CN110243952A - 一种采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法 - Google Patents

一种采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品检测领域，涉及采用HPLC‑MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法，检测条件：色谱条件：C18柱；进样量10μL；流速0.5mL/min；柱温：30℃；流动相A为含有5mM三氟乙酸的高纯水，流动相B为含有5mM三氟乙酸的乙腈，进行梯度洗脱；质谱条件：电喷雾离子源；正离子扫描模式；多反应监测模式；驻留时间500ms；离子源温度：200℃；脱溶剂温度：380℃；脱溶剂气流速：500L/h；锥孔气流速50L/h；进样锥电压20V；毛细管电压：3kV；脱溶剂气和锥孔气为氮气，碰撞气体为氩气。本方法操作简便、快速、准确度高、灵敏度好。

Description

一种采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的 方法
技术领域:
本发明属于食品检测领域，具体涉及采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法
背景技术:
食品加工与贮藏过程中发生的一些化学变化，在改变食品组分的结构和功能的同时也会产生一些不可忽视的有害物质，即晚期糖基化终产物(AGEs)，这是通过美拉德反应、脂肪氧化反应或多元醇降解形成的一类稳定的产物，可见多种食品中如乳制品，油炸食品油条、麻花，洋快餐中的炸薯条、炸面包以及零食里的炸薯片、油炸饼干等。AGEs的形成与食品的原料、加工工艺、加工温度、加工时间以及贮藏条件均有密切关系。膳食AGEs大量摄入含有的食品产生致糖尿病和肾脏毒性损害的作用的，导致轻度炎症、增加氧化应激、诱发动脉粥样硬化，有关这方面的研究成为了国际上的研究热点之一。研究发现加热处理的食品中AGEs含量是未加工的食品的10～100倍，CML含量可增加高达200倍。因此CML常被看做是检测食品中含量的主要目标产物。目前，我国对食品中AGEs尚未建立相关的检测标准。
由于食品样难处理和种类繁多，结构复杂等原因，对于食品中的检测缺乏通用有效的方法，且无法确定哪些指标为潜在危害因子。目前国内外测定的方法分为仪器法和免疫化学法，前者主要有荧光光谱法和色谱分析法，后者主要是酶联免疫法。现有的检测方法对样品处理要求高，耗时长且能够测定的成分有限，不能准确检测食品中AGEs全部成分，进而对食品中AGEs做出全面准确的分析。目前，缺乏快速鉴别食品中AGEs的质量控制方法。
如何鉴别食品中具有潜在危害作用的AGEs成分以及对这些成分的质量控制，目前未有有效的研究方法和技术手段。本研究的目的和意义在于首次采用“细胞膜固相色谱技术”筛选出与细胞结合的“特异性成分”的研究思路，进一步分析食品中这些特异性的成分，建立其快速鉴别检测方法，能有效的实施食品中具有潜在危害作用的AGEs成分快速检出，实现对食品直观有效的质量控制。
本项目以“含非酶糖基化产物食品”为研究对象，构建细胞膜固相色谱筛选体系，借助HPLC-DAD、LC-MS/MS等技术分别在“含非酶糖基化产物食品”中筛查其相应特异性成分，并建立快速检测此类特异性化学成分的快速分析方法。本项目将为“含非酶糖基化产物食品”的快速鉴别分析提供重要技术储备。
发明内容:
本发明的目的是提供一种一种采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法，检测条件如下：
(1)色谱条件：Agilent ZORBAX SB C18液相色谱柱；进样量5～20μL；流速为0.2～1.0mL/min；柱温：25～35℃；流动相A为含有5mM三氟乙酸的高纯水，流动相B为含有5mM三氟乙酸的乙腈，进行梯度洗脱；
(2)质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描模式；多反应监测模式(MRM)；驻留时间400～600ms；离子源温度：180～220℃；脱溶剂温度：360～400℃；脱溶剂气流速：400～600L/h；锥孔气流速40～60L/h；进样锥电压15～25V；毛细管电压：2～4kV；脱溶剂气和锥孔气为氮气，碰撞气体为氩气。
所述的采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法，优选的检测条件如下：
(1)色谱条件：Agilent ZORBAX SB C18液相色谱柱；进样量10μL；流速为0.5mL/min；柱温：30℃；流动相A为含有5mM三氟乙酸的高纯水，流动相B为含有5mM三氟乙酸的乙腈，进行梯度洗脱；
(2)质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描模式；多反应监测模式(MRM)；驻留时间500ms；离子源温度：200℃；脱溶剂温度：380℃；脱溶剂气流速：500L/h；锥孔气流速50L/h；进样锥电压20V；毛细管电压：3kV；脱溶剂气和锥孔气为氮气，碰撞气体为氩气。
所述的采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法，色谱条件中的梯度洗脱，优选的洗脱参数如下：
0至3min，流动相A从95％线性下降至88％，流动相B由5％线性上升至12％；4至12min，流动相A保持在88％，流动相B保持在12％；13至25min，流动相A从88％线性下降至55％，流动相B由12％线性上升至45％；13至25min，流动相A从88％线性下降至55％，流动相B由12％线性上升至45％。
具体实施方式：
通过细胞膜固相体系筛查出奶粉中主要含有羧甲基赖氨酸(CML)、羧乙基赖氨酸(CEL)和吡咯素(Pyr)三种AGEs成分。本节采用HPLC-MS/MS分析法，电喷雾离子源多反应监测(MRM)模式，通过方法学论证，以期构建同步测定奶粉中CML、CEL和Pyr的定量分析方法，为奶粉中AGEs的监测和控制提供基础。
1实验材料与仪器
(1)试剂与材料：正己烷(国药集团化学试剂有限公司，批号：20160712)；乙醇(南京化学试剂股份有限公司)；双圈定性滤纸(通用电器生物科技杭州有限公司)；氢氧化钠(南京化学试剂股份有限公司，批号：170608244E)；盐酸(上海凌峰化学试剂有限公司，批号：20160319)；十水合四硼酸钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：20170615)；硼氢化钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：20170315)；氨水(南京化学试剂股份有限公司，批号：170401070J)；Strata-X-C固相萃取柱(phenomenex公司，批号：S17-001242)；实验室用水为Milli-Q超纯水；CML标准品(加拿大TRC公司，纯度98％，CAS号5746-04-3)、CEL标准品(加拿大TRC公司，纯度96％，CAS号5746-03-2)、Pyr标准品(加拿大TRC公司，纯度98％，CAS号74509-14-1)。
(2)仪器：Agilent 6495LC/MS/MS液相色谱质谱联用仪、Agilent ZORBAX SB C18(150mm×2.1mm，3.5um)液相色谱柱美国安捷伦公司；XB-80A涡旋振荡器(海门其林贝尔有限公司)；Milli-Q纯水机(美国Millipore公司)；高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；AnkeTDL-40B型低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂)；Mettler AL204十万分之一天平梅特勒-托利多仪器有限公司；AL204电子天平(美国梅特勒-托利多)
2对照品溶液的制备
分别准确称取适量CML、CEL和Pyr标准品，用超纯水溶解配成CML、CEL和Pyr浓度约为1mg/mL的标准储备溶液，置于4℃冰箱中保存；移取适量CML、CEL和Pyr标准溶液，分别配制质量浓度为10，50，100，200，400和800ng/mL的CML、CEL和Pyr混合标准溶液。
3样品处理
3.1奶粉中游离态AGEs检测样品前处理
称取1g研磨粉碎后的样品置于50mL离心管中，加入10ml正己烷，充分涡旋1min，4000r/min离心10min，弃去正己烷层，重复上述正己烷脱脂过程3次，氮吹(40℃)完全挥去正己烷。加入10mL超纯水，充分涡旋1min，然后10000r/min离心10min沉淀杂质，然后用Strata-X-C固相萃取柱除杂，首先分别用3mL甲醇和3mL水洗净和活化固相萃取柱(1mL/min)，取上述样品溶液过柱，依次用3mL水和3mL甲醇洗净杂质后(0.5mL/min)，用5mL体积分数5％氨水的甲醇溶液洗脱(0.5mL/min)。收集的洗脱液经氮吹浓缩至近干，复溶于1mL初始流动相溶液中，过0.22μm水系滤膜后，用于HPLC-MS/MS分析。
3.2酸解法测定奶粉中结合态AGEs检测样品前处理
根据Hegele和Assar等的方法对样品进行前处理，并加以改进。称取1g样品置于50mL带盖耐热试管中，加入10mL正己烷，充分涡旋1min，4000r/min离心10min，弃去正己烷层，重复上述正己烷脱脂过程3次，40℃氮吹完全挥去正己烷。脱脂后，将样品中加入10mL硼酸钠缓冲液(0.2mol/L，pH 9.2)，涡旋混匀后加入1mL硼氢化钠溶液(2mol/L，用0.1mol/L氢氧化钠配制)，混匀后4℃冰箱放置8h进行还原反应。根据Folch等方法，加入8mL三氯甲烷-甲醇(2:1，V:V)使蛋白质沉淀，于5000r/min离心10min后，弃去上清液。在沉淀物中加入8mL盐酸溶液(6mol/L)，置于110℃烘箱中，水解24h。将酸解样品取出并冷却至室温，用氮气将酸解液吹干(或真空干燥)，用超纯水再溶解后定容至50ml，然后滤纸过滤并收集滤液。分别依次用3mL甲醇和3mL水洗净和活化Strata-X-C固相萃取柱(1mL/min)，取上述样品溶液过柱，依次用3mL水和3mL甲醇洗净杂质后(0.5mL/min)，用5mL含体积分数5％氨水的甲醇溶液洗脱(0.5mL/min)，收集的洗脱液经氮吹浓缩。复溶于1mL初始流动相溶液中，过0.22μm微孔滤膜后，用于HPLC-MS/MS分析。
4 HPLC-MS/MS测定
色谱条件：Agilent ZORBAX SB C18液相色谱柱(150mm×2.1mm，3.5μm)；进样量10μL；流速为0.5mL/min；柱温：30℃；流动相A为含有5mM三氟乙酸的高纯水，流动相B为含有5mM三氟乙酸的乙腈，进行梯度洗脱，洗脱参数如表1所示：
表1梯度洗脱程序
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描模式；多反应监测模式(MRM)；驻留时间500ms；离子源温度：200℃；脱溶剂温度：380℃；脱溶剂气流速：500L/h；锥孔气流速50L/h；进样锥电压20V；毛细管电压：3kV；脱溶剂气和锥孔气为氮气，碰撞气体为氩气。
5方法学考察
5.1线性关系与检出限
在本发明色谱条件和质谱条件下系列标准溶液进样测定，以对照品进样质量浓度为横坐标(X)，对照品色谱峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得到各物质的线性回归方程，并对检出限和定量限进行验证。结果见表2，混标MRM质谱图。CML线性回归方程为Y＝75.19X+1444.57，R2＝0.9999，CEL线性回归方程为Y＝121.30X+2019.26，R2＝0.9998，Pyr线性回归方程为Y＝27.71X+458.61，R2＝0.9992。CML、CEL和Pyr的线性范围为10～800ng·mL-1，相关系数R2均在0.999以上，线性关系良好。分别以信噪比(S/N)＝3和信噪比(S/N)＝10得到仪器的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。CML、CEL检出限为1ng·mL-1，定量限为5ng·mL-1；Pyr检出限为3ng·mL-1，定量限为7ng·mL-1。表明该方法具有较高的灵敏度。
表2CML、CEL和Pyr标准曲线方程、相关系数、LOD和LOQ
5.2加标回收率与精密度
向奶粉酸解液中加入CML、CEL、Pyr标准溶液，分别设置高、中、低三个加标量，使加标量分别为50、100、200ng·mL-1。由于未加标样品含有一定量的CML、CEL、Pyr(即本底值)，因此对未加标样品和加标样品均进行HPLC-MS/MS法分析测定，加标回收率＝(实测值-本底值)/加标量×100％。结果见表3，该方法对CML的回收率为93.02％～100.95％之间，相对标准偏差(RSD)为3.62％～5.80％；对CEL的回收率为93.80％～102.62％之间，RSD为2.34～8.97％；对Pyr的回收率为92.38％～100.71％，RSD为1.41％～4.32％。可见该方法对CML、CEL和Pyr均具有良好的回收率和精密度，适合于奶粉类样品检测。
表3CML、CEL和Pyr加标回收率及相对标准偏差
6奶粉中结合态AGEs含量测定结果
采集市场上销售的三种厂家的奶粉样品，根据前期细胞膜固相筛查出的奶粉中主要AGEs成分和已经建立的HPLC-MS/MS方法，对三种不同厂家奶粉结合态中CML、CEL和Pyr含量进行检测，按照本发明提供的方法进行样品前处理，每个样品平行测定3次，结果见表4。可见，三种厂家奶粉样品CML、CEL和Pyr均有检出，几乎所有样品中Pyr含量最高，其含量范围为84.56±0.28～97.36±0.48；其次是CML，其含量范围为23.38±0.07～32.68±2.31；CEL含量最少；其含量范围为12.67±1.09～19.76±0.04。由表中数据可以看出，不同来源的奶粉样品中AGEs成分含量有所差异。奶粉的加工过程中需要进行真空干燥，不同的加热温度与加热时长会使得奶粉生产加工过程中美拉德反应的程度不同，因此晚期糖基化产物生成量不同，致使结合态中CML、CEL和Pyr含量有所不同。
表4奶粉中结合态CML、CEL和Pyr含量
7奶粉中游离态AGEs含量测定结果
按照本发明提供的方法进行样品前处理，采用已经建立的HPLC-MS/MS方法对三种不同厂家奶粉游离态CML、CEL和Pyr含量进行检测，每个样品平行测定3次，结果见表5。三种厂家奶粉样品游离态CML、CEL和Pyr含量均较低，主要由于奶粉含有大量的蛋白质，与还原糖发生美拉德反应，生成结合态的晚期糖基化产物，而游离氨基酸较少，故而检测的游离态CML、CEL和Pyr含量明显低于结合态CML、CEL和Pyr含量。
表5奶粉样品中游离态CML、CEL和Pyr含量
6小结
本节实验基于前期细胞膜固相筛查奶粉中AGEs成分实验结果和HPLC-MS/MS技术，采用电喷雾离子源多反应监测模式，构建了一种适用于奶粉样品的CML、CEL和Pyr同步检测方法。方法学验证结果表明：CML、CEL和Pyr在10～800ng·mL-1质量浓度范围内线性关系良好，相关系数R2在0.999以上；CML和CEL检出限为1.0ng·mL-1，定量限为5.0ng·mL-1，Pyr检出限为3.0ng·mL-1，定量限为7.0ng·mL-1；三个加标浓度下，加标回收率在92.38％～102.62％之间；精密度均在10％以内，表明该检测方法的准确性、重现性、稳定性较好，适于奶粉中CML、CEL和Pyr的实际检测。
通过对三种厂家的奶粉茶样品中CML、CEL和Pyr含量进行测定，结果表明：三种奶粉样品中CML、CEL和Pyr均有检出，且几乎所有样品中Pyr含量最高，其次CML含量均高于CEL含量；奶粉中结合态Pyr含量范围为84.56±0.28～97.36±0.48mg·kg-1样品；结合态CML含量范围为23.38±0.07～32.68±2.31mg·kg-1样品；结合态CEL含量范围为12.67±1.09～19.76±0.04mg·kg-1样品。奶粉样品中结合态CML、CEL和Pyr含量显著高于游离态；其次，不同厂家奶粉样品中CML、CEL和Pyr含量存在一定差异，可能与奶粉生产加工过程中真空干燥工艺条件不同有关。鉴于我国奶粉加工全过程质量安全控制需要，需进一步对我国各奶粉品种中CML、CEL和Pyr的暴露量进行监测，并探究相应的确证消减技术，为奶粉加工过程潜在危害物控制提供依据。

Claims (3)

1.一种采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法，其特征在于，检测条件如下：
(1)色谱条件：Agilent ZORBAX SB C18液相色谱柱；进样量5～20μL；流速为0.2～1.0mL/min；柱温：25～35℃；流动相A为含有5mM三氟乙酸的高纯水，流动相B为含有5mM三氟乙酸的乙腈，进行梯度洗脱；
(2)质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描模式；多反应监测模式(MRM)；驻留时间400～600ms；离子源温度：180～220℃；脱溶剂温度：360～400℃；脱溶剂气流速：400～600L/h；锥孔气流速40～60L/h；进样锥电压15～25V；毛细管电压：2～4kV；脱溶剂气和锥孔气为氮气，碰撞气体为氩气。
2.根据权利要求1所述的采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法，其特征在于，检测条件如下：
(1)色谱条件：Agilent ZORBAX SB C18液相色谱柱；进样量10μL；流速为0.5mL/min；柱温：30℃；流动相A为含有5mM三氟乙酸的高纯水，流动相B为含有5mM三氟乙酸的乙腈，进行梯度洗脱；
(2)质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描模式；多反应监测模式(MRM)；驻留时间500ms；离子源温度：200℃；脱溶剂温度：380℃；脱溶剂气流速：500L/h；锥孔气流速50L/h；进样锥电压20V；毛细管电压：3kV；脱溶剂气和锥孔气为氮气，碰撞气体为氩气。
3.根据权利要求1或2所述的采用HPLC-MS/MS法定量测定奶粉中AGEs各成分含量的方法，其特征在于，色谱条件中的梯度洗脱，洗脱参数如下：
0至3min，流动相A从95％线性下降至88％，流动相B由5％线性上升至12％；4至12min，流动相A保持在88％，流动相B保持在12％；13至25min，流动相A从88％线性下降至55％，流动相B由12％线性上升至45％；13至25min，流动相A从88％线性下降至55％，流动相B由12％线性上升至45％。
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