CN111440244B

CN111440244B - 靶向vegfr2的转移性癌疫苗

Info

Publication number: CN111440244B
Application number: CN202010273819.0A
Authority: CN
Inventors: 齐海龙; 王晓芳; 严小娥; 李日勇; 罗天明; 谢皇帆; 刘德芳; 郭潇; 孙忠杰
Original assignee: Nuowei Technology Beijing Co ltd
Current assignee: Nuowei Technology Taizhou Co ltd; Newish Technology Beijing Co Ltd
Priority date: 2020-04-09
Filing date: 2020-04-09
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2040-04-09
Also published as: CN111440244A; WO2021203608A1

Abstract

本发明涉及癌症的免疫治疗和预防领域，特别涉及靶向VEGFR2（KDR)的转移性癌疫苗。本发明通过将促进肿瘤新生血管生成的VEGFR2蛋白与DC细胞配体XCL1融合表达，提高了VEGFR2蛋白被DC细胞吞噬、加工、呈递的效率，改善了其抑制肿瘤生长的效果。经由实验验证，本发明的核酸疫苗表达的蛋白可以有效地结合DC细胞、诱导VEGFR2特异性T细胞反应并在多种模型中显著抑制高表达VEGFR2的肿瘤的生长。

Description

靶向VEGFR2的转移性癌疫苗

技术领域

本发明涉及癌症的免疫治疗和预防领域，特别涉及靶向VEGFR2的转移性癌疫苗。

背景技术

肿瘤转移是癌症致死的主要原因，90%以上的癌症致死率是由于转移造成，而肿瘤血管的形成对于肿瘤的生长和转移则是必不可少的(Valastyan and Weinberg)。肿瘤血管为肿瘤的生长和转移提供充分的氧气和营养。而新生血管的形成则是肿瘤血管形成的必要步骤。新生血管形成理论认为肿瘤会从已存在的血管诱导新生血管的形成。基于此理论，研究者们开发出了一系列的靶向肿瘤新生血管的药物，目前FDA批准的抗血管生成药物主要分三类，单克隆抗体，受体酪氨酸激酶抑制剂以及融合的多肽。例如贝伐单抗，索拉菲尼以及VEGFR1/2蛋白胞外区的融合蛋白等用于转移性癌症的治疗，均可有效地改善病人的无进展生存期(Cascone and Heymach)。然而目前抗血管生成药物仍然存在很多问题，以贝伐单抗为例，需要频繁的肠外给药，副作用严重，明显的耐药性以及转移后肿瘤的反弹进展等，这些问题亟需解决。

血管内皮生长因子（VEGF）是新生血管形成的最重要调节因子，其发挥功能主要通过结合三个受体酪氨酸激酶VEGFR1/2/3。研究表明VEGFR1高亲和VEGF但胞内酶活性却很低因而对新生血管的生成起负反馈的抑制作用，VEGFR3则主要表达在成人的***，而VEGFR2则是主要介导VEGF诱导的新生血管生成以及内皮细胞渗透性增加的促进因子(Donget al.)。VEGFR2敲除的小鼠发育到8.5-9.5天即因为血管生成受损而夭折(Shalaby etal.)。在肿瘤组织中，VEGFR2在肿瘤组织中的肿瘤相关内皮细胞中高表达，其表达量远高于正常血管细胞，而且，除了肿瘤相关内皮细胞，VEGFR2也在某些类型肿瘤细胞中高表达，例如B细胞淋巴瘤，乳腺癌，肺癌，膀胱癌和黑色素瘤等等(Decaussin et al., 1999; El-Obeid et al., 2004; Gakiopoulou-Givalou et al., 2003; Kranz et al., 1999)，因而VEGFR2是肿瘤治疗的理想靶点。所述贝伐单抗以及索拉菲尼皆是以VEGFR2为靶点开发出的抗肿瘤药物。

血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）虽然在某些肿瘤以及肿瘤相关内皮细胞高表达，但是由于VEGFR2是一种胚胎性肿瘤相关抗原，在机体细胞免疫发育过程中，能与之识别并以高亲和力结合的T细胞在胸腺内通过阴性选择已被清除(Houghton et al., 2007)。只有对VEGFR2亲和力较低的T细胞在胸腺的选择后存活，然而这些T细胞无法被机体自身的VEGFR2所激活。因而虽然肿瘤细胞高表达VEGFR2但是机体自身并不能产生有效识别VEGFR2高表达的肿瘤细胞的效应T细胞进而抑制血管生成以及肿瘤生长。这种现象叫做免疫耐受。而既往研究表明通过将VEGFR2这类肿瘤相关抗原中的某些表位进行与T细胞的亲和力增强的突变优化，可以促进原本不识别VEGFR2这类肿瘤相关抗原的T细胞的产生，因而打破VEGFR2的免疫耐受性(Guevara-Patino et al., 2006)。

既往的研究表明，使用预测并验证的HLA-A2和HLA-A24限制性VEGFR2免疫源性多肽(分别为VEGFR2169-177：RFVPDGNRI和VEGFR2773-781：VLAMFFWLL)免疫晚期转移性结直肠癌患者以及神经纤维瘤患者，进行I/II期临床试验，结果显示,经多肽疫苗刺激后，VEGFR2特异性细胞毒性T细胞(CTLs)比例增高能抑制肿瘤新生血管生成，增加瘤内CD8+T细胞数量，并消除VEGFR2阳性的肿瘤细胞，降低肿瘤负荷，提高患者整体生存率(Hazama etal., 2014)和(Tamura et al., 2019)。但是他们的研究内容只适用于携带有HLA-A2和A24这两种亚型的人群，由于T细胞免疫应答存在HLA限制性并且多肽免疫一般不能有效引起抗体介导的体液免疫反应，所以HLA-A2和HLA-A24限制性VEGFR免疫源性多肽可能对其他HLA亚型人群无任何作用。且所用免疫多肽未经表位优化所能引起的免疫反应程度有限，这可能限制了这类疫苗的有效程度。综合上述，有必要设计一种靶向VEGFR2的能够有效打破免疫耐受，通过细胞特异性免疫反应拮抗新生血管生成并抑制转移性癌灶形成的预防以及治疗性疫苗。

抗原提呈细胞指的是可以加工抗原并以抗原肽-MHC分子复合物的形式将抗原肽提呈给T细胞的一类细胞，在机体的免疫识别、免疫应答以及免疫调节中起重要作用。树突状细胞（DC）细胞是机体抗原提呈细胞的一种，并且是机体内唯一一种可以将抗原肽呈递给初始T细胞并诱导T细胞活化增殖的、功能最强的抗原呈递细胞，是机体适应性免疫应答的始动者。DC细胞根据形态以及功能可以分为经典DC以及浆细胞样DC两大类。浆细胞样DC主要介导病毒感染后的适应性免疫应答，经典DC加工呈递抗原的能力最强，则介导机体内死亡细胞的清除以及肿瘤细胞的识别等过程(Carreno et al., 2017; Minetto et al.,2019)。因而将肿瘤抗原更有效的呈递给经典DC是疫苗成功的关键，研究发现经典DC表达一类趋化因子XCL1的受体，因而XCL1分子可以高效的结合经典DC细胞(Dorner et al.,2009)。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了靶向VEGFR2的转移性癌疫苗。本发明通过将促进肿瘤新生血管生成的VEGFR2蛋白与DC细胞配体XCL1融合表达，提高了VEGFR2蛋白被DC细胞吞噬、加工、呈递的效率，改善了其抑制肿瘤生长的效果。经由实验验证，本发明的核酸疫苗表达的蛋白可以有效地结合DC细胞、诱导VEGFR2特异性T细胞反应并在多种模型中显著抑制高表达VEGFR2的黑色素瘤的生长。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供的融合蛋白包括促进肿瘤新生血管生成的VEFGR2的能够诱发特异性CD8+T反应的胞外区或其MHCI类分子结合表位优化形式胞外区；接头；以及特异性结合具有抗原交叉呈递能力的DC细胞的人或鼠XCL1蛋白；

其中：

（Ⅰ）、所述促进肿瘤新生血管生成的VEFGR2的能够诱发特异性CD8+T反应的胞外区或其MHCI类分子结合表位优化形式胞外区具有如SEQ ID No.1或2中第20~764位氨基酸所示的氨基酸序列；所述特异性结合具有抗原交叉呈递能力的DC细胞的人或鼠XCL1，如SEQID NO:3或4的1~114位氨基酸所示序列；

或

（Ⅱ）、如（Ⅰ）所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或两个氨基酸残基获得的氨基酸序列，且与（Ⅰ）所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；

或

（III）、与（Ⅰ）或（Ⅱ）所述序列具有至少90%序列一致性，且与（Ⅰ）所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述融合蛋白包括SEQ 如ID No.7和8中的1~889位氨基酸所示序列。

在上述研究的基础上，本发明还提供了编码所述的融合蛋白的核苷酸，具有

（Ⅰ）、如SEQ ID No.11~16任意所示的核苷酸序列；

或

（Ⅱ）、如SEQ ID No.11~16任意所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或

（Ⅲ）、与（Ⅰ）或（Ⅱ）的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与（Ⅰ）或（Ⅱ）的核苷酸序列不同的核苷酸序列；

或

（Ⅳ）、与（Ⅰ）、（Ⅱ）或（Ⅲ）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或两个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与（Ⅰ）、（Ⅱ）或（Ⅲ）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

或

（V）、与（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）或（Ⅳ）所述核苷酸序列具有至少90%序列一致性的核苷酸序列。

在上述研究的基础上，本发明还提供了重组表达载体，包括载体以及本发明所述的融合蛋白或所述的核苷酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述载体包括哺乳动物细胞表达载体或昆虫杆状细胞表达载体；所述载体包括pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)、pFastbac1-dual-MBP。

在上述研究的基础上，本发明还提供了包括本发明所述的融合蛋白或所述的核苷酸的重组菌株或细胞。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述融合蛋白、所述核苷酸、所述重组表达载体或所述的重组菌株或细胞在制备转移性癌症或VEGFR2高表达的黑色素瘤的疫苗或制备预防和/或治疗转移性癌症或VEGFR2高表达的黑色素瘤的药物中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述转移性癌症包括肝癌，结直肠癌或肺癌。

在上述研究的基础上，本发明还提供了转移性癌症或VEGFR2高表达的黑色素瘤的疫苗，包括本发明所述的融合蛋白、所述的核苷酸、所述的重组表达载体以及药学上可接受的运载体、赋形剂和/或佐剂。

在上述研究的基础上，本发明还提供了预防和/或治疗转移性癌症或VEGFR2高表达的黑色素瘤的药物，包括本发明所述的融合蛋白、所述的核苷酸、所述的重组表达载体以及药学上可接受的辅料。

本发明提供的疫苗是由血管内皮细胞生长因子受体VEGFR2的能够引起特异性CD8+T细胞免疫应答的胞外区以及MHCI类分子结合表位优化形式的胞外区并在其N端融合表达特异结合抗原交叉呈递能力的DC的XCL1分子构成的蛋白，包含所述融合蛋白的核酸以及核酸所在的载体，包含本发明所述融合蛋白，核酸和载体在预防和治疗黑色素瘤，转移性癌中的应用。本发明通过将促进肿瘤新生血管生成的VEGFR2蛋白与DC细胞配体XCL1融合表达，提高了VEGFR2蛋白被DC细胞吞噬、加工、呈递的效率，改善了其抑制肿瘤生长的效果。经由实验验证，本发明的核酸疫苗表达的蛋白可以有效地结合DC细胞、诱导VEGFR2特异性T细胞反应并在多种模型中显著抑制高表达VEGFR2的黑色素瘤的生长。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示编码融合蛋白核苷酸的载体图谱；其中图1A示CMV启动子之后接XCL1序列之后连接VEGFR2野生型胞外区用于核酸疫苗编码序列；图1B示CMV启动子之后接XCL1序列之后连接VEGFR2 MHCI类分子结合优化突变型胞外区核酸疫苗编码序列；图1C示CMV启动子之后接XCL1分泌信号肽序列之后连接VEGFR2胞外区用于核酸疫苗编码序列；图1D示pFASTbac-dual-MBP-XCL1-VEGFR2野生型融合蛋白疫苗纯化载体；图1E示pFASTbac-dual-MBP-XCL1-VEGFR2突变型融合蛋白疫苗纯化载体；图1F示pFASTbac-dual-MBP-VEGFR2野生型蛋白疫苗纯化载体；

图2示融合蛋白的三维结构预测结果图；将编码融合蛋白的核苷酸序列输入http://raptorx.uchicago.edu/网址对融合蛋白的三维空间结构预测，图示XCL1-VEGFR2融合蛋白空间结构图；

图3示检测编码融合蛋白的核酸在HEK293T细胞内的表达情况；将载由编码融合蛋白核酸的质粒载体转染HEK292T细胞48小时后，利用蛋白免疫印迹技术（Westernblot）检测C端带有Flag标签的融合蛋白编码核苷酸的表达情况；

图4示检测从昆虫杆状细胞SF9中纯化的融合蛋白；利用考马斯亮蓝染色检测从昆虫杆状细胞分泌表达的XCL1-VEGFR2的纯化情况；

图5示融合蛋白可以有效地结合MHCII+CD11c+CD8a+抗原交叉呈递DC细胞；将带有Flag标签的SF9细胞纯化的蛋白与CD11C磁珠富集的脾细胞孵育，利用Flag荧光抗体检测融合蛋白与MHCII+CD11c+CD8a+抗原交叉呈递DC细胞的结合情况；其中，图5（A）示融合蛋白结合DC细胞流式分析图；图5（B）示5（A）中融合蛋白结合DC细胞比例统计分析图；

图6示检测融合蛋白对MHCII+CD11c+CD8a+抗原交叉呈递DC细胞的趋化效应；利用Transwell试验，将含有MHCII+CD11c+CD8a+抗原交叉呈递DC细胞的脾细胞放在上层，将从SF9昆虫细胞中纯化的融合蛋白放于下层，观察2小时后上层MHCII+CD11c+CD8a+抗原交叉呈递DC细胞进入下层的数量；结果显示融合蛋白对MHCII+CD11c+CD8a+抗原交叉呈递DC细胞具有趋化作用；其中，图6（A）示融合蛋白趋化DC细胞流式分析图；图6（B）示6（A）融合蛋白趋化DC细胞比例统计分析图；

图7示检测黑色素瘤细胞系B16细胞成瘤后的VEGFR2（KDR）表达情况；将肿瘤细胞接种于皮下，待成瘤后，取肿瘤组织以及周边皮肤组织提取总RNA，利用实时荧光定量PCR扩增技术检测VEGFR2在肿瘤以及周边皮肤的表达情况，结果显示VEGFR2在肿瘤组织中的表达显著高于周边正常皮肤；

图8示编码XCL1-VEGFR2/XCL1-VEGFR2突变型融合蛋白的融合基因免疫小鼠后，小鼠黑色素瘤的生长情况；图8A示融合基因免疫方法以及免疫过程图；图8B示接种黑色素瘤后，测量肿瘤的体积做出的肿瘤生长曲线图；图8C示待对照组肿瘤生长至2000mm³的伦理终点时处死小鼠，解剖出肿瘤的大小比较图；

图9示编码XCL1-VEGFR2融合蛋白的的融合基因免疫小鼠后，小鼠黑色素瘤内部侵润的淋巴细胞颗粒酶B阳性的CD8aT细胞所占比例分析图；

图10示利用融合蛋白免疫小鼠后，取脾脏细胞过继到静脉注射黑色素瘤细胞的小鼠体内，检测肺部模拟黑色素瘤转移结节灶的形成情况；图10A示融合蛋白用静脉注射免疫的方式效果图；图10B示融合蛋白免疫过继治疗后小鼠肺部结节图。

具体实施方式

本发明公开了靶向VEGFR2的转移性癌疫苗，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用了VEGFR2的胞外区的氨基酸序列作为免疫原，以方便可溶性蛋白疫苗的纯化，本发明的疫苗可在人或小鼠体内有效诱导出针对VEGFR2的特异性T细胞免疫反应，打破了原肿瘤相关抗原VEGFR2的免疫耐受性，因而可以有效的发挥直接清除表达VEGFR2的肿瘤细胞，间接通过抑制肿瘤新生血管生成而抑制肿瘤生长以及转移灶的形成。

本发明一方面涉及一种转移性癌症的融合蛋白疫苗，所述疫苗由1）促进肿瘤新生血管生成的血管内皮生长因子受体2（VEFGR2）的能够诱发特异性CD8+T反应的胞外区以及其MHCI类分子结合表位优化形式胞外区，以及2）N端通过接头融合表达特异性结合具有抗原交叉呈递能力的DC细胞的人或鼠XCL1蛋白组成。例如小鼠VEGFR2，SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2中的20-764位氨基酸所示的序列构成，其N端通过接头融合表达特异性结合具有抗原交叉呈递能力的DC细胞的人或鼠XCL1，由SEQ ID No.3或SEQ ID No.4的1-114位氨基酸所示序列构成。

在一些实施例中，所述转移性癌的疫苗包含SEQ ID No.7和SEQ ID No.8中的1-889位氨基酸的任意序列。

本发明另一方面涉及一种编码该融合蛋白疫苗的核酸，核酸疫苗由1）编码促进肿瘤新生血管生成的血管内皮生长因子受体2（VEFGR2）的能够诱发特异性CD8+T反应的胞外区以及其MHCI类分子结合表位优化形式胞外区的核苷酸序列，以及2）编码N端通过接头融合表达特异性结合具有抗原交叉呈递能力的DC细胞的人或鼠XCL1蛋白的核苷酸序列组成。即编码SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中20-764位氨基酸序列和特异性结合具有抗原交叉呈递能力的DC细胞的人或鼠XCL1序列，即SEQ ID No.3或SEQ ID No.4中1-114位氨基酸序列。

在一些实施例中，编码促进肿瘤新生血管生成的VEFGR2和特异性结合具有抗原交叉呈递能力的DC细胞的人或鼠XCL1的序列包含SEQ ID No.11-SEQ ID No.16中的核苷酸序列。

本发明同时还提供了一种负载所述核酸疫苗的重组表达载体，其包含本发明所述融合蛋白疫苗以及对应核算疫苗的核苷酸序列以及载体。所述载体可以为哺乳动物细胞细胞表达载体或昆虫杆状细胞表达载体，具体的，所述载体可以为pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)、pFastbac1-dual-MBP。

本发明最终提供一种转移性癌症的疫苗，包含所述的融合蛋白疫苗，核酸疫苗以及重组表达载体。

本发明的疫苗为肝癌，结直肠癌，肺癌等转移性癌术后以及高表达VEGFR2的黑色素瘤提供一种预防复发或治疗的办法。包括给与其他适应症本发明的疫苗。

本发明的也提供了所述的疫苗，核酸疫苗以及载体在制备肝癌，结直肠癌，肺癌等转移性癌术后以及高表达VEGFR2的黑色素瘤疫苗中的应用。

本发明也提供了所述的疫苗，核酸疫苗以及载体用于治疗黑色素瘤。

本发明的疫苗或药物包括所述融合蛋白、所述核酸、所述重组表达载体以及任选存在的药物可接受的运载体、赋形剂和/或佐剂。

综上，本发明提供了转移性癌的疫苗，该疫苗是由血管内皮细胞生长因子受体VEGFR2的能够引起特异性CD8+T细胞免疫应答的胞外区以及MHCI类分子结合表位优化形式的胞外区并在其N端融合表达特异结合抗原交叉呈递能力的DC的XCL1分子构成的蛋白，包含所述融合蛋白的核酸以及核酸所在的载体，包含本发明所述融合蛋白，核酸和载体在预防和治疗黑色素瘤，转移性癌中的应用。本发明通过将促进肿瘤新生血管生成的VEGFR2蛋白与DC细胞配体XCL1融合表达，提高了VEGFR2蛋白被DC细胞吞噬、加工、呈递的效率，改善了其抑制肿瘤生长的效果。经由实验验证，本发明的核酸疫苗表达的蛋白可以有效地结合DC细胞、诱导VEGFR2特异性T细胞反应并在多种模型中显著抑制高表达VEGFR2的黑色素瘤的生长。

本发明中涉及的原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 融合蛋白疫苗抗原的设计方案以及哺乳动物细胞和昆虫杆状细胞表达质粒的构建与制备

（1）融合基因哺乳动物细胞表达载体的构建：

根据小鼠VEGFR2 (SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)和小鼠XCL1 (SEQ ID No.4)蛋白的氨基酸序列构建融合蛋白XCL1-VEGFR2，为了促进表达融合蛋白的核酸在体内翻译出的融合蛋白可以有效的分泌到细胞外并趋化MHC-II+CD11c+CD8a+抗原交叉呈递DC细胞，我们保留了XCL1蛋白的分泌信号肽(SEQ ID No.5)，同时将VEGFR2介导细胞跨膜定位的信号肽去掉(SEQ ID No.6)。最终得到的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.7和SEQ ID No.8)。对于单独VEGFR2蛋白则将XCL1蛋白的分泌信号肽加到去除自身信号肽的蛋白N端(SEQ IDNo.9和SEQ ID No.10)，以保证单独VEGFR2表达载体表达出的VEGFR2蛋白也能同样的被分泌到细胞外。我们将氨基酸序列对应的核苷酸序列进行哺乳动物细胞表达偏好的密码子优化，由擎科公司进行合成，并连接到pcDNA3.1/zeo(-)以及pFastbac1-dual-MBP表达载体上（SEQ ID No.11~SEQ ID No.16）。

（2）融合基因哺乳动物细胞表达载体的扩增

细菌的转化，取-80℃冻存的感受态细菌置于冰上融化，待接近完全融化时加入100 ng 质粒，轻柔混匀，冰上放置 30 mins。将感受态置于 42℃水浴锅中热激 60 s，取出后立即置于冰上放置 2 mins。向管内加入 500 µL 不含抗生素的 LB 培养基， 37℃摇床内振荡培养 1 h。将细菌 4000 rpm 室温离心 2 mins，弃去部分上清（约 450 µL）后重悬细菌，取适量细菌悬液涂于含有相应抗生素的培养皿上。培养皿正面朝下放置， 37℃培养箱培养过夜。待克隆大小适宜后（约 16 h）用枪尖将克隆挑至加好抗生素的 LB 培养基中，37℃摇床中振荡培养至浑浊。取 15 mL 培养至合适浓度的细菌菌液， 4000 rpm 室温离心5mins，弃掉上清。按照北京天根公司的《质粒小提试剂盒》货号（DP103)说明书提取细菌DNA。首先加入 250 µL 含 RNA酶的细胞重悬液 P1 充分重悬细菌沉淀，并将沉淀转移至1.5 mL EP 管中。加入 250 µL 碱性细胞裂解液 P2，轻柔颠倒混匀至液体澄清。加入 350µL 中和液 P3，颠倒混合均匀至出现絮状沉淀物。混悬液 12000 rpm室温离心 10 mins。将DNA 吸附柱放入回收管中，加入 500 µL 平衡液活化吸附膜， 12000 rpm 离心 1 min 后弃掉液体。将步骤 4 中离心获得的上清转移至 DNA 吸附柱中， 12000 rpm 离心 1 min后弃去液体。向吸附柱内加入 600 µL 清洗液， 12000 rpm 离心 1min 后弃去液体，重复洗涤一次。 12000 rpm 空离回收管 2 mins。将收集管更换为新的 1.5 mL EP 管，室温放置 5 mins 晾干吸附柱。加入 70 µL 65℃预热的洗脱缓冲液或者高压过的纯净水，室温放置 5 mins 充分溶解 DNA， 12000 rpm 室温离心 3 mins，收集液体。弃掉吸附柱后对管内质粒进行浓度测定并标记质粒名称、浓度、提取日期。

（3）融合昆虫杆状细胞表达载体的构建

1）蓝白斑筛选的基本原理：此表达***的第一个成分是用来克隆目的基因的pFastBac菌株。基于pFastBac菌株的选择，表达基因被PH或p10启动子控制，在昆虫细胞内高水平表达表达框被Tn7的左右臂包围，包含一个庆大霉素抗性点, 形成一个微型的Tn7。此表达***的第二个成分是E.coli的DH10Bac品系。DH10Bac细胞包含带有微型-attTn7靶位点的病毒质粒和辅助质粒。只要pFastBac表达质粒转入DH10Bac细胞，就会在pFastBac菌株的微型Tn7单位和微型-attTn7的靶位点之间发生转化，从而产生重组质粒。病毒菌株（杆粒）在具有卡那抗性的质粒DH10Bac中扩增，在显色物质X-gal和诱导剂IPTG存在时，能补充染色体LacZ的缺失形成蓝斑。微型Tn7***到微型attTn7附属位点会干扰LacZa肽的表达，所以包含重组质粒的克隆在蓝色背景下是白色的，选择白斑分析。真正的白斑克隆比较大，因此为了避免选择成假阳性，选择最大的、最独立的白斑。

2）蓝白斑的制备：重组质粒pFastBac HTB的构建：使用以上介绍的实验方法进行引物设计(SEQ ID No.17~20)、琼脂糖胶回收、酶切反应、连接反应、转化和质粒提取等实验，最终得到将目的基因克隆进入pFastBac HTB的重组质粒；重组质粒pFastBac HTB转化到DH10Bac感受态细胞：挑取目的菌斑（白斑）：48个小时后，直到能够明确地区分蓝白斑，选择最大最独立的白斑2~3个，用5 ml LB培养基（已加入50 µg/ml 卡那霉素，10 µg/ml 四环素，7 µg/ml 庆大霉素）于37 ℃、220 rpm摇8~12个小时，直到菌液浑浊，之后用此菌液进行Bacmid的提取。

表1

实施例2 融合蛋白三维结构预测

根据融合蛋白的核苷酸序列，我们利用http://raptorx.uchicago.edu/网站对XCL1以及VEGFR2胞外区融合蛋白的三维结构进行预测。XCL1属于趋化因子，其趋化功能的正常发挥需要保有完整的空间结构。为了确保XCL1与VEGFR2胞外区融合后，XCL1仍然保留有自身的空间结构，我们对融合后的氨基酸序列在http://raptorx.uchicago.edu/网站上进行三维结构预测，结果如图2显示，XCL1与VEGFR2融合后，二者仍然各自保有原来的空间结构，并不影响XCL1的趋化功能发挥。

实施例3 编码XCL1-VEGFR2融合蛋白的哺乳动物细胞表达载体表达效果检测

转染前24小时，在6孔细胞培养板内接种1*10⁶个HEK293T细胞，待细胞密度长到70%-80%时开始转染试验。转染时提前在37°水浴锅中预热细胞培养基、无血清的 Opti-MEM培养基。转染时将 5 微克空载体（Vector），单独VEGFR2表达载体，XCL1-VEGFR2野生型和突变型融合基因质粒和20μL PEI 转染试剂先后加入到 200 μL无血清的 Opti-MEM 中，混合均匀后，室温下静置10分钟。将需要转染的细胞更换新鲜培养基，轻柔加入上述转染体系，轻轻摇匀。将细胞放回细胞培养箱中培养 6 小时后换液。转 48小时后收取细胞用WesternBlot检测XCL1-VEGFR2融合基因质粒HEK293T细胞中的表达效果。

为了方便检测融合基因的表达效果我们在融合蛋白的C端连接一个DDDDK5个氨基酸组成的Flag标签，以便利用Flag标签抗体检测融合蛋白的表达。收集细胞，加入60μL的含有 PMSF 或 Cocktail 蛋白酶抑制剂的 0.5% NP40 裂解缓冲液。充分重悬细胞， 4℃旋转裂解细胞 30 分钟。12000 rpm， 4℃离心裂解液 10 分钟，收集上清至新的 1.5 mL EP 管中，弃掉沉淀。根据样品实际体积加入 5×SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，混合均匀后将样品放在 100℃空气浴中加热 10分钟，立即进行 Western blot，利用Flag标签抗体(Sigma,F3165)进行检测,结果如图3显示空载体（Vector）无蛋白表达，单独VEGFR2表达载体，XCL1-VEGFR2野生型和突变型融合基因质粒均能有效表达并且表达量相当。

实施例4 编码XCL1-VEGFR2融合蛋白的昆虫杆状细胞表达载体表达以及蛋白纯化

细胞和培养基的选择：本实验所用的细胞表达是昆虫细胞SF9（草地贪夜蛾细胞），此细胞可以贴壁或悬浮培养，一般悬浮培养SF9细胞进行目的蛋白的大量表达。培养基为无血清培养基，本实验病毒包被阶段需用Gibico培养基贴壁培养。重组蛋白的大量制备阶段选用的是义翘神州SIM SF培养基悬浮培养。

（1）转染昆虫细胞

准备细胞：使用Polystyrene的6孔培养板，细胞总数为0.9×10⁶细胞/孔，多次轻轻上下和左右来回移动使细胞均匀地铺在培养板上，静置30 min；

（2）DNA/lipid混合物的制备：

1）向1.5 ml EP管中加入100 µl Gibco培养基，再加入1 µl Genejuice，此为溶液1；

2）向另一个1.5 ml EP管中先加入100 µl Gibco培养基，再加入1 µg Bacmid，此为溶液2；

3）使溶液1和溶液2充分混合，室温下孵育30 min；

（3）转染：再加800 μl Gibco培养基到DNA/lipid混合物，把培养板中的细胞培养液吸干，快速把1 ml DNA/lipid混合物转至细胞单层上，轻轻摇晃均匀，27 °C静置5个小时；

（4）培养：5个小时之后，去掉转染培养基，再加入2 ml Gibco培养基，27 °C静置培养；

（5）孵育72小时后能观察到病毒感染的现象，在第5~6天提取P0病毒株。

（6）病毒株制备、扩增及鉴定

1）制备病毒株：一旦得到转染细胞且出现晚期转染现象，则可从6孔板中的孔中收集含有病毒的细胞，并转入无菌的2.0 ml离心管中。离心5 min除去细胞和碎片。之后将上清转到新的2.0 ml离心管中，即P0病毒株，加入10 % FBS，4℃避光储存。

2）扩增病毒株：取100~200 µl P0病毒加入到总细胞数为18~20×10⁶、总体积为15ml的培养基中，用T75进行病毒扩增；培养4~5天后收集含有病毒的培养基，并转入无菌的15ml离心管中。500×g离心5 min，分别收集上清和沉淀

（7）重组蛋白的大量制备

1）病毒感染：利用昆虫细胞SF9表达目的蛋白，细胞扩增至合适感染时的细胞密度，加入相应量的病毒。大约65 h后收集细胞悬液。

2）细胞上清液收集：目的蛋白为分泌蛋白，因此目的蛋白在上清液中。将表达好目的蛋白的细胞悬液使用高速离心机8000 rpm/4 ℃离心30 min，使细胞与上清液分离，取上清液，之后直接进行体外亲和层析的蛋白纯化。

3）利用多聚组氨酸标签（His-tag）进行亲和层析的蛋白纯化

构建的目的蛋白的N-端带有由连续六个组氨酸组成的His-tag，组氨酸侧链的咪唑基团能够结合金属离子（镍或钴）。如果将镍或钴离子固定在层析介质上，当含有His-tag融合蛋白的混合液流经层析柱时His-tag融合蛋白被吸附在柱子上，杂蛋白全部流出；之后使用较高浓度的咪唑溶液（如200 mM）洗脱，咪唑便与His-tag的咪唑环竞争，最终将His-tag融合蛋白洗脱下来。组氨酸标签很小且几乎不会影响目的蛋白的功能、活性或结构，应用比较广泛。主要实验步骤如下所示：

1）结合：将离心后获得的细胞上清液加入到镍柱中，于4 ℃结合将上清液缓慢流穿Ni Beads一遍，使带有His标签的目的蛋白与Ni Beads充分结合；

2）洗涤杂蛋白：先用加入了20mM咪唑的PBS溶液进行洗涤，洗涤过程中使用考马斯亮蓝染液中检测杂蛋白是否洗涤完全；

3）洗脱目的蛋白：用加入了200mM咪唑的PBS洗脱液洗脱目的蛋白，洗脱过程中使用考马斯亮蓝染液中检测是否洗涤完全；

4）把步骤3洗脱得到的目的蛋白溶液用4 ℃离心机进行浓缩至终体积500 µl；

5）凝胶过滤层析柱的分离纯化：把步骤4得到的浓缩液上样至已经以PBS预先平衡好的凝胶过滤层析柱Superdex 200，收集目的蛋白峰，用Western Blot鉴定是否为目的蛋白，并且利用12 % SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度，如图4所示；

6）浓缩冻存：根据12 % SDS-PAGE电泳鉴定的结果，将纯度达到要求的蛋白进行浓缩，利用微量分光光度计测定蛋白浓度后分装，液氮速冻保存于-80 ℃。

实施例5，XCL1-VEGFR2融合蛋白结合MHC-II+CD11c+CD8a+抗原交叉呈递DC细胞能力检测

获得纯化后的融合蛋白后，本发明首先对从昆虫细胞中获得的蛋白是否可以有效地结合MHCII+CD11c+CD8a+抗原交叉呈递DC细胞进行了验证。

（1）分离纯化CD11c+DC细胞

以小鼠全脾作为CD11c+DC细胞来源，先取小鼠脾利用70um孔径细胞筛网在1640培养基中磨碎成单细胞，200g离心10分钟后，弃上清，利用R&D公司红细胞裂解液（货号WL2000）对脾细胞进行裂红处理。具体为先将裂解液A用蒸馏水稀释10倍配成工作液，每个脾加入2mL工作液重悬，室温放置10min，期间将中和液B用蒸馏水稀释10倍配成工作液。十分钟后将10mL中和液B加入裂解液中中和后200g离心10min。细胞团用含1%灭活FBS的PBS缓冲液洗涤一次并计数。取总数1*10⁸次方个细胞重悬于400μL含1%灭活FBS的PBS缓冲液中，加入100μLCD11c磁珠（Miltenyi Biotec：130-108-338），4°避光放置20min。这期间利用1%灭活FBS的PBS缓冲液平衡吸附磁珠的柱子。20min后将细胞以及磁珠混合液一并转入磁珠吸附柱子，并将柱子放于磁力架上，待细胞完全进入柱子中，用1%灭活FBS的PBS缓冲液洗涤三次每次3mL。之后将柱子从磁力架取下放于15mL离心管上方加入5mL1%灭活FBS的PBS缓冲液并快速推动将CD11c阳性DC细胞洗脱，计数并用200g离心10min。将最终获得的CD11c阳性DC细胞用无血清1640重悬为1*10⁶每mL。铺于24孔板中，每孔1mL。将细胞分为BSA蛋白对照组，VEGFR2蛋白对照组以及XCL1-VEGFR2野生型蛋白实验组，每组加入蛋白总量为50μg混匀后放于37°二氧化碳培养箱培养40分钟后，收集细胞500g离心，并用1%灭活FBS的PBS缓冲液反复洗涤两次。并进行流式染色：MHC-II APC，Flag-dye light 488，CD8α-Percp/Cy5 .5。利用BD LSRII仪器中速收集细胞，并分析不同组之间MHC-II+ Flag-dye light 488+CD8α+细胞比例。每组重复3次。

（2）结果显示，未融合XCL1的VEGFR2蛋白与BSA对照蛋白结合的MHC-II+CD11c+CD8a+数目以及比例类似，而融合了XCL1的VEGFR2蛋白更强的结合到MHC-II+CD11c+CD8a+抗原交叉呈递DC细胞上，结合能力高于对照组20倍以上，如图5A，5B所示。

实施例6 XCL1-VEGFR2融合蛋白对MHCII+CD11c+CD8a+抗原交叉呈递DC细胞的趋化能力检测

（1）鉴于XCL1-VEGFR2融合蛋白可以有效地结合MHCII+CD11c+CD8a+抗原交叉呈递DC细胞，我们根据以往研究中表述XCL1趋化因子可以有效招募MHCII+CD11c+CD8a+抗原交叉呈递DC细胞，设计Tanswell试验验证融合蛋白可以有效地趋化招募DC细胞。Transwell试验采用上下两层的双层细胞培养板，下层加入趋化因子，上层铺入靶细胞，在本实验中为经CD11c磁珠富集过的DC细胞。上层培养室底部为特定孔径的膜，本实验根据既往研究报道选用24孔Transwell板上层直径6.5mm，5μm孔径的膜，将靶细胞铺于膜上，将会由于下层趋化因子的吸引而穿透膜进入下层。进入下层细胞的多少与趋化因子的趋化能力成正比。我们首先将经CD11c磁珠富集过的DC细胞重悬为1*10⁷每mL，在上层小室中加入100μL细胞即1*10⁶个。在下层加入含有BSA蛋白70ng的对照组，VEGFR2蛋白70ng对照组以及XCL1-VEGFR2野生型和突变体蛋白70ng的实验组培养基700μL，以保证上下层培养基的液面高度一致，防止上层细胞因为液面高度不同而因压强作用进入到下层中。将培养板放于二氧化碳培养箱培养5小时。去掉上层小室收集下层培养基中细胞，500g离心，并用1%灭活FBS的PBS缓冲液反复洗涤两次。并进行流式染色：MHC-II APC，CD11c-PE，CD8α-Percp/Cy5.5。利用BD CantoII仪器中速收集细胞，并分析不同组之间MHC-II+ CD11c-PE +CD8α+细胞比例。每组重复3次。

（2）结果显示，未融合XCL1的VEGFR2蛋白与BSA对照蛋白趋化下来的MHC-II+CD11c+CD8a+数目以及比例类似，而融合了XCL1的VEGFR2蛋白无论是野生型还是突变体均能趋化更多的的MHC-II+CD11c+CD8a+抗原交叉呈递DC细胞，经统计检验具有显著性差异，统计方法为Unpaired t test，如图6A，6B所示。

实施例7 融合基因对B16黑色素瘤细胞同种移植瘤发生的干预效果

鉴于融合基因在哺乳动物细胞可以正常表达，融合蛋白也可以有效地趋化、结合MHC-II+CD11c+CD8a+抗原交叉呈递DC细胞。我们提取单独VEGFR2和XCL1-VEGFR2野生型和突变型质粒，利用Wealtec公司的基因枪（GDS-80）对小鼠进行免疫质粒注射。并同种移植B16黑色素瘤细胞后观察融合基因免疫对B16黑色素瘤细胞生长的抑制情况。

（1）B16黑色素瘤细胞培养以及成瘤后VEGFR2基因表达情况检测

复苏B16细胞：预热细胞培养基（细胞培养基由 Corning 公司的 DMEM 培养基加入 10% 浓度的 FBS 配制而成）。从液氮或-80℃冰箱中取出待复苏的冻存细胞，快速置 37℃水浴锅中融化。细胞溶解完全后， 1500 rpm 离心 3 min,同时在培养皿中加入 8 mL 预热后的细胞培养基。离心后弃上清，加入 1 mL 预热的细胞培养基，重悬细胞并转移至准备好的培养皿中，标记细胞名称、日期及传代次数。将细胞置于 37℃， 5% CO2 培养箱中培养。第二天传代，预热细胞培养基、胰蛋白酶、 PBS 缓冲液。用真空泵将培养皿中的旧培养基吸出。加入 7 mL PBS 缓冲液润洗一遍细胞，吸出 PBS。加入 1 mL 胰蛋白酶，在 37℃孵箱中放置消化恰当时间。加入 3 mL 培养基终止消化，用电动移液器吹打细胞至单细胞悬液并转移至 15mL 离心管， 1500 rpm 离心 3 min，同时准备新的培养皿，各自加入 8 mL培养基。离心后弃上清，根据所需传代比例加入适量培养基重悬细胞，吹打至单细胞悬液，取 1 mL 单细胞悬液加入新的培养皿中，放回 5% CO2 的 37℃培养箱中继续培养。待细胞长到80%-90%密度，按上述办法消化细胞计数并重悬于无血清DMEM培养基中，根据前期我们的成瘤经验，将细胞浓度调整为1*10⁶个每mL，每只小鼠腋下皮下接种100μL细胞。两周后取所形成的黑色素瘤和周边正常皮肤，提取总RNA。收取适量的小鼠组织，加入 1 mL Trizol（Invitrogen）。用组织匀浆仪裂解 2 mins， 4℃转动 30 mins 进行彻底裂解。每 1 mLTrizol 中加入 200 µL 氯仿，剧烈震荡 15 s，室温静置 15 mins。预冷 4℃离心机，12000 rpm，离心 10 mins。离心后，将上层水相转移到新的 1.5 mL EP 管中，加入 500 µL异丙醇，颠倒混匀后离心, 12000 rpm， 4℃，离心 10 mins。离心后可见白色沉淀，弃上清，用 DEPC 水配置的 75%乙醇洗涤 RNA 沉淀后7500 rpm，室温离心 5 mins。弃上清，室温放置干燥 RNA 至沉淀呈半透明状态。取适量体积的 DEPC 水溶解 RNA。混匀溶解后的 RNA，使用 Nanodrop 检测RNA 的浓度和纯度，在 EP 管壁及盖子上标记 RNA 种属类型、浓度、提取时间。利用下表所示引物(SEQ ID No.21~24)进行real time PCR检测。结果显示与周边正常皮肤相比，所形成的黑色素瘤中VEGFR2表达水平显著升高，如图7所示，说明利用B16细胞评价融合基因疫苗是合理的。

表2

（2）融合基因免疫后对B16黑色素瘤细胞同种移植瘤发生的预防效果

确定B16细胞成瘤模型可用后，我们按照图8A的时间轴标注的免疫策略对小鼠进行基因枪质粒注射。将C57B6（购自为通利华）周龄雄性小鼠，分为注射单独VEGFR2和XCL1-VEGFR2野生型和突变型质粒的三组，每组五只，利用脱毛膏进行小鼠右侧靠近腹股沟***处脱毛处理。之后利用基因枪在脱毛处注射质粒，每只50μg，每周一次，共注射四次，在最后一次注射后一周接种之前摸索好成瘤条件的B16黑色素瘤细胞，观察肿瘤形成时间并每两天测量肿瘤的长径a和短径b，按照a*b*b/2进行肿瘤体积计算，绘制肿瘤生长曲线。结果如图8A，8B所示，免疫注射XCL1-VEGFR2野生型和突变型质粒均能有效地延迟肿瘤的发生时间以及生长速度。说明融合基因免疫的治疗效果显著有效。

（3）探索融合基因免疫是否诱导出了更强的细胞特异性T细胞反应

在对照组肿瘤生长至伦理终点2000mm³时，处死小鼠将各组小鼠所负荷的肿瘤取下拍照，之后用100μm孔径筛网将细胞研磨成单细胞悬液，800g离心后将细胞重悬与80%percoll溶液中每1000mm³加4mL重悬，在上层小心加入40% pecoll溶液，800g离心20分钟，弃去最上层肿瘤细胞留中间层淋巴细胞，洗涤计数，最后将细胞重悬于含10%热灭活FBS 的1640培养基中浓度为1*10⁶个每mL，将细胞铺于24孔板中，每孔1mL并加入VEGFR2表位多肽刺激，同时加入Golgi stop（Biolegend）抑制胞内因子分泌。12小时后收取细胞用1%灭活FBS的PBS缓冲液洗涤细胞两次，并进行流式染色：Gran B-PE，CD8α-Percp/Cy5.5。结果如图9所示，经XCL1-VEGFR2野生型和突变型质粒免疫后的小鼠肿瘤内针对VEGFR2的特异性T细胞与单独VEGFR2免疫组相比显著增多，说明XCL1-VEGFR2野生型和突变型质粒免疫确实诱导出了特异性反应的CD8a细胞毒性T淋巴细胞。

实施例8：融合蛋白免疫后T细胞过继治疗对黑色素瘤的治疗效果

鉴于融合基因免疫后成功的在小鼠体内诱导出了针对VEGFR2的特异性细胞毒性T淋巴细胞，所以本发明利用从昆虫杆状细胞中纯化的融合蛋白，免疫T细胞供体鼠，在供体鼠内诱导针对VEGFR2的特异性细胞毒性T淋巴细胞，并将其过继到接有B16肿瘤细胞的受体鼠内，看是否可以有效抑制受体鼠的肿瘤的发生发展。

（1）过继T细胞供体鼠的融合蛋白免疫

为了使昆虫杆状细胞纯化的融合蛋白能有效的诱导出针对VEGFR2的特异性细胞毒性T淋巴细胞，本发明团队前期结合既往研究XCL1靶向DC细胞的特点对给药途径进行了探索优化，首先采用静脉给药结果如图10A所示，静脉注射KDR蛋白加LPS佐剂并不能产生抗肿瘤效果。最终确定融合蛋白40微克剂量加Poly：IC 30微克加不完全弗氏佐剂乳化后经皮下免疫，每周一次，共免疫两次可以有效地诱导针对VEGFR2的特异性细胞毒性T淋巴细胞产生，经过继治疗对B16黑色素瘤细胞同种移植瘤产生抑制效果。

（2）T细胞过继治疗对黑色素瘤的治疗效果

在第二次经皮下蛋白免疫后一周处死小鼠，取小鼠脾脏按照实施例5中的方法进行研磨，裂红并用CD8a磁珠对细胞毒性T淋巴细胞富集，最后将获得的细胞重悬在无血清1640培养基中，浓度为2*10⁷个每mL，对提前两天经尾静脉接种3*10⁵个B16黑色素瘤细胞的小鼠再次尾静脉过继获得的T细胞每只200μL共2*10⁶个细胞。两周后解剖小鼠取小鼠肺组织于10%多聚甲醛中固定，第二天进行拍照，结果如图10B所示，过继经XCL1-VEGFR2野生型和突变型蛋白免疫后的小鼠的细胞毒性T淋巴细胞后，受体小鼠的肺部结节显著减少。说明经XCL1-VEGFR2野生型和突变型蛋白免疫后的小鼠的产生了针对VEGFR2的细胞毒性T淋巴细胞，并可在体内有效杀灭表达VEGFR2的黑色素瘤细胞。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 诺未科技（北京）有限公司

<120> 靶向VEGFR2的转移性癌疫苗

<130> MP2001156

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 743

<212> PRT

<213> VEGFR2

<400> 1

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

Arg Asp Ser Glu Glu Arg Val Leu Val Thr Glu Cys Gly Gly Gly Asp

50 55 60

Ser Ile Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Arg Val Val Gly Asn Asp

65 70 75 80

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Val Tyr Val Tyr Val Arg Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val

100 105 110

Ser Asp Gln His Gly Ile Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr

115 120 125

Val Val Ile Pro Cys Arg Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu

130 135 140

Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile

145 150 155 160

Ser Trp Asp Ser Glu Ile Gly Phe Thr Leu Pro Ser Tyr Met Ile Ser

165 170 175

Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Thr Tyr

180 185 190

Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp

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210 215 220

Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Leu Asp

225 230 235 240

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245 250 255

Asn Arg Asp Val Lys Pro Phe Pro Gly Thr Val Ala Lys Met Phe Leu

260 265 270

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530 535 540

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<210> 2

<211> 743

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Val Val Ile Pro Asn Arg Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu

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Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile

145 150 155 160

Ser Trp Asp Ser Glu Ile Gly Phe Thr Leu Pro Ser Tyr Met Ile Ser

165 170 175

Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Thr Tyr

180 185 190

Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp

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Val Ile Leu Ser Pro Pro His Glu Ile Glu Leu Ser Ala Gly Asn Lys

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Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Leu Asp

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1 5 10 15

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<212> PRT

<213> Mouse XCL1

<400> 4

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1 5 10 15

Trp Val Val Glu Gly Val Gly Thr Glu Val Leu Glu Glu Ser Ser Cys

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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<210> 12

<211> 2606

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

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<210> 14

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<212> DNA

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<210> 15

<211> 2586

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<400> 15

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<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

gcagaagata ctgtcaccac c 21

Claims

1.融合蛋白，其特征在于，包括促进肿瘤新生血管生成的VEFGR2（KDR）的能够诱发特异性CD8+T反应的胞外区或其MHCI类分子结合表位优化形式胞外区；接头；以及特异性结合具有抗原交叉呈递能力的DC细胞的人或鼠XCL1蛋白；

所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.7和8所示。

2.编码如权利要求1所述的融合蛋白的核苷酸。

3.重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求1所述的融合蛋白或如权利要求2所述的核苷酸。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括哺乳动物细胞表达载体或昆虫杆状细胞表达载体。

5.包括如权利要求1所述的融合蛋白或如权利要求2所述的核苷酸的重组菌株或细胞。

6.如权利要求1所述的融合蛋白、如权利要求2所述的核苷酸、如权利要求3或4所述的重组表达载体或如权利要求5所述的重组菌株或细胞在制备转移性癌症或VEGFR2高表达的黑色素瘤的疫苗或制备预防和/或治疗转移性癌症或VEGFR2高表达的黑色素瘤的药物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述转移性癌症包括肝癌，结直肠癌或肺癌。

8.转移性癌症或VEGFR2高表达的黑色素瘤的疫苗，其特征在于，包括如权利要求1所述的融合蛋白以及药学上可接受的运载体、赋形剂和/或佐剂。

9.预防和/或治疗转移性癌症或VEGFR2高表达的黑色素瘤的药物，其特征在于，包括如权利要求1所述的融合蛋白以及药学上可接受的辅料。