性的物质。
另外，pMS载体(KCCM-10203)被开发，它不会被***位点的邻近碱基而抑制它的表达，pMS产生的重组蛋白大约是常规的SV40启动子的8倍多。
而且，制备pSG载体，它包括转录终止位点，该转录终止位点能够在特定的转录位点感应转录子的转录终止位点并比常规的聚-A位点组成增加了3倍。
本发明的pMSG载体(KCCM-10202)是通过功能性DNA片断和可适用于外源基因的多克隆位点的连接来制备的，并且TGF-β在动物细胞中被表达时，表达量为10μg/106细胞/天。从而，本发明的表达载体适合于表达重组蛋白，依照本发明，来源于在原核生物中表达的真核细胞的蛋白可以在动物细胞中生产为具有和野生型蛋白相同的结构和功能的重组蛋白。
下述实施例进一步详细说明本发明，但并不构成对其范围的限制。
实施例1：pMS-β-gal载体的制备
(1)pMS-β-gal载体的制备
按如下方法制备pMS-β-gal载体。
①为了获得人β-珠蛋白MAR的碱基序列，从G-2细胞分离基因组DNA：
用Wizard基因组DNA纯化试剂(Promega Co.生产的)从人宿主的G-2细胞分离基因组DNA，接着是生产公司提供的实验方法后的纯化步骤。
②基因组PCR和亚克隆的完成：
为了获得人β-珠蛋白5’MAR的片段，纯化的基因组DNA用作模板，β-珠蛋白MAR的正向引物BML 1和反向引物BMR 1用于基因组聚合酶链式反应(PCR)中。BML1和BMR1在序列表中分别为SEQ ID No.9和SEQID No.10。PCR循环执行32次。表2中显示循环次数。
    试验条件     循环数
  1     94℃，2分钟     1
  2     94℃，30秒-＞60℃，45秒-＞72℃，45秒     2-31
  3     72℃，10分钟     32
表2
PCR之后，PCR的产物***到pT7blue载体中(Novagen Co.)，制备pT7blue/β-珠蛋白MAR载体。pT7blue载体是一种能够直接克隆PCR产物的TA克隆载体。
③制备包含多克隆位点(MCS)的重组载体pSV-β-gal I和II型：
为了在pSV-β-gal载体启动子的上游***pT7blue载体的β-珠蛋白MAR，制备pSV-β-gal I型和II型。
首先，为了制备pSV-β-gal载体I型，用Spe I和Hind III处理pSV-β-gal之后，包含SV40启动子的Spe I/Hind III的443个碱基对的片断被含基因清洗试剂III(BIO 101 Co.)的琼脂糖凝胶纯化。该片断通过Spe I/Hind III消化被连接到线性pBluescript SK(+)(Stratagene Co.)，并且制备pBluescrip/SV40I启动子载体。
然后，以Sca I和Hind III处理pBluescrip/SV40 I启动子载体，包含SV40启动子的片断采用如上述同样的方式由琼脂糖凝胶纯化，该片断通过Sca I和Hind III的消化被连接到线性的pSV-β-gal载体，这样I型载体制备完成。
另外，为了生产pSV-β-gal II型载体，在以EcoR I和Hind III处理pSV-β-gal之后，采用上述同样的方式通过琼脂糖凝胶纯化包含SV40启动子的EcoR I/Hind III的420个碱基对的片断，该片断通过EcoR I和Hind III的消化被连接到线性的pBluescript SK(+)，这样pBluescript/SV40 II型启动子载体制备完成。
为了按如上述相同的方式通过琼脂糖凝胶纯化包含SV40启动子的片断，以Sca I和Hind III处理pBluescript/SV40 II型的启动子载体，该片断通过Sce I和Hind III的消化被连接到线性的pSV-β-gal载体，这样pSV-β-gal载体II型制备完成。
④制备pMS-β-gal载体：
以Spe I和Sma I处理pT7blue/β-珠蛋白MAR载体，琼脂糖凝胶纯化包含β-珠蛋白MAR的大小为3kb DNA片断，通过Spe I和Sma I片断将片断连接到线性重组pSV-β-gal I型载体，这样克隆β-珠蛋白MAR。为了确定β-珠蛋白MAR的定向，位于pSV-β-gal I型载体和β-珠蛋白MAR中的Hind III限制性酶被处理，确定了β-珠蛋白MAR被逆向克隆到pSV-β-gal I型载体中。
(2)pMS-β-gal载体的表达效价：
包含βMS-β-gal载体的2μg试验载体采用DOSPER(Roche产品)被共转染到含pSV2neo载体的CHO DG44中，pSV-β-gal载体作为对照载体以相同方式共转染。在选择性培养基中培养转染的CHO DG44细胞，该培养基是包括补加10％热-非活性FBS和850μg/ml G418的硫酸盐的核苷的MEM-α培养基(Calbiochem Co.产品)。大约2周后产生staly-转染的G418-抗性转染子，表达了对照载体的β-Gal的20个稳定克隆与G418-抗性的转染子中pMS-β-gal载体分离。为了计算β-Gal和新基因的复制数以及从pSV-β-gal和pMS-β-gal转录的β-Gal RNA的量，通过DNA和RNA印迹来分析40阳性克隆。
图6显示在pSV-β-gal或pMS-β-gal载体表达β-Gal的阳性克隆(下文指“阳性克隆”)中，用于确认β-Gal基因复制数(a：对照组，b：本发明)，RNA数(c：对照组，d：本发明)，以及作为选择性标记的新基因的复制数(e：对照组，f：本发明)的DNA和RNA印迹，并且图7显示在pSV-β-gal或pMS-β-gal载体的阳性克隆中的β-Gal表达产量和β-Gal基因的复制数之间关系的曲线。如图6a和6b所示，由于β-Gal基因在每个阳性克隆中的复制数是不同的，每个阳性克隆可被分成两组，其一为具有β-Gal基因的高复制数，另一为具有β-Gal基因的相对的低复制数，各组相互分析。具有β-Gal基因高复制数的一组，尽管对照组具有表示为“a”的β-Gal基因的高复制数，在这些克隆中的β-Gal基因的RNA的量相对于DNA的复制数也是低的，如“c”所示。然而，本发明的pMS-β-gal中的阳性克隆的RNA量是高的，表示为“d”。另外，具有β-Gal基因低复制数的一组中，β-Gal的复制数和pMS-β-gal载体阳性克隆的RNA的量远远高于对照组载体的阳性克隆中的量，如图6中所示。图7表示基因的复制数和表达量之间的关系。在图7中，在pMS-β-gal载体克隆中的β-Gal基因平均复制数和表达水平(●)与对照载体克隆的那些(○)相比，相当于大约10倍。另外，β-Gal基因的高复制组中，β-Gal基因在对照载体克隆中的表达独立于基因的复制数，并且pMS-β-gal如图7所示。
(3)在各种细胞体系中pMS-β-gal载体的表达模式：
在动物细胞的外源基因的表达中，像CHO一样使用各种各样的细胞，外源基因的表达量在各种细胞中是不同的。本发明中，阐明了当在CHO细胞宿主中使用pMS-β-gal载体时，在转染CHO细胞中的外源基因的表达效价和表达频率增加了。所以，已经实验了本发明的载体是否适用于来源和形态与CHO细胞不同的动物细胞。
pSV-β-gal和pMS-β-gal载体分别与载体pSV2neo共转染到幼鼠肾细胞(BHK)，鼠纤维细胞(NIH3T3)，人胚肾细胞(HEK293)之后，在包含G418的培养基中培养它们大约14天，在稳定的转染子中，对于每个载体，阳性细胞表达β-Gal的频率和表达效价以与(2)相同的方式计算。
图8显示各种细胞系中pMS-β-gal的表达效价。当BHK用于宿主细胞系时，基因的表达和在CHO细胞系中的类似。当NIH 3T3用于宿主细胞系时，对表达量的增加的影响是低的。当HEK293用于宿主细胞时，表达作用和量与对照组相似。阳性克隆的频率与上述情况类似。因此，本发明所述的表达载体在各种细胞中的效果是不同的，特别是，它们适用于通常在动物细胞表达中使用的CHO，BHK和NIN 3T3细胞。
(4)pMS-β-gal载体的表达体系的确定：
在常规的表达载体体系中，应经冗长的步骤选择高表达克隆，以尽可能在主要的转染子的集合体中分离，并且长时间培养这些克隆以增加外源基因的表达水平。为了克服这些问题和最大化外源基因的表达水平，用CHODG44细胞系将DHFR/MTX放大***建立在表达***上。
pMS-β-gal载体被转染到DHFR-CHO DG44(下文称作“CHO DG44”)细胞系，pMS-β-gal载体的转染子适合于MTX，接着计算蛋白的表达量。pMS-β-gal载体和对照载体(pSV-β-gal载体)通过具有DHFR基因的pDCHlP载体分别共转染至缺失DHFR基因的CHO DG44。在选择培养基中培养DHFR-转染的细胞株，该培养基为缺失10％热非活性透析FBS补充的核苷的MEM-α培养基。稳定的DHFR+转染子在大约2周后产生，在稳定的DHFR+转染子中的表达β-Gal的阳性克隆通过β-Gal染色分离。对于染色为DHFR+转染子中的表达β-Gal的筛选阳性克隆的β-Gal，通过在含2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS中于4℃培育10分钟固色细胞，以PBS清洗两次，并用X-Gal处理。当β-Gal被表达时，由于归因于通过β-Gal蛋白的X-Gal分解产生蓝色产物，因此细胞出现蓝色。选择性克隆通过成倍地逐步增加MTX浓度如10nM，20nM，50nM，100nM，400nM和1μM来处理。克隆大约需要2到3周的时间以适合每种培养的MTX浓度。以传统的ELISA分析通过MTX适合的基因放大期间β-Gal的表达量。
图9表示重组蛋白在分别以pMS-β-gal和对照物转染的细胞中的重组蛋白的表达量，并且适应1μM MTX浓度。据报道，当重组蛋白的表达通过CHO细胞系中的DHFR.MTX放大***放大时，表达水平上升到大约10μg/106细胞/天，相当于总蛋白量的2.5％(Kaufman，1997，Methods MolBiol62，287-300)。本发明中，据观察，通过逐渐增加MTX的量，大约有100到1000复制数被放大。计算β-Gal在对照组pMS-β-gal载体克隆中的表达量。β-Gal在对照克隆的表达量与每个克隆不同。考虑到在动物细胞的重组蛋白的生产中20μg/106细胞的工业价值，对照载体的25％的克隆属于其中，本发明pMS-β-gal载体克隆88％产生了大于20μg/106细胞的重组蛋白。与具有最大表达量的细胞株相比，本发明的pMS-β-gal具有大量的表达的蛋白，大量的蛋白通过将外源基因***到pMS(KCCM10203)而产生。因此，当本发明的表达载体被用于表达外源基因时，将带来高表达产量和高效率。
实施例2：制备pSPUK，pMSPUK，pCPUK，和Pmcpuk：
(1)制备pCMV载体
为了易于克隆scu-PA基因的CMV启动子和SV40启动子，制备pCMV载体。实施得到CMV启动子、MCS位点和pcCDNA3.1(+)(由Invitrogen Co.生产的)转录终止位点的PCR。PCR的正向引物为CMVL1(SEQ ID No.11)，反向引物为PAR1(SEQ ID No.12)。CMVL1引物具有Sac II，Cla I，Nru I位点，PAR1引物具有Bsm I位点。为了制备pCMV，1.4kb的PCR产物被Sac II和Bsm I消化后，连接到线性重组pMS-β-gal I型中。
(2)制备pSPUK，pMSPUK，pCPUK，和pMCPUK：
为了在动物细胞中制备适于scu-PA表达的重组表达载体，通过PCR得到scu-PA基因，为了由来源于人TCL-598细胞株的具有scu-PA基因作为模板的CHO细胞株分离基因组DNA。正向引物PKL1为序列SEQ ID No.13，反向引物的PKR1序列为SEQ ID No.14。PKL1引物具有Hind III限制性位点，PKR1引物具有Sma I限制性位点。
从引物获得的大约1.3kb scu-PA的PCR产物(DNA片断，具有人scu-PA的碱基NO.-6-NO.1293)被Sma I和Hind III剪切，并且***它到质粒中，和为了制备pCPUK表达载体通过Hind III和EcoR V剪切的pCMV。
另外，为了从中分离含SV40启动子的片断，以Sma I和Hind III处理重组pSV-β-gal I型载体。为了制备pSPUK表达载体，由Nru I和Hind III将片断***并与对照的线性pCPUK连接。
为了***MAR成分到其中，以Sac II和Nru I处理pCPUK。为了制备pMCPUK载体，线性的pCPUK***β-珠蛋白MAR成分并与其连接，这种成分通过以Sma I和SacII处理pMS-β-gal载体制备。
为了将β-珠蛋白MAR成分***其中，用Stu I和Sac II处理载体pSPUK。将用Stu I和Sac II处理pMS-β-gal载体产生的β-珠蛋白MAR成分，***到pSPUK载体，pMSPUK载体制备完成。
简而言之，pSPUK载体构建子为通过***scu-PA基因到重组载体和pSV-β-gal I型产生的形式，其中pSV-β-gal I型的β-Gal基因被除去，并且***β-珠蛋白MAR互补序列到pSPUK载体中以便制备pMSPUK载体。pCPUK载体构建子是***Scu-PA到pCMV载体而产生的形式，并且***β-珠蛋白MAR互补序列到pCPUK中以便制备pMCPUK载体。
(3)pSPUK，pMSPUK，pCPUK，和pMCPUK载体效率的检测：
①重组scu-PA基因转染到细胞中，选择基因的转化体和放大：
为了获得足够稳定的细胞系以表达scu-PA，将pSPUK，pMSPUK，pCPUK，和pMCPUK四种重组表达质粒，分别地导入到DHFR-CHO细胞中(CHO DG44)。2×105的CHO细胞置于6-孔平板中，在含5％CO2，37℃的培养箱中培育24小时。1μg的pSPUK，pMSPUK，pCPUK，和pMCPUK质粒和10ng的DHFR微量基因分别按100∶1的比率混合，混合物以细胞转染试剂，(GiboBRL)，或DOSPER(Loche)法转染到CHO细胞。6小时后，更换新鲜的常规培养基，细胞被进一步培养48小时。细胞按比率10∶1在培养基进行次培养到选择培养基大约2周或更长，为了形成细胞群落，大约每4或5天要更换培养基。单独或一起培养细胞群落。
②分泌在细胞的培养液中的scu-PA的活性的计算
采用S-2444作为基础计算细胞培养基的酰胺化活性，并将结果与相应的尿激酶活性相比较。1×106细胞被置于含2ml培养液的6-孔平板中，在含5％CO2，37℃的培养箱中培育17小时。为了计算上清液的活性，50μl连续稀释的上清液置于96-孔平板中，并和30μl缓冲液混合(50mM Tris/HCI(pH8.8)，80mM NaCI，0.02％Twin80)。为了活化重组scu-PA，将10μl纤溶酶(0.5U/ml)进一步混入到混合物中，混合物在37℃反应20分钟。为了抑制纤溶酶的活性将10μl抑酶肽(100KIU/ml)加入到混合物中，100μl显色底物溶液(缓冲溶液和6mM的S-2444的混合物)进一步加入到混合物中，在37℃反应1小时。scu-PA在培养基中的活性和浓度通过最后的溶液在微量阅读器的405nm处的吸收值(光学密度)来计算，结果与相应的尿激酶的相比较。
图10显示依照转染pMSPUK，pMCPUK，pSPUK和pCPUK至CHO细胞中的scu-PA的表达效价。pMS和pMC载体的表达水平比作为对照的pSV和pMC的增加了4倍多。
实施例3：pSG-β-gal载体的制备
(1)胃泌素基因的转录终止位点和pSG-β-gal载体的制备
合成胃泌素基因的正义链的转录终止位点SEQ ID No.15和反义链SEQID No.16之后，两者被退火。用BamH I和Pst I处理退火的片断，并由BamHI和Pst I在SV40 p(A)3’末端消化，整合和连接到线性pSV-β-gal载体(由Promega Co.生产的载体)，这样pSG-β-gal载体完成制备。
(2)计算pSG载体的效率
为了计算β-Gal的表达效价，用DOSPER(Roche)将pSG-β-gal载体和pSV2neo载体共转染到Cos-7细胞中。
图12显示β-gal在pSG-β-gal载体中的表达效价，并且包括由SV40聚-A和胃泌素基因的转录终止位点组成的构建子的pSG-β-gal载体产生的β-Gal是包括SV40聚-A的常规载体的4倍多。因此，通过克隆在pSG载体中外源基因的转染可以产生大量的重组蛋白。
实施例4
(1)pMSG载体的制备
如图13所示，含有β-珠蛋白MAR互补序列和SPA-GTF的载体由PCR制备。为了制备pMSG载体，pMS-β-gal和pSG-β-gal用作模板，PCR实施三次，PCR的产物用特殊的限制性酶来处理，并连接在一起。
①β-珠蛋白MAR成分的PCR
正向引物ML1(序列17)和反向引物MR1(序列18)用于PCR。PCR产物以Sac II和Cla I处理后，与通过Sac II和Cla I消化的线性pMS-β-gal载体整合，pMS-β-gal/sc载体制备完成。
②包含多克隆位点和转录终止位点的PCR
正向引物TL1(序列19)和反向引物TR1(序列20)用于pSG载体的胃泌素基因转录终止位点的PCR。PCR产物以pGEM-T(Promega Co.生产)亚克隆，它是能够直接克隆PCR产物的一种TA克隆载体，这样pGEM-T/MCSp(A)制备完成。
③含SV40启动子和多克隆位点的PCR
正向引物PL1(序列21)和反向引物PR1(序列22)用于SV40启动子和图1所示的1型载体的多克隆位点的PCR。PCR产物用Apa I和BgI II处理，然后将其整合到被Apa I和BgI II消化的线性pGEM-T/MCSp(A)载体中，这样pGEM-T/SVMCSp(A)载体制备完成。
④pMS和pMSG载体的制备
为了纯化由SV40启动子，多克隆位点和SV40终止位点组成的DNA片断，用Apa I和BamH I处理实施例4中的pGEM-T/SVMCSp(A)，并将纯化的片断整合到实施例4的①中的由Apa I和BamH I消化的线性pMS-β-gal/sc载体，这样pMS载体制备完成。为了分离具有GTF碱基对的950bp的DNA片断，用BamH I和Sca I处理Psg载体，通过BamH I和ScaI消化将它与线性pMS载体连接，从而pMSG载体制备完成。
(2)pMSG载体的表达效价的计算
为了检验pMSG载体在CHO宿主细胞系中的表达效率和pMSG载体的工业应用，用正向引物TRI(SEQ ID NO.23)和反向引物TRR1(SEQ ID NO.24)完成TGF-βSRII(TGF-β可溶性受体II，糖基化蛋白)的PCR。PCR产物，放大的TGF-βSRII在Nhe I和Xho I位点***到pMSG和pSV载体，生成的每个载体共转染到具有含DHFR基因的pDCHlP的CHO DG444细胞中。它们在选择性培养基中培养，这里仅有具有DHFR基因的细胞株可以生长。大约在2周后产生稳定的DHFR+转染子，分离20DHFR+克隆，用蛋白质印迹法分析这些克隆以便计算TGF-βSRII的量和寻找它的特性。
图14显示表明TGF-βSRII表达的蛋白质印迹图，其中“a”是TGF-βSRII在pSV载体的克隆表达，“b”是TGF-βSRII在pMSG载体的克隆表达。对照载体克隆的情形下，25个克隆中检测到一个克隆内的TGF-βSRII表达。同时在27个克隆中检测到23个克隆内的TGF-βSRII表达，更一步检测到高水平的更多的表达TGF-β的克隆。另外，当TGF-βSRII由pMSG表达载体表达时，它具有糖基化结构，这样如典型的动物细胞中糖蛋白一样它的分子量增加。pMSG载体的主要克隆的平均表达水平为100ng/106细胞/天。
通过MTX量逐步成倍地增加(如10nM，40nM，200nM，和1M)的处理，本发明的pMSG/TGF--βSRII载体的主要的稳定克隆适合于DHFR/MTX放大体系，以便增加TGF-βSRII的表达量。
图15显示TGF-βSRII的表达量，它通过将TGF-βSRII克隆到pMSG载体、将它们转染到CHO细胞中、以及适应1μM MTX浓度而生产。在对照载体的克隆中，许多克隆不能适应MTX处理的基因放大过程期间的每个MTX浓度，而与对照载体克隆相比，pMSG/TGF-βSRII载体的克隆良好地适应。假设pMSG表达载体的MAR成分增加了DHFR基因以及外源基因的表达量。如图15所示，当加入1μM浓度的MTX时，获得许多pMSG载体克隆，它以大约10μg/106细胞/天产生TGF-β。
据报道TGF-β，细胞生长的有效调节物和分化，是损伤反应中心。在大量的上皮细胞中，重复或延长的损伤导致了进行性纤维样变性和基本上不必要的过度瘢痕的发展。另外，TGF-β导致疾病，例如如肾小球体化，肾硬化，肝硬化，表皮细胞角质化，和软骨炎症。TGF-βSRII如同TGF-β拮抗物一样起作用。因此，通过TGF-βSRII作为药物治疗阻止TGF-β。与从原核生物如大肠杆菌E.coli或Pichia pastoris表达的蛋白相比，从本发明的CHO细胞系表达的TGF-βSRII具有优良的治疗效果，本发明的具有提高的外源基因表达效价的表达载体可以用于动物细胞。
            微生物或其它生物材料的保藏证明
                     (PCT条约13bis)
A.以下确认涉及关于在 16页， 3行提及的保藏微生物或其它生物材料。
B.保藏确认    更多保藏在附加页中确认□
保藏机构名称：韩国微生物保藏中心
保藏机构地址(包括邮政编码和国家)韩国汉城市120-091 Seodaemun-gu，Hongje-l-dong，YurimB/D，361-221
保藏日期：2000.7.28 保藏号：KCCM 10202
C.附加证明(如不适用则保留空白)  该信息在附加页中继续□
D.对做出证明的指定国家(如果该证明不是对所有指定国家)
E.须另行递交证明(如不适用则保留空白)
如下证明须递交给国际局(指明证明的一般性特征，如保藏号)
仅供受理局使用□该页随国际申请收到
授权人：
仅供国际局使用□国际局于_收到该页
授权人
  布达佩斯条约关于为递交专利而保藏微生物的国际证明
                         国际表
I.微生物证明：
保藏者出示的相关证明：Escherichia coli DH5 α/pMSG 国际保藏局出示的保藏号：KCCM-10202
II.科学描述和/或建议性分类名称
如上第一栏中所述微生物附带以下文件：□科学性描述□建议性分类名称
VII.接受并受理
国际保藏局受理其于2000年7月24日收到的第一栏所示微生物(原始保藏日)
IV.国际保藏局
名称：韩国微生物保藏中心韩国汉城市120-091 Seodaemum-guHongje-l-dong，Yurim B/D，361-221 国际保藏局代表签字：
适用于条约6.4(d)，该日期为获得国际保藏局资格的日期：其中当保藏是在布达佩斯条约之外且在得到国际保藏局身份之后进行时，该保藏被转成布达佩斯条约之下，该日期是微生物被国际保藏局收到的日期。
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I.微生物证明：
保藏者出示的相关证明：Escherichia coli DH5 α/pMS 国际保藏局出示的保藏号：KCCM-10203
II.科学描述和/或建议性分类名称
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适用于条约6.4(d)，该日期为获得国际保藏局资格的日期：其中当保藏是在布达佩斯条约之外且在得到国际保藏局身份之后进行时，该保藏被转成布达佩斯条约之下，该日期是微生物被国际保藏局收到的日期。
                 序列表<110>    Mogam Biotechnology Research Institute
     Pan-Gen Biotech Laboratories Inc.<120>    用于动物细胞的表达载体<130>    opp010629kr<150>    KR10-2000-43996<151>    2000-7-29<160>    24<170>    Kopatentln 1.55<210>    1<211>    6287<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    pMS载体序列<220><221>    启动子<222>    (1)..(419)<223>    SV40病毒<220><221>    基因<222>    (3305)..(6269)<223>    人β珠蛋白MAR成份<400>    1gcgcagcacc atggcctgaa ataacctctg aaagaggaac ttggttaggt accttctgag    60gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc   120cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt   180ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca   240tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc   300cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg   360agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagcttg   420ctagcggccg cagatctgtt aactcgagaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa   480ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc actctagttg   540tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcctctaga gtcgacctgc   600aggcatgcaa gctggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa atccctggcg   660ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag   720aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga   780tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca   820gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg   900acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct   960ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg  1020gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt  1080caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac  1140attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa  1200aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat  1260tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc  1320agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga  1380gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg  1440cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc  1500agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag  1560taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc  1620tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg  1680taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg  1740acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac  1800ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac  1860cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg  1920agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg  1980tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg  2040agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac  2100tttagattga tttaaaactt catccctaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg  2160ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg  2220tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc  2280aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc  2340tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt  2400agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc  2460taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact  2520caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac  2580agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag  2640aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg  2700gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg  2760tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga  2820gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt  2880ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct  2940ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg  3000aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt  3060aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta  3120atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta  3180tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt  3240acgccaagct cgaaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctc caccgcggcc  3300cgggcctcct gagtagctgg gactacaggt gtacatcaca tgcctggcta attttttttt  3360tttaagtaga gacgaggtct tgctatgttg tccaggataa tatcaaactc ttgagctcaa  3420gcagtcctcc cacttctacc tctcaagtgc tggaattaca gacatgagcc accactcctg  3480gcttgcagac tatttaaatg actaattcct gacactgctt gagggatact agacagtaga  3540caacacatct ttaatatacc aaatgggtga ctgtagggtt gagagggaga ttagaattca  3600atgttttatg accaaaaagg cttaaatcag gcacaagctt aggtcttttc aactgtgagg  3660accggactga aagtgtgcag ttcaaggccc tgtagttgct gtttaactgt tcccaggtgg  3720aagtctcttc aaagaaccac tggtgcaaaa agggaactac ctggggataa atatttcctc  3780cagaaagggg gaaagtgcaa gctcccctac caaaagcacc aggcaagtcc ttgtctattt  3840tccctgaagt tctcaaagaa atgagaccct tgtttacctt taagattaga gaaggcttga  3900aaagtttgag ctgtgccttt ggaggccaac aaacttttc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     泌素片断<220><221>    终止子<222>    (256)..(435)<400>    2taacaatcct agaaccaagc ttcagagcct agccacctcc caccccacct ccagccctgt    60cccctgaaaa actgatcaaa aataaactag tttccagtgg atcaatggac tgtgtcagtg   120ttgtagggca gaggaggggg actcatctgg gctcatctgg gggtgaagtt gtggcaggga   180ctaagagctg agtgcctctt aggggcaggg accgtccccc agagccccac attgaacgag   240aatccacagg tatgggcagg ataatatatg gtagggttca tagccagagt aacctttttt   300tttaattttt attttatttt atttttgaga tggagtttcg ctcttgtctc ccaggctgga   360gtgcaataat gagacctcag ctcactgcaa cctctgcctc ctaggttcaa gcgattttcc   420tgcctcagcc tccca                                                    435<210>    3<211>    214<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    SV40病毒的聚-A信号和胃泌素的终止位点<220><221>    聚A-信号<222>    (1)..(136)<220><221>    终止子<222>    (136)..(214)<400>    3aaattgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca   60aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct  120tatcatgtct ggatccagga taatatatgg tagggttcat agccagagta accttttttt  180ttaattttta ttttatttta tttttgagct gcag                              214<210>    4<211>    221<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    SV40病毒的聚-A信号和胃泌素聚-A信号的颠倒<220><221>    polyA_signal<222>    (1)..(137)<220><221>    终止子<222>    (138)..(221)<400>4aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca    60aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct   120tatcatgtct ggatcaactg cagctcaaaa ataaaataaa ataaaaatta aaaaaaaagg   180ttactcaggc tatgaaccct accatatatt atcctgcagt t                       221<210>    5<211>    217<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    SV40病毒聚-A信号和胃泌素聚-A信号<220><221>    聚A-信号<222>    (1)..(135)<220><221>    终止子<222>    (136)..(217)<400>    5aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca    60aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct   120tatcatgtct ggatccggga tcccctgaaa aactgatcaa aaataaacta gtttccagtg   180gatcaatgga ctgtgtcagt gttgtagggc tgcagtt                            217<210>    6<211>    217<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    SV40病毒聚-A信号和最少的胃泌素聚-A信号<220><221>    polyA_signal<222>    (1)..(135)<220><221>    终止子<222>    (136)..(217)<400>    6aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca    60aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct   120tatcatgtct ggatccggga tcccctgaaa aactgatcaa aaataaacta gtttttccac   180tgcattctag ttgtgttagt gttgtagggc tgcagtt                              217<210>    7<211>    3309<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    pSG载体序列<220><221>    启动子<222>    (1)..(419)<400>    7gcgcagcacc atggcctgaa ataacctctg aaagaggaac ttggttaggt accttctgag    60gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc   120cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt   180ccccaagctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca   240tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattatc   300cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg   360agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagcttg   420ctaacggccg cagatctgtt aactcgagaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa   480ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg   640tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atccaggata atatatggta   600gggttcatag ccagagtaac cttttttttt aatttttatt ttattttatt tttgagctgc   660aggcatgcaa gctggcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg  720ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag  780aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga  840tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca  900gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg  960aagcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct 1020ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg 1080gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt 1140caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 1200attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 1260aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat 1320tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc 1380agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga 1440gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg 1500cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc 1560agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag 1620taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc 1680tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 1740taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 1800acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac 1860ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac 1920cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg 1980agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg 2040tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaa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211>    39<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    scu-PA基因的引物PKL1<220><221>    引物<222>    (1)..(39)<223>    引物<400>    13cccaagctta tgagagccct gctggcgcgc ctgcttctc                  39<210>    14<211>    27<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    asc-PA基因的引物PKR1<220><221>    引物<222>    (1)..(27)<223>    引物<400>    14tcccccgggt cagagggcca ggccatt                                     27<210>    15<211>    87<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    在pSG载体中所用的胃泌素终止位点的正义序列<220><221>    终止子<222>    (1)..(87)<223>     sanse sequence of gastrin terination site<400>    15agcggatcca ggataatata tggtagggtt catagccaga gtaacctttt tttttaatti 60ttattttatt ttatttttga gctgcag                                     87<210>    16<211>    87<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    在pSG载体中胃泌素终止位点的反义序列vector<220>    终止子<221>    terminator<222>    (1)..(87)<223>    胃泌素的终止位点的反义序列<400>    16ctgcagctca aaaataaaat aaaataaaaa ttaaaaaaaa aggttactct ggctatgaac 60cctaccatat attatcctgg atccgct                                     87<210>    17<211>    35<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    人β珠蛋白MAR成份在pMS载体中放大的引物ML1vector<220><221>    引物<222>    (1)..(35)<223>    引物<400>    17tccccgcggc ccgggcctcc tgagtagctg ggact                           35<210>    18<211>    35<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    在pMS载体中放大人β珠蛋白MAR成份的引物MR1vactor<220><221>    引物<222>    (1)..(35)<223>    grimer<400>    18ttggggccca tcgatttctt cctctttagg ttctc                          35<210>    19<211>    39<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    胃泌素在pSG载体中的终止位点的引物TL1<220><221>    引物<222>    (1)..(39)<223>    引物<400>    19gaagatctgt taactcgaga acttgtttat tgcagctta                      39<210>    20<211>    20<212>    DNA<213>    Artificiai  Sequence<220><223>    胃泌素终止位点在pSG载体中的引物TR1<220><221>    引物<222>    (1)..(20)<223>    引物<400>    20gtgccagctt gcatgcctgc                                        20<210>    21<211>    34<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    熔融SV40病毒启动子和多克隆位点的引物PL1<220><221>    primer<222>    (1)..(34)<223>    primer<400>    21ccatcgatgg gcccgcgcag caccatggcc tgaa                        34<210>    22<211>    40<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    熔融SV40病毒启动子和多克隆位点的引物PR1<220><221>    引物<222>    (1)..(40)<223>    引物<400>    22gaagatctgc ggccgctagc aagctttttg caaaagccta                        40<210>    23<211>    29<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    TGF-β可溶受体II的引物TR1<220><221>    引物<222>    (1)..(29)<223>    引物<400>23accgctagcc cacccatggg tcgggggct                                    29<210>    24<211>    29<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    TGF的可溶受体II的引物TRR1<220><221>    引物<222>    (1)..(29)<223>    引物<400>    24agcctcgagc tagtcaggat  tgctggtgt                             29

Claims (8)

1.一种用于动物细胞的表达载体，包括β-珠蛋白MAR序列或其启动子的5’终止末端上的互补序列。
2.如权利要求1所述的表达载体，其中用于动物细胞的表达载体是SEQID No.l的pMS KCCM10203。
3.如权利要求1所述的表达载体，其中用于动物细胞的表达载体是pMC。
4.一种用于动物细胞的表达载体，包括由SV40病毒的聚-A(聚腺苷酸化)信号和胃泌素基因的转录终止位点组成的构建子，其中构建子具有序列SEQ ID No.3。
5.如权利要求4所述的表达载体，其中表达载体是SEQ ID NO.7中的pSG 。
6.一种具有序列SEQ ID NO.8的pMSG KCCM10202载体，包括人β-珠蛋白5’MAR(核基质着丝溢痕)互补序列，以及由SV40病毒聚-A信号和胃泌素基因转录终止位点组成的构建子。
7.一种在动物细胞中由表达载体制备生物活性物质的方法，该载体选自按照权利要求1，4和6的表达载体组成的组。
8.按照权利要求7所述的方法，其中生物活性物质是由按照权利要求6的表达载体制备的TGF-βSRII。
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