CN112980788B - 一种低表达cd7的nk细胞制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低表达CD7的NK细胞制备方法，根据本发明的制备方法获得的NK细胞低表达CD7，将其导入靶向CD7的CAR后可以避免细胞的***现象，使其临床应用价值更高。

Description

一种低表达CD7的NK细胞制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种低表达CD7的NK细胞制备方法。

背景技术

NK细胞(natural killer cells)又称自然杀伤细胞，是一类CD56+，CD3-的淋巴细胞，是机体内天然免疫***的效应细胞，它无需抗原预先致敏即可识别肿瘤及病毒感染的细胞。它位于机体防御体系的第一道防线，同时它又能通过早期分泌多种细胞因子和趋化因子来调节获得性免疫应答，故也是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁，在肿瘤免疫、清除非己细胞等方面发挥重要作用。

现阶段临床上获得NK细胞疗法是采用体外培养的方法，把患者自身外周血中的NK细胞进行扩增，使细胞数目扩大数千倍且细胞毒活性极大增强，再回输患者的体内。取自患者自身的细胞首先限制了其产业化生产的可能性；另外由于外周血中NK细胞的含量低，仅占外周血淋巴细胞总数的5％-10％，细胞数量有限，且目前尚缺乏有效的高纯度的体外扩增体系，所以在很大程度上限制了NK细胞的临床应用，这种传统的NK细胞制备方法并不是理想的选择。首先，它主要用于一对一的个体化治疗方法，只能在医院床边开展；第二，这种治疗方法自然杀伤性细胞诱导的时间太长，至少需要6周，对于晚期肿瘤病人，尤其是手术后放疗、化疗的病人，在细胞制备完成或细胞回输之前可能就已经去世；第三，一对一的治疗，即每一个人要做一全套细胞诱导扩增培养的过程，在实验室管理方面，室内质量控制很难，室间质量控制更难；第四，很多病人本身的NK细胞就是缺陷的，回输治疗效果有限。

目前虽然有大量的研究集中在寻找不同来源的CD34+细胞向NK细胞诱导分化的最佳体系，但是尚未有一种方法能够简便、高效地得到高纯度、高数量、杀伤能力强的NK细胞。

发明内容

本发明的目的之一是针对现有技术中存在的问题和不足，提供一种由脐带血诱导培养NK细胞的体外制备方法，以解决现有技术中NK细胞来源不足、疗效限制和难以产业化生产的问题，具有广阔的应用前景。

本发明的目的之二是提供由低表达CD7的NK细胞制备而成的表达靶向CD7的嵌合抗原受体的NK细胞。

为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

本发明提供了一种CD56+NK细胞诱导培养基，所述诱导培养基包括以下细胞因子：IL-7、IL-15、SCF、FLt3L。

作为可替代的技术方案，所述诱导培养基包括以下细胞因子：IL-7、IL-15、SCF、FLt3L、IL3。

优选地，IL-7终浓度为10ng/ml，IL-15终浓度为20ng/ml，SCF终浓度为10ng/ml、FLt3L终浓度为10ng/ml，IL-3终浓度为5ng/ml。

优选地，所述诱导培养基还包括X-VIVO、人AB血清；优选地，人AB血清比例为5％。

优选地，所述诱导培养基还包括X-VIVO、自体血浆；优选地，自体血浆比例为5％。

本发明还提供了一种制备CD56+NK细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

1)从脐带血分离单个核细胞；

2)分选获得CD34+细胞；

3)CD34+细胞在前面所述的诱导培养基中培养获得CD56+NK细胞。

进一步，CD34+细胞在前面所述的诱导培养基中培养获得CD56+NK细胞的步骤如下：将细胞分选后用前面所述的诱导培养基重悬细胞，并把细胞铺到24孔板中，调整细胞密度为0.8-1.2*10⁵个/孔。

从血液样品中分离单个核细胞的方法是本领域熟知的，如Ficoll分层液法、Percoll分层液法。

进一步，从脐带血分离单个核细胞的步骤包括：利用生理盐水稀释脐带血，加入淋巴细胞分离液，离心收集白膜层细胞；生理盐水稀释白膜层细胞后离心弃上清；加入红细胞裂解液裂解细胞，离心弃上清；重悬细胞沉淀。

优选地，利用生理盐水以1：1比例稀释脐带血。

优选地，利用生理盐水以1：1比例稀释白膜层细胞。

在本发明的具体方案中，从脐带血分离单个核细胞的步骤包括：利用生理盐水以1：1比例稀释脐带血，加入稀释后脐带血1/2体积的淋巴细胞分离液；2000r/min，离心20min；收集白膜层细胞，然后加入生理盐水以1：1比例进行稀释；将细胞以2000r/min，离心5min，弃掉上清；用5ml红细胞裂解液裂解细胞5min，随后将细胞以2000r/min，离心5min，弃掉上清；用5-10ml的DPBS重悬细胞计数，计算所得到的细胞数。

进一步，所述红细胞裂解液由NH₄Cl、KHCO₃、EDTA、超纯水按照本领域常规比例配置而成。

进一步，分选CD34+细胞的步骤包括：将单个核细胞用分选缓冲液重悬，依次加入FCR阻滞剂和CD34磁珠混匀，低温孵育；孵育后的细胞中加入分选缓冲液离心弃上清；用分选缓冲液重悬后加入分选柱中；分选柱中加入分选缓冲液冲洗后将分选缓冲液加入到分选柱中，将柱塞推到分选柱底端，将标记的细胞冲洗下来，计数。

优选地，低温孵育是指4℃冰箱孵育30min。

优选地，分选缓冲液是指0.5％HSA。

在本发明的具体方案中，分选CD34+细胞的步骤包括：将细胞以300g/min，离心10min，弃掉上清，用300μl的0.5％HSA重悬细胞，随后依次加入100μl FCR阻滞剂和CD34磁珠，每加入一种东西混匀细胞一次，随后将50ml离心管放入4℃冰箱孵育30min，每隔5min混匀一次细胞；将孵育好的细胞中加入5-10ml0.5％HSA，将细胞以300g/min，离心10min，弃掉上清；用500μl 0.5％HSA重悬细胞，随后将细胞加入到分选柱中，分选柱需要提前用3ml0.5％HSA润洗一遍；向分选柱中加入3ml 0.5％HSA冲洗分选柱3次；随后将分选柱从磁场中移出，将5ml 0.5％HSA加入到分选柱中，用力将柱塞推到分选柱底端，将标记的细胞冲洗下来，计数。

本发明还提供了一种NK细胞活化培养基，所述活化培养基包括：IL-2、IL-15、IL-21。

作为可替代的技术方案，所述活化培养基包括OK432、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-21。

优选地，OK432终浓度为100ng/ml，IFN-γ终浓度为1000IU/ml，IL-2终浓度为1000IU/ml，IL-15终浓度为100ng/ml，IL-21终浓度为100ng/ml。

优选地，所述活化培养基还包括KBM581、人AB血清。

更优选地，所述人AB血清比例为5％。

优选地，所述活化培养基还包括KBM581、自体血浆；优选地，自体血浆比例为5％。

本发明提供了一种促进CD34+细胞向CD56+NK细胞转变或制备CD56+NK细胞的方法，所述方法包括

1)利用前面所述的方法获得CD56+NK细胞；

2)CD56+NK细胞活化。

进一步，CD56+NK细胞活化包括将利用前面所述的方法获得的CD56+细胞在前面所述的活化培养基中培养。

进一步，CD56+NK细胞活化包括利用前面所述的方法培养10-14天后获得的细胞在前面所述的活化培养基中培养；优选地，CD56+NK细胞活化包括利用前面所述的方法培养10-14天后采用每2-3天半换液的方式将获得的细胞在前面所述的活化培养基中培养；优选地，在活化培养基中培养一周。

本发明还提供了一种NK细胞扩增培养基，所述NK细胞扩增培养基包括以下细胞因子：IL-2、IL-21。

优选地，IL-2终浓度为1000IU/ml。

进一步，所述扩增培养基还包括KBM581、人AB血清。

优选地，所述人AB血清比例为5％。

进一步，所述扩增培养基还包括KBM581、自体血浆；优选地，自体血浆比例为5％。

本发明的自体血浆优选已经灭活的自体血浆。

灭活的自体血浆制备方法如下：将血液到入无菌50ml离心管，升9降7，750g离心15min。收集上层血浆于50ml离心管中，56℃孵育30min，4℃放置30min，1000g离心10min，收集上清4℃保存备用。

本发明还提供了一种制备NK细胞的方法，所述方法包括：

1)利用前面所述的方法获得细胞；

2)CD56+NK细胞活化；

3)经步骤2)获得的细胞在前面所述的扩增培养基中进行培养。

步骤1)和步骤2)的限定同前。

优选地，步骤3)包括将前面获得的细胞以每隔2-3天半换液的方式将培养基换成扩增培养基继续培养。

本发明还提供了利用前面所述的方法制备而成的NK细胞。

优选地，所述NK细胞低表达CD7。

优选地，本发明制备的NK细胞纯度达到80％以上。

本发明还提供了一种基因修饰的NK细胞，所述NK细胞是利用前面所述的方法制备而成的NK细胞(低表达CD7)。

进一步，基因修饰的NK细胞包含以下一种或多种基因的***/缺失：靶向模式、受体、信号传导分子、转录因子、药物标靶候选物、免疫反应调控和调节，或抑制所述NK细胞或其衍生细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、存留和/或存活的蛋白质。

进一步，所述基因修饰的NK细胞包括表达嵌合抗原受体的NK细胞。

本发明中提及的嵌合抗原受体所靶向的抗原包括肿瘤-特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA为对肿瘤细胞唯一的，并不发生在身体的其他细胞上。TAA相关的抗原不是对肿瘤细胞唯一的，并且相反，其在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的病症下，也在正常细胞上进行表达。肿瘤上的抗原表达可在使免疫***能够响应抗原的病症下发生。TAA可为在胚胎发育期间，当免疫***不成熟并且不能响应时，在正常细胞上表达的抗原，或它们可为在正常细胞上以极低的水平正常存在的抗原，但其在肿瘤细胞上以高得多的水平进行表达。

TSA或TAA抗原的非限制性例子包括以下：分化抗原诸如MART-l/MelanA(MART-1)、gp100(Pmel17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤-特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原诸如CEA；过表达的致癌基因和突变的肿瘤-抑制基因诸如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位产生的独特的肿瘤抗原诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、1GH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，诸如Epstein Barr病毒抗原EBVA和人***瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的、基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3\CA27.29\BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

在优选的实施方式中，靶向抗原包括但不限于CD7、CD19、CD20、CD22、RORl、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR等等。

在本发明的具体实施方案中，所述嵌合抗原受体靶向CD7。

优选地，所述靶向CD7的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；优选地，所述靶向CD7的嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供前面所述的基因修饰的NK细胞的制备方法，所述制备方法包括：

1)制备前面所述的低表达CD7的NK细胞；

2)对步骤1)获得的NK细胞进行基因修饰。

进一步，所述基因修饰包括将表达嵌合抗原受体的编码核酸序列导入经步骤1)获得的NK细胞中。

本发明还提供了一种试剂盒或药物，所述试剂盒或药物包括前面制备而成的的NK细胞或前面所述的基因修饰的NK细胞。

进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体。

药学上可接受的载体可以是任何常规使用的那些且仅由化学-物理的考虑(例如溶解度和与活性试剂的反应性的缺失)和给药方式限制。在此描述的所述药学上可接受的载体，例如，载体，佐剂，赋形剂和稀释剂对那些本领域技术人员公知的并且公众容易获得。优选所述药学上可接受的载体为对活性试剂为化学惰性的载体和在使用条件下无有害副作用或毒性的载体。

本发明还提供了一种用于在受试者中治疗癌症或自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的前面所述的NK细胞、前面所述的基因修饰的NK细胞、前面所述的药物。

本发明还提供了前面制备而成的NK细胞的应用，所述应用包括以下任一项：

1)在制备治疗癌症或自身免疫性疾病的药物中的应用；

2)在制备表达嵌合抗原受体的免疫细胞中的应用；

3)在制备前面所述的试剂盒中的应用。

本发明还提供了前面所述的基因修饰的NK细胞的应用，所述应用包括以下任一项：

1)在制备治疗癌症或自身免疫性疾病的药物中的应用；

2)在制备前面所述的试剂盒中的应用。

癌症在本文中被广泛地定义为包括任何致瘤性病况，无论是恶性的、恶化前的或非恶性的。然而，一般来说，它可能是恶性病况。实体肿瘤和非实体肿瘤均包括在内。

本发明的癌症涵盖了任何类型的癌症，包括实体癌症和造血癌症。代表性癌症包括急性成淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、爱滋病相关癌症(例如，卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)和淋巴瘤)、***癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外膀胱癌、骨癌(例如，尤文氏肉瘤(EwingSarcoma)、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)、脑干神经胶质瘤、脑癌、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt Lymphoma)、类癌瘤、心脏肿瘤(Cardiac/Heart Tumour)、中枢神经***癌症(包括非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、胚胎肿瘤、生殖细胞肿瘤、淋巴瘤)、子***、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、胆管癌、肝外乳腺管原位癌(DCIS)、胚胎肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌(包括眼内黑素瘤和成视网膜细胞瘤)、骨纤维组织细胞瘤、胆囊癌、胃癌(Gastric/Stomach Cancer)、胃肠类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、组织细胞增多病、朗格汉斯细胞(Langerhans Cell)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma)、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、卡波西肉瘤、肾癌(包括肾细胞和韦尔姆斯氏瘤(Wilms Tumour))、朗格汉斯细胞组织细胞增多病、喉癌、白血病(包括急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML))、唇癌和口腔癌、肝癌(原发性)、小叶原位癌(LCIS)、肺癌、淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Macroglobulinemia)、黑素瘤、梅克尔细胞癌(MerkelCellCarcinoma)、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈部癌症、涉及NUT基因的中线癌、口癌、儿童多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、蕈样真菌病、骨髓发育不良综合征、骨髓发育不良/骨髓增生性赘瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生性病症、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌(Oral Cancer/OralCavity Cancer)、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞肿瘤)、***状瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、副甲状腺癌、***癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、浆细胞赘瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺胚细胞瘤、妊娠和乳腺癌、原发性中枢神经***(CNS)淋巴瘤、***癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、塞扎里综合征(Sézary Syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈部癌症、胃癌(Stomach/Gastric Cancer)、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜、子宫肉瘤、***癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症以及韦尔姆斯氏瘤。

待使用本发明的方法和细胞治疗的受试者可以是任何哺乳动物物种。举例来说，受试者可以是以下任何物种：家养宠物，如小鼠、大鼠、沙鼠、兔子、天竺鼠、仓鼠、猫或狗；或家畜，如山羊、绵羊、猪、牛或马。在本发明的另外一个优选实施例中，受试者可以是灵长类动物，如猴、长臂猿、大猩猩、猩猩(orang-utang)、黑猩猩或倭黑猩猩(bonobo)。在本发明的一个优选实施例中，受试者是人类。

如本文所用的术语“自身免疫疾病”被定义为由自身免疫应答产生的紊乱。自体免疫疾病是对自身抗原的不适当和过度应答的结果。自身免疫疾病的例子包括但不限于阿狄森氏疾病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克罗恩氏疾病、糖尿病(1型)、营养不良性大疱性表皮松解症、***、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏疾病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏疾病、溶血性贫血、***性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病变、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等等。

本文的术语“治疗”是指递送有效量的该制剂以达成预防任何症状或疾病病况产生的目的或达成预防或延迟进展、减轻、改善或消除已产生的此类症状或疾病病况的目的。因此，术语“治疗”旨在包括治疗如下个体的程度最小或不可检测的疾病，该个体(i)在第一治疗之后有部分反应或完全反应，(ii)有所缓解，(iii)罹患可检测的疾病，或(iv)患有恶性疾病前兆。

本发明的优点和有益效果：

本发明利用脐带血的PBMC通过CD34分选获得CD34+细胞，通过诱导分化形成CD56+NK细胞，该NK细胞低表达CD7，优势在于对其进行CD7相关CAR的转导，制备成CD7-CAR-NK时，可以避免细胞的***现象。

附图说明

图1显示CD56+NK细胞扩增结果图；

图2显示CD56+NK细胞比例变化的结果图；

图3显示利用流式细胞仪检测CD56+NK细胞百分比结果图；

图4显示NK细胞鉴定结果图，其中，A：CD7；B：CD16；C：CD33；

图5显示NK细胞转染靶向CD7的CAR后对CD7表达影响的结果图；

图6显示IL-3对CD34+细胞诱导生成CD56+细胞的影响结果图；

图7显示含有IL-2、IL-21、IL-15的活化培养基对CD56+NK细胞比例的影响结果图。

具体实施方式

下面将结合附图及实施例对本发明进行详细描述，以便于本领域技术人员理解和实施本发明，并进一步认识本发明的优点。

除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1NK细胞制备

一、步骤

1、CD34+细胞的分选

根据美天尼CD34+分选试剂盒说明书进行CD34+细胞的分选。将血袋中的脐带血转移到50ml干净的离心管中量取脐带血的体积；随后取另外几个干净的50ml离心管，每个离心管中加入25ml生理盐水以1：1的比例稀释脐带血，将脐带血用移液管加入到装有生理盐水的离心管中，并充分混合均匀。

领取几个干净的50ml离心管，向每个离心管中加入15ml淋巴细胞分离液(东方华辉，货号：25910)，随后向每个离心管中加入30ml稀释好的脐带血；将离心管以2000r/min，离心20min。

收集白膜层细胞，然后加入生理盐水以1：1比例进行稀释；将细胞以2000r/min，离心5min，弃掉上清。

用5ml红细胞裂解液裂解细胞5min，随后将细胞以2000r/min，离心5min，弃掉上清。

用5-10ml的DPBS重悬细胞计数，计算所得到的细胞数。

将细胞以300g/min，离心10min，弃掉上清，用300μl的0.5％HSA(1*10⁸个细胞)重悬细胞，随后依次加入100μl FCR阻滞剂和CD34磁珠，每加入一种东西混匀细胞一次，随后将50ml离心管放入4℃冰箱孵育30min，每隔5min混匀一次细胞。

将孵育好的细胞中加入5-10ml 0.5％HSA，将细胞以300g/min，离心10min，弃掉上清；用500μl 0.5％HSA重悬细胞，随后将细胞加入到分选柱中，分选柱需要提前用3ml0.5％HSA润洗一遍。

向分选柱中加入3ml 0.5％HSA冲洗分选柱3次；随后将分选柱从磁场中移出，将5ml 0.5％HSA加入到分选柱中，用力将柱塞推到分选柱底端，将标记的细胞冲洗下来，计数。

将细胞分选后用X-VIVO培养基重悬细胞，并把细胞铺到24孔板中，调整细胞密度为0.8-1.2*10⁵个/孔；

X-VIVO培养基：X-VIVO+IL-7(10ng/ml)+IL-15(20ng/ml)+SCF(10ng/ml)+FLt3L(10ng/ml)+5％人AB血清(GEMINI，GemCell^TM human serum AB，cat:100-512)；

0.5％HSA：1.25ml HSA+48.75ml DPBS。

2、NK细胞的诱导分化

将细胞继续培养10-14天后，将培养基换为581活化培养基继续培养1周后，将培养基换为581扩增培养基继续培养细胞，每隔2-3天采用半换液的方式进行换液。

581活化培养基：KBM581+OK432(100ng/ml)+IFN-γ(1000IU/ml)+IL-2(1000IU/ml)+IL-15(100ng/ml)+IL-21(100ng/ml)+5％人AB血清；

581扩增培养基：KBM581+IL-2(1000IU/ml)+IL-15(100ng/ml)+IL-21(100ng/ml)+5％人AB血清。

3、NK细胞鉴定

通过使用CD56 FITC抗体、CD7 PE抗体、CD33 PE-cy7抗体和CD16 APC-cy7抗体检测NK细胞表面相关maker的表达。

二、结果

1)CD56+NK细胞扩增情况

随着细胞培养天数的增加，CD56+NK细胞的数量也在逐渐的增加，将增加的细胞数量折算成细胞的扩增倍数，最终CD56+NK细胞可以扩增大约25倍，结果如图1所示。

2)CD56+NK比例变化

随着细胞培养天数的增加，通过流式细胞仪检测CD56+NK细胞的比例，并将其比例画成折线图，在培养细胞的前7天，CD56+NK细胞的比例增长比较缓慢，随后CD56+NK细胞比例逐渐上升，在培养的第28天可以达到89％，结果如图2所示。

3)CD56+NK细胞百分比统计

随着细胞培养天数的增加，通过流式细胞仪检测CD56+NK细胞的比例，并将细胞培养天数为D7、D14、D21和D28的流式检测结果展示出来，CD56+NK细胞的比例分别为：1.75％、21.17％、61.4％、90.17％，结果如图3所示。

4)NK细胞鉴定

通过流式细胞仪检测NK细胞表面相关marker的表达，如CD7、CD16、CD33的表达，在NK细胞中CD7是处于低表达水平，其所占的比例为16％，结果如图4所示。

实施例2CAR转导

一、步骤

1、构建表达靶向CD7的嵌合抗原受体的慢病毒表达载体

1)根据靶向CD7的嵌合抗原受体(CD7CAR)的氨基酸序列(如SEQ ID NO.1所示)合成相应的编码核酸序列(如SEQ ID NO.2所示)。将CD7CAR的编码核酸序列按照酶切连接的方式***到慢病毒表达载体中，构建而成的重组慢病毒表达载体的线性序列如SEQ IDNO.3所示。酶切位点：Pac I和SpeI。转化，涂板，小提测序，确认CD7CAR表达质粒构建成功。质粒大提获得无内毒素的表达质粒，以备包装慢病毒。

2、慢病毒包装

(1)293FT细胞接种(Day1上午)

按照生物安全柜使用说明，将生物安全柜紫外开启30min。

将含有10％胎牛血清的DMEM、PBS及不含EDTA-0.25％Trypsin放于37℃5％CO₂的细胞培养箱中预热30min。

将已长到80％-90％的293FT细胞培养瓶(T175)从37℃5％CO₂的细胞培养箱中取出，先用75％的酒精喷洒于瓶表面，再将细胞培养瓶放入安全柜中，用无菌真空泵抽净其中培养基，用10mL移液管加入6mL预热的PBS洗涤一次，吸尽PBS。

向T175的细胞培养瓶中加入2mL TrypLE^TM EXPRESS，让其充分平铺于细胞表面，盖好瓶盖，将其放在显微镜下观察，直至细胞变圆，加入8mL含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，用移液管将瓶壁细胞吹下，将细胞液转移至15mL无菌离心管中，1500rpm离心5min。

弃上清，加入1mL DMEM培养基，用吸管轻轻吹吸使细胞重悬分散开，取一定量细胞，稀释n倍，用血球计数板进行计数。

将部分细胞以1.3×10⁷个/150mm平皿接种，每个150mm平皿加20mL DMEM培养基，用于病毒包装；剩余细胞以0.75×10⁷个/T175瓶铺瓶，每个T175瓶加25mL DMEM培养基，用于传代。将以上细胞轻轻摇匀，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

(2)病毒包装(Day2上午)

显微镜下观察Day1所铺150mm平皿，细胞状态良好，密度达70％-80％，即可进行病毒包装。

将按照生物安全柜使用说明，将生物安全柜紫外开启30min。

将

buffer、

CD7CAR表达质粒和两种包装质粒(psPAX2和pMD2.G)恢复室温。

按每个150mm平皿1.25mL

buffer、15μg CD7CAR表达质粒、7.5μgpsPAX2、3.75μg pMD2.G的量将以上溶液混合均匀。向混合液中加入

62.5μL/150mm平皿，再次混合均匀，室温静置10min。

将用于包装病毒的293FT细胞从37℃5％CO₂的细胞培养箱中取出，先用75％的酒精喷洒于细胞培养皿表面，再放入安全柜中，将上述混合液平均分配到150mm平皿的培养基中，轻轻摇匀，放入37℃5％CO₂培养箱中。

包装4h后，弃旧培养基，加入5mL已预热的PBS清洗细胞，再加入20mL新鲜的已预热的含10％胎牛血清的DMEM培养基，放入37℃5％CO₂培养箱中。

(3)病毒收集及浓缩(Day4)

换液48h-72h收取病毒原液。将原液收集到50ml离心管中，2000rpm离心5min。

将上清留出1mL用于病毒相关检测。剩余用0.45μm滤器过滤到新的离心管中，4℃18500g高速离心2h。

尽可能将上清液弃干净，加入无血清培养基重悬病毒颗粒。加入的培养基体积：病毒原液体积＝1:500。此即为病毒浓缩液。

将病毒浓缩液按120μl/管分装，另外留取10μl进行转染率测定。将分装好的浓缩液置于-80℃冰箱保存。

3、慢病毒转染和检测

将使用贴壁细胞293FT细胞包装的慢病毒senl-7-re转染细胞。将细胞计数重新接种到24孔板中，每孔5*10⁵个细胞，使用的助转染试剂为PGE2，每加入50μl病毒，35℃，2000r/min，离心2h，离心结束后，将细胞放入到CO₂培养箱中继续培养，第二天每孔补液500μl培养基，转染后的第四天通过流式细胞仪检测CAR的表达。

二、结果

转染CD7的CAR后，NK细胞可以显著降低CD7表达，结果如图5所示。

实施例3IL-3细胞因子对CD56+NK细胞制备的影响

1、步骤

改变X-VIVO培养基：X-VIVO+IL-7(10ng/ml)+IL-15(20ng/ml)+SCF(10ng/ml)+FLt3L(10ng/ml)+IL-3(5ng/ml)+5％人AB血清。其他条件同实施例1，制备NK细胞。

2、结果

向X-VIVO培养基中加入细胞因子IL7、IL15、SCF、FLt3L、IL3也可以促进CD34+细胞向CD56+NK细胞转变，但是其促进的速度相比于向X-VIVO培养基中加入细胞因子IL7、IL15、SCF、FLt3L的速度慢，结果如图6所示。

实施例4OK432和IFN-γ对CD56+NK细胞制备的影响

1、步骤

改变581活化培养基：KBM581+IL-2(1000IU/ml)+IL-15(100ng/ml)+IL-21(100ng/ml)+5％人AB血清。

2、结果

将581活化培养基中的细胞因子替换为IL-2、IL-21、IL-15也可以促进CD34+细胞向CD56+NK细胞转变，但是其促进的速度相比于加入细胞因子OK432、IFN-γ、IL-2、IL-21、IL-15的速度慢，结果如图7所示。

序列表

<110> 河北森朗生物科技有限公司

<120> 一种低表达CD7的NK细胞制备方法

<141> 2021-03-08

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2585

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttaattaagc caccatgctg ctgctggtga ccagcctgct gctgtgcgag ctgccccacc 60

ccgcctttct gctgatcccc ggggcccagc cggccatggc ggcctacaaa gatatccaga 120

tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc atcagttgca 180

gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca gatggaactg 240

ttaaactcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg agtcccatca aggttcagtg 300

gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct gaagatattg 360

ccacttatta ttgtcagcag tatagcaagc ttccgtacac gttcggaggg gggaccaagc 420

tggaaataaa acgtggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctggcggc ggcggctccg 480

gtggtggtgg atccgaggtg caactggtgg agtctggggg aggcttagtg aagcctgggg 540

ggtccctgaa actctcctgt gcagcctctg gactcacttt cagtagctat gccatgtctt 600

gggttcgcca gactccagag aagaggctgg agtgggtcgc atccattagt agtggtggtt 660

tcacctacta tccagacagt gtgaagggcc gattcaccat ctccagagat aatgccagga 720

acatcctgta tctgcaaatg agcagtctga ggtctgagga cacggccatg tattactgtg 780

caagagacga ggtacggggg tacctcgatg tctggggcgc agggaccacg gtcaccgttt 840

cctcggcctc gggggccgaa tctaagtacg gaccgccctg ccccccttgc cctatgttct 900

gggtgctggt ggtggtcgga ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtc accgtggcct 960

tcatcatctt ttgggtgaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat 1020

ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag 1080

aagaagaagg aggatgtgaa ctgcgggtga agttcagcag aagcgccgac gcccctgcct 1140

accagcaggg ccagaatcag ctgtacaacg agctgaacct gggcagaagg gaagagtacg 1200

acgtcctgga taagcggaga ggccgggacc ctgagatggg cggcaagcct cggcggaaga 1260

acccccagga aggcctgtat aacgaactgc agaaagacaa gatggccgag gcctacagcg 1320

agatcggcat gaagggcgag cggaggcggg gcaagggcca cgacggcctg tatcagggcc 1380

tgtccaccgc caccaaggat acctacgacg ccctgcacat gcaggccctg cccccaaggc 1440

tcgagggcgg cggagagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc 1500

ccggccctag gatgcttctc ctggtgacaa gccttctgct ctgtgagtta ccacacccag 1560

cattcctcct gatcccacgc aaagtgtgta acggaatagg tattggtgaa tttaaagact 1620

cactctccat aaatgctacg aatattaaac acttcaaaaa ctgcacctcc atcagtggcg 1680

atctccacat cctgccggtg gcatttaggg gtgactcctt cacacatact cctcctctgg 1740

atccacagga actggatatt ctgaaaaccg taaaggaaat cacagggttt ttgctgattc 1800

aggcttggcc tgaaaacagg acggacctcc atgcctttga gaacctagaa atcatacgcg 1860

gcaggaccaa gcaacatggt cagttttctc ttgcagtcgt cagcctgaac ataacatcct 1920

tgggattacg ctccctcaag gagataagtg atggagatgt gataatttca ggaaacaaaa 1980

atttgtgcta tgcaaataca ataaactgga aaaaactgtt tgggacctcc ggtcagaaaa 2040

ccaaaattat aagcaacaga ggtgaaaaca gctgcaaggc cacaggccag gtctgccatg 2100

ccttgtgctc ccccgagggc tgctggggcc cggagcccag ggactgcgtc tcttgccgga 2160

atgtcagccg aggcagggaa tgcgtggaca agtgcaacct tctggagggt gagccaaggg 2220

agtttgtgga gaactctgag tgcatacagt gccacccaga gtgcctgcct caggccatga 2280

acatcacctg cacaggacgg ggaccagaca actgtatcca gtgtgcccac tacattgacg 2340

gcccccactg cgtcaagacc tgcccggcag gagtcatggg agaaaacaac accctggtct 2400

ggaagtacgc agacgccggc catgtgtgcc acctgtgcca tccaaactgc acctacggat 2460

gcactgggcc aggtcttgaa ggctgtccaa cgaatgggcc taagatcccg tccatcgcca 2520

ctgggatggt gggggccctc ctcttgctgc tggtggtggc cctggggatc ggcctcttca 2580

tgtga 2585

<210> 2

<211> 856

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gly Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Tyr Lys

20 25 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

35 40 45

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

65 70 75 80

Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro

100 105 110

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr

115 120 125

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

165 170 175

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr

180 185 190

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

195 200 205

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

210 215 220

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu

225 230 235 240

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

245 250 255

Arg Asp Glu Val Arg Gly Tyr Leu Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr

260 265 270

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

275 280 285

Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

290 295 300

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

305 310 315 320

Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

325 330 335

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

340 345 350

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

355 360 365

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

370 375 380

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

385 390 395 400

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

405 410 415

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

420 425 430

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

435 440 445

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

450 455 460

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly

465 470 475 480

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

485 490 495

Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu

500 505 510

Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile

515 520 525

Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile

530 535 540

Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu

545 550 555 560

Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp

565 570 575

Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe

580 585 590

Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe

595 600 605

Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe

610 615 620

Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser

625 630 635 640

Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn

645 650 655

Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser

660 665 670

Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys

675 680 685

Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp

690 695 700

Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly

705 710 715 720

Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu

725 730 735

Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro

740 745 750

Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile

755 760 765

Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro

770 775 780

Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp

785 790 795 800

Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys

805 810 815

Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro

820 825 830

Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val

835 840 845

Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met

850 855

<210> 3

<211> 9947

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actagtgtcg acaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt 60

aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct 120

attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 180

tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac 240

gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc aactgtcagc tcctttccgg gactttcgct 300

ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 360

ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaagct gacgtccttt 420

ccatggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc 480

ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct 540

cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg 600

cctggaattc gagctcggta cctttaagac caatgactta caaggcagct gtagatctta 660

gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg aagggctaat tcactcccaa cgaagacaag 720

atctgctttt tgcttgtact gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 780

ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag 840

tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 900

cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt catgtcatct tattattcag tatttataac 960

ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga ggaacttgtt tattgcagct tataatggtt 1020

acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 1080

gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggctctag ctatcccgcc 1140

cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg 1200

ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca 1260

gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct agggacgtac ccaattcgcc ctatagtgag 1320

tcgtattacg cgcgctcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc 1380

gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa 1440

gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atgggacgcg 1500

ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca 1560

cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc 1620

gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct 1680

ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg 1740

ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc 1800

ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg 1860

attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg 1920

aattttaaca aaatattaac gcttacaatt taggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg 1980

gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat 2040

aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc 2100

gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa 2160

cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac 2220

tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga 2280

tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag 2340

agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca 2400

cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca 2460

tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa 2520

ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc 2580

tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa 2640

cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag 2700

actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct 2760

ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac 2820

tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa 2880

ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt 2940

aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat 3000

ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 3060

agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 3120

ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 3180

tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 3240

cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 3300

ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 3360

gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 3420

ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 3480

aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 3540

cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 3600

ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 3660

gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 3720

ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc 3780

ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc 3840

gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac 3900

cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact 3960

ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc 4020

aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat 4080

ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagcg cgcaattaac cctcactaaa 4140

gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg 4200

caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg 4260

ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct 4320

gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct 4380

agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg 4440

ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt 4500

gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt 4560

gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg gaaaccagag 4620

gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg cgaggggcgg 4680

cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag agatgggtgc 4740

gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat tcggttaagg 4800

ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag ggagctagaa 4860

cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca aatactggga 4920

cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata taatacagta 4980

gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga agctttagac 5040

aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc cgctgatctt 5100

cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata aatataaagt 5160

agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag tggtgcagag 5220

agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag cagcaggaag 5280

cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat tgtctggtat 5340

agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc tgttgcaact 5400

cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa gatacctaaa 5460

ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca ccactgctgt 5520

gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaatc acacgacctg 5580

gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct taattgaaga 5640

atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata aatgggcaag 5700

tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat tcataatgat 5760

agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag tgaatagagt 5820

taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga ggggacccga 5880

caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat ccattcgatt 5940

agtgaacgga tctcgacggt atcggttaac ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta 6000

cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat agcaacagac atacaaacta aagaattaca 6060

aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttat cgatgtcgac gataagcttt gcaaagatgg 6120

ataaagtttt aaacagagag gaatctttgc agctaatgga ccttctaggt cttgaaagga 6180

gtgggaattg gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag 6240

aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac 6300

tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat 6360

ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag 6420

gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg 6480

ccttgaatta cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcggggttgg 6540

aagtgggtgg gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt 6600

tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg 6660

tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct 6720

ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt 6780

ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg 6840

gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc 6900

tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg 6960

gtcggcacca gtagcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc 7020

aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag 7080

ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag 7140

gcacctcgat tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt 7200

ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca 7260

cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa 7320

gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgat taattaagcc 7380

accatgctgc tgctggtgac cagcctgctg ctgtgcgagc tgccccaccc cgcctttctg 7440

ctgatccccg gggcccagcc ggccatggcg gcctacaaag atatccagat gacacagact 7500

acatcctccc tgtctgcctc tctgggagac agagtcacca tcagttgcag tgcaagtcag 7560

ggcattagca attatttaaa ctggtatcag cagaaaccag atggaactgt taaactcctg 7620

atctattaca catcaagttt acactcagga gtcccatcaa ggttcagtgg cagtgggtct 7680

gggacagatt attctctcac catcagcaac ctggaacctg aagatattgc cacttattat 7740

tgtcagcagt atagcaagct tccgtacacg ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa 7800

cgtggtggtg gtggttctgg tggtggtggt tctggcggcg gcggctccgg tggtggtgga 7860

tccgaggtgc aactggtgga gtctggggga ggcttagtga agcctggggg gtccctgaaa 7920

ctctcctgtg cagcctctgg actcactttc agtagctatg ccatgtcttg ggttcgccag 7980

actccagaga agaggctgga gtgggtcgca tccattagta gtggtggttt cacctactat 8040

ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagata atgccaggaa catcctgtat 8100

ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagagacgag 8160

gtacgggggt acctcgatgt ctggggcgca gggaccacgg tcaccgtttc ctcggcctcg 8220

ggggccgaat ctaagtaccc tgcccccctt gccctatgtt ctgggtgctg gtggtggtcg 8280

gaggcgtgct ggcctgctac agcctgctgg tcaccgtggc cttcatcatc ttttgggtga 8340

aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa 8400

ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg 8460

aactgcgggt gaagttcagc agaagcgccg acgcccctgc ctaccagcag ggccagaatc 8520

agctgtacaa cgagctgaac ctgggcagaa gggaagagta cgacgtcctg gataagcgga 8580

gaggccggga ccctgagatg ggcggcaagc ctcggcggaa gaacccccag gaaggcctgt 8640

ataacgaact gcagaaagac aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg 8700

agcggaggcg gggcaagggc cacgacggcc tgtatcaggg cctgtccacc gccaccaagg 8760

atacctacga cgccctgcac atgcaggccc tgcccccaag gctcgagggc ggcggagagg 8820

gcagaggaag tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct aggatgcttc 8880

tcctggtgac aagccttctg ctctgtgagt taccacaccc agcattcctc ctgatcccac 8940

gcaaagtgtg taacggaata ggtattggtg aatttaaaga ctcactctcc ataaatgcta 9000

cgaatattaa acacttcaaa aactgcacct ccatcagtgg cgatctccac atcctgccgg 9060

tggcatttag gggtgactcc ttcacacata ctcctcctct ggatccacag gaactggata 9120

ttctgaaaac cgtaaaggaa atcacagggt ttttgctgat tcaggcttgg cctgaaaaca 9180

ggacggacct ccatgccttt gagaacctag aaatcatacg cggcaggacc aagcaacatg 9240

gtcagttttc tcttgcagtc gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca 9300

aggagataag tgatggagat gtgataattt caggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata 9360

caataaactg gaaaaaactg tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca 9420

gaggtgaaaa cagctgcaag gccacaggcc aggtctgcca tgccttgtgc tcccccgagg 9480

gctgctgggg cccggagccc agggactgcg tctcttgccg gaatgtcagc cgaggcaggg 9540

aatgcgtgga caagtgcaac cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg 9600

agtgcataca gtgccaccca gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac 9660

ggggaccaga caactgtatc cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga 9720

cctgcccggc aggagtcatg ggagaaaaca acaccctggt ctggaagtac gcagacgccg 9780

gccatgtgtg ccacctgtgc catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg 9840

aaggctgtcc aacgaatggg cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc 9900

tcctcttgct gctggtggtg gccctgggga tcggcctctt catgtga 9947

Claims (22)

1.一种制备CD56+NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1）从脐带血分离单个核细胞；

2）分选获得CD34+细胞；

3）将细胞分选后用X-VIVO培养基重悬细胞，X-VIVO培养基是由X-VIVO、10ng/ml IL-7、20ng/ml IL-15、10ng/ml SCF、10ng/ml FLt3L以及5%人AB血清组成；

4) NK细胞的诱导分化，将细胞继续培养10-14天后，将培养基换为581活化培养基继续培养1周后， 将培养基换为581扩增培养基继续培养细胞，每隔2-3天采用半换液的方式进行换液；

581活化培养基是由KBM581、100ng/ml OK432、1000IU/ml IFN-γ、1000 IU/ml IL-2、100ng/ml IL-15、100ng/ml IL-21以及5%人AB血清组成；

581扩增培养基是由KBM581、1000IU/ml IL-2、100ng/ml IL-15、100 ng/ml IL-21以及5％人AB血清组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，从脐带血分离单个核细胞的步骤包括：利用生理盐水稀释脐带血，加入淋巴细胞分离液，离心收集白膜层细胞；生理盐水稀释白膜层细胞后离心弃上清；加入红细胞裂解液裂解细胞，离心弃上清；重悬细胞沉淀。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用生理盐水以1：1比例稀释脐带血。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用生理盐水以1：1比例稀释白膜层细胞。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，从脐带血分离单个核细胞的步骤包括：利用生理盐水以1：1比例稀释脐带血，加入稀释后脐带血1/2体积的淋巴细胞分离液；2000r/min，离心20min；收集白膜层细胞，然后加入生理盐水以1：1比例进行稀释；将细胞以2000r/min，离心5min，弃掉上清；用5ml红细胞裂解液裂解细胞5min，随后将细胞以2000r/min，离心5min，弃掉上清；用5-10ml的DPBS重悬细胞计数，计算所得到的细胞数。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分选CD34+细胞的步骤包括：将单个核细胞用分选缓冲液重悬，依次加入FCR阻滞剂和CD34磁珠混匀，低温孵育；孵育后的细胞中加入分选缓冲液离心弃上清；用分选缓冲液重悬后加入分选柱中；分选柱中加入分选缓冲液冲洗后，将分选缓冲液加入到分选柱中，将柱塞推到分选柱底端，将标记的细胞冲洗下来，计数。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，低温孵育是指4℃冰箱孵育30min。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，分选缓冲液是指0.5% HSA。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，分选CD34+细胞的步骤包括：将细胞以300g/min，离心10min，弃掉上清，用300μl的0.5% HSA重悬细胞，随后依次加入100μl FCR阻滞剂和CD34磁珠，每加入一种东西混匀细胞一次，随后将50ml离心管放入4℃冰箱孵育30min，每隔5min混匀一次细胞；将孵育好的细胞中加入5-10ml 0.5% HSA，将细胞以300g/min，离心10min，弃掉上清；用500μl 0.5% HSA 重悬细胞，随后将细胞加入到分选柱中，分选柱需要提前用3ml 0.5% HSA润洗一遍；向分选柱中加入3ml 0.5% HSA冲洗分选柱3次；随后将分选柱从磁场中移出，将5ml 0.5% HSA加入到分选柱中，用力将柱塞推到分选柱底端，将标记的细胞冲洗下来，计数。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将细胞分选后用X-VIVO培养基重悬细胞，并把细胞铺到24孔板中，调整细胞密度为0.8-1.2×10⁵个/孔。

11.利用权利要求1-10中任一项权利要求所述的方法制备而成的NK细胞。

12.根据权利要求11所述的NK细胞，其特征在于，所述NK细胞低表达CD7。

13.根据权利要求11所述的NK细胞，其特征在于，所述NK细胞的纯度达到80%以上。

14.一种基因修饰的NK细胞，其特征在于，所述基因修饰的NK细胞是采用权利要求11-13中任一项权利要求所述的NK细胞表达嵌合抗原受体获得的NK细胞。

15.根据权利要求14所述基因修饰的NK细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体靶向CD7。

16.根据权利要求15所述基因修饰的NK细胞，其特征在于，所述靶向CD7的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

17.根据权利要求15或16所述基因修饰的NK细胞，其特征在于，所述靶向CD7的嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

18.基因修饰的NK细胞的制备方法，其特征在于，所述基因修饰的NK细胞的制备方法包括如下步骤：

1）制备权利要求11-13中任一项权利要求所述的NK细胞；

2）对步骤1）获得的NK细胞进行基因修饰。

19.根据权利要求18所述基因修饰的NK细胞的制备方法，其特征在于，所述基因修饰包括将表达嵌合抗原受体的编码核酸序列导入经步骤1)获得的NK细胞中。

20.根据权利要求19所述基因修饰的NK细胞的制备方法，其特征在于，所述表达嵌合抗原受体的编码核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

21.一种试剂盒或药物，其特征在于，所述试剂盒或药物包括权利要求11-13中任一项权利要求所述的NK细胞或权利要求14-17中任一项权利要求所述的基因修饰的NK细胞。

22.一种应用，所述应用包括以下任一项：

1）权利要求11-13中任一项权利要求所述的NK细胞在制备治疗癌症或自身免疫性疾病的药物中的应用；

2）权利要求11-13中任一项权利要求所述的NK细胞在制备表达嵌合抗原受体的免疫细胞中的应用；

3）权利要求11-13中任一项权利要求所述的NK细胞在制备权利要求21所述的试剂盒中的应用；

4）权利要求17所述的基因修饰的NK细胞在制备治疗癌症或自身免疫性疾病的药物中的应用；

5）权利要求17所述的基因修饰的NK细胞在制备权利要求21所述的试剂盒中的应用。

Images