CN113804806A

CN113804806A - 燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法

Info

Publication number: CN113804806A
Application number: CN202111222555.7A
Authority: CN
Inventors: 范群艳; 白伟娟; 柳训才; 张晓婷; 林素琼; 李有泉
Original assignee: Xiamen Yanzhiwu Silken Food Co ltd
Current assignee: Xiamen Yanzhiwu Silken Food Co ltd
Priority date: 2021-10-20
Filing date: 2021-10-20
Publication date: 2021-12-17

Abstract

本发明公开了一种燕窝中氨基酸的超高效液相色谱‑串联质谱测定方法，属于分析检测技术领域。本发明通过利用超高效液相色谱串联质谱(LC‑MS/MS)，建立了燕窝中氨基酸的定量检测方法。通过采用酸水解联合冻干与碱水解的样品前处理方法，避免样品在水解过程中氨基酸被破坏而无法测量的问题，以及通过利用C18‑AQ色谱柱进行色谱分离和质谱检测器对燕窝中氨基酸含量进行检测，在12分钟内即可完成燕窝中多种氨基酸成分含量的分析。本发明公开的测定方法操作简单快速、准确性高、灵敏且重现性好，适用于燕窝及其他富含蛋白质食品中氨基酸含量的快速检测。

Description

燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，尤其涉及燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。

背景技术

燕窝为雨燕科(Apodidae)金丝燕属(Collocalia)中的6种金丝燕在繁殖的季节时分泌出的唾液或唾液与它的羽毛凝结筑就的巢穴。燕窝长期以来被视为一种药食同源的保健食材，养颜美容、润肺生津。燕窝即可作为食材，又可入药，富含蛋白质、氨基酸、唾液酸和无机元素等，研究表明燕窝具有抗氧化、改善免疫、延缓衰老、抗病毒、抑制血凝、调节肠道菌群等功效。

目前对氨基酸检测方法有荧光光谱法、分光光度发、毛细电泳法、近红外光谱法、化学发光法、高效液相色谱法、气相色谱与质谱联用法、液相色谱与质谱联用法、氨基酸自动分析仪等。燕窝中氨基酸检测大部分采用氨基酸自动分析仪，离子交换树脂易压缩，流动相流速的加快不与压力的增加成比例，故测定时间相对较长；氨基酸经离子交换柱分离，在柱后与水合茚三酮衍生剂混合进行反应，易造成柱后扩散比较大，峰形变宽，分辨率降低。

因此，研究出一种操作简单、方法快速、准确、重复性好、成本低的燕窝中氨基酸检测方法是本领域技术人员亟待解决的技术难题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供了一种超高效液相色谱-串联质谱联用技术检测燕窝中氨基酸的检测方法，该方法样品无需衍生、操作简单快速、准确、重复性好，适用于燕窝中氨基酸快速测定。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，具体步骤包括：

(1)燕窝样品前处理：将燕窝粉碎分成两份，一份进行酸水解、定容、稀释、冻干、溶解、定容作为酸水解待测样品；另一份进行碱水解、定容、稀释作为碱水解待测样品。

(2)将待测样品与标准物质分别进行超高效液相色谱-串联质谱联用检测分析，通过比较待测样品与标准物质的谱图(峰面积、保留时间)，判断待测样品中是否含有氨基酸，标准物质中含有相关的氨基酸标准物质。

优选的，所述超高效液相色谱-串联质谱联用的条件包括：液相色谱条件和质谱条件。

优选的，液相色谱条件包括色谱柱为C18-AQ，流速：300μL/min，柱温：40℃，以300μL/min的流速进行梯度洗脱。

优选的，质谱条件包括电喷雾离子化电离源ESI，正离子多反应监测(MRM)。

优选的，正离子多反应监测包括：接口电压：2.5kv；雾化气流量：3L/min；加热气流量：10L/min；接口温度：300℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；干燥气流量：10L/min；CID气：270kpa。

优选的，所述梯度洗脱采用流动相A和流动相B组成，其中流动相A为0.05％甲酸水溶液，流动相B为甲醇。

优选的，流动相进行梯度洗脱的洗脱程序如下：0-2.50min，流动相A、流动相B的体积百分比分别为100％、0％；3.00min-4.0min流动相A、流动相B的体积百分比分别变换为70％、30％；5.0min-10.00min流动相A、流动相B的体积百分比分别变换为0％、100％；11.0min-16.00min流动相A、流动相B的体积百分比分别变换为100％、0％。

优选的，所述酸水解处理包括如下步骤：称取燕窝样品置于安瓿瓶中加入6mol/L盐酸溶液和苯酚1-2滴，氮吹后封口，于110℃的恒温箱内水解22h后，取出，冷却至室温，将水解液转移至容量瓶中，水定容至刻度，振荡混匀，静置。移取稀释液移入试管中放入冻干燥机中进行干燥，用水进行溶解，定容容量瓶，离心取清液于进样瓶中以备进样，所述盐酸用量为3-7mL。

所述碱水解处理包括如下步骤：称取燕窝样品置于安瓿瓶中加入5mol/L氢氧化钠溶液和苯酚1-2滴混匀，氮吹后封口，于110℃的恒温箱内水解22h后，取出，冷却至室温，将水解液转移至容量瓶中，用水定容至刻度，振荡混匀，静置。移取稀释液用水定容，甲酸调pH，所述氢氧化钠用量为2-6mL。

作为一种优选实施方式，步骤(2)中，待测样品进行超高效液相色谱-串联质谱联用技术检测分析时采用自动进样器进样，进样程序包括：(1)进样体积3-5μL；(2)采用内外壁清洗进样针，清洗量为500μL；进样。

进一步的，本发明还包括绘制定量标准曲线并根据曲线计算出燕窝样品中氨基酸含量的步骤，从而可以达到检测燕窝样品中氨基酸含量的目的。所述标准物质包括如下标准物：天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)、甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)。

优选的，天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)和甲硫氨酸(Met)配制成混合标准溶液；色氨酸(Trp)单独配制成含单一标准物质的标准溶液。

与现有技术相比，本发明建立了燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，具有如下优异效果：

本发明采用了酸水解联合冻干和碱水解的样品前处理方法，避免样品在水解过程中氨基酸被破坏而无法测量的问题，以及通过利用C18-AQ色谱柱进行色谱分离和质谱检测器对燕窝中氨基酸含量进行检测，在12分钟内完成燕窝中多种氨基酸成分含量的分析，且在浓度范围4.0～270ng/mL线性良好，精密度和准确性均满足分析要求。本发明公开的测定方法操作简单快速、准确性高、灵敏且重现性好，适用于燕窝及其他富含蛋白质食品中氨基酸含量的快速检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1是本发明一个实施例的苯丙氨酸浓度与峰面积曲线图。

图2、图3本发明一个实施例的18种氨基酸超高效液相色谱-串联质谱技术联用的谱图；其中，1、赖氨酸；2、组氨酸；3、甘氨酸；4、精氨酸；5、胱氨酸；6、丝氨酸；7、天冬氨酸；8、丙氨酸；9、苏氨酸；10、谷氨酸；11、脯氨酸；12、缬氨酸；13、甲硫氨酸；14、亮氨酸；15、异亮氨酸；16、酪氨酸；17、苯丙氨酸；18、色氨酸。

图4、图5是本发明一个实施例的燕窝样品中17种氨基酸超高效液相色谱-串联质谱技术联用的谱图；其中，1、赖氨酸；2、组氨酸；3、甘氨酸；4、精氨酸；5、胱氨酸；6、丝氨酸；7、天冬氨酸；8、丙氨酸；9、苏氨酸；10、谷氨酸；11、脯氨酸；12、缬氨酸；13、甲硫氨酸；14、亮氨酸；15、异亮氨酸；16、酪氨酸；17、苯丙氨酸。

图6是本发明一个实施例的燕窝样品中色氨酸超高效液相色谱-串联质谱技术联用的谱图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明公开了一种燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，该方法操作简单快速、准确性高、灵敏且重现性好，适用于燕窝及其他富含蛋白质食品中氨基酸含量的快速检测。

为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。

实施例1

一种燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，具体步骤为：

a.酸处理及冻干前处理，包括如下步骤：

(1)称取20mg-40mg(精确至0.0001g)粉碎均匀的燕窝置于安瓿瓶中；

(2)在安瓿瓶中加入5mL 6mol/L盐酸溶液，继续向安瓿瓶中加入0.1％苯酚1滴混匀，然后将安瓿瓶放入全自动氮吹浓缩仪中，充入氮气5min，在充氮气状态下封口，将已封口的安瓿瓶放在110℃的恒温箱内，水解22h后，取出，冷却至室温；

(3)打开安瓿瓶，将水解液转移至100mL容量瓶中，用少量水多次冲洗安瓿瓶，水洗液移入同一容量瓶中，最后用水定容至刻度，振荡混匀，静置；

(4)准确移取1.00mL稀释液移入试管中，置于-40℃冷冻冰箱中预冻4h，将结冰的稀释液放入冻干燥机中进行干燥；

(5)待干燥完成，用水进行溶解，定容至25mL容量瓶，在10000rpm/min下离心10min，上清液于进样瓶中，供上机测定使用。

b.碱处理及冻干前处理，包括如下步骤：

(1)称取20mg-40mg(精确至0.0001g)粉碎均匀的燕窝置于安瓿瓶中；

(2)在安瓿瓶中加入4mL 5mol/L氢氧化钠溶液。继续向安瓿瓶中加入0.1％苯酚1滴混匀，然后将安瓿瓶放入全自动氮吹浓缩仪中，充入氮气5min,在充氮气状态下封口，将已封口的安瓿瓶放在110℃的恒温箱内，水解22h后，取出，冷却至室温；

(4)准确移取1.00mL稀释液用水定容至25mL并用甲酸调pH至中性，用0.22μm滤膜过滤后，过滤液于进样瓶中，供上机测定使用。

c.标曲配制，包括如下步骤：

(1)准确移取苯丙氨酸标准工作液548ng/mL 0.125mL、0.250mL、0.500mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL、3.00mL至10mL容量瓶中，用超纯水定容到10mL容量瓶中，配成浓度范围为6.85-164ng/mL的苯丙氨酸标准曲线工作液。取5μL进样，利用苯丙氨酸的峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程，结果见图1。

(2)以外标法定量分析。

为了进一步证明本发明的有益效果以更好地理解本发明，下面通过以下测定试验进一步阐明本发明所述燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法具有的性质及应用性能，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的其他测定实验得到的方法性质及根据上述性质进行的应用，也视为落在本发明的保护范围内

实验例1：采用本发明方法对30批次燕窝中18种氨基酸的含量进行检测

1、仪器与试剂

仪器：超超高效液相色谱-串联质谱联用仪(岛津，LCMS 8050)；冻干机(德国Christ，Alpha 2-4LSC plus)；电子天平(Sartorius，BSA224S)；全自动氮吹浓缩仪(AutoEVA-20Plus，睿科)；恒温箱(DIN 12880，德国宾得)。

试剂：甲酸、甲醇(色谱纯，美国天地)、17种氨基酸标准品(天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸，北京世纪奥科生物技术有限公司)、色氨酸标准品(美国Sigma)、盐酸、氢氧化钠(优级纯，国药集团)、苯酚(分析纯，西陇科学)。

2、标准试剂

天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸，18种标准品均为单标，纯度≥97％。

天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和色氨酸分别准确称取0.04000g、0.04128g、0.08000g、0.08000g、0.03200g、0.08800g、0.06360g、0.06536g、0.05312g、0.06256g、0.04352g、0.05080g、0.03528g、0.04208g、0.04656g、0.04872g、0.10000g和0.05480g，用超纯水溶解并定容到100mL的容量瓶中，最终浓度分别为400.0mg/L、412.8mg/L、800.0mg/L、800.0mg/L、320.0mg/L、880.0mg/L、636.0mg/L、653.6mg/L、531.2mg/L、625.6mg/L、435.2mg/L、508mg/L、352.8mg/L、420.8mg/L、465.6mg/L、487.2mg/L、548mg/L、1000.0mg/L，摇匀，4℃保存。

准确移取17种氨基酸混合标准工作液0mL、0.125mL、0.25mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL、3.00mL至10mL容量瓶中，用超纯水定容到10mL容量瓶中，配成浓度范围分别为赖氨酸：5.00-120ng/mL、胱氨酸：5.16-124ng/mL、天冬氨酸：10.0-240ng/mL、甘氨酸：10.0-240ng/mL L、组氨酸：4.00-96.0ng/mL、精氨酸：11.0-264ng/mL、丙氨酸：7.95-191ng/mL、丝氨酸：8.17-196ng/mL、苏氨酸：6.64-159ng/mL、谷氨酸：7.82-188ng/mL、脯氨酸：5.44-131ng/mL、缬氨酸：6.35-152ng/mL、甲硫氨酸：4.41-106ng/mL、亮氨酸：5.26-126ng/mL、异亮氨酸：5.82-140ng/mL、酪氨酸：6.09-146ng/mL、苯丙氨酸：6.85-164ng/mL的氨基酸标准曲线工作液。

准确移取色氨酸标准工作液0mL、0.100mL、0.200mL、0.500mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL至10mL容量瓶中，用超纯水定容到10mL容量瓶中，配成浓度范围为10.00-200ng/mL的色氨酸标准曲线工作液。

3、仪器分析条件

a.液相色谱条件

色谱柱为岛津C18-AQ，2.1×100mm，1.9μm；流速：300μL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；分析时间：16min；流动相A为0.05％甲酸溶液，流动相B为甲醇；流动相洗脱程序见表1

表1流动相洗脱程序

b.质谱条件

离子源：电喷雾离子化电离源ESI；监测方式：正离子多反应监测(MRM)；接口电压：2.5kv；雾化气流量：3L/min；加热气流量：10L/min；接口温度：300℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；干燥气流量：10L/min；CID气：270kpa。

表2氨基酸的质谱参数

4、样品处理

a.酸处理及冻干前处理，包括如下步骤：

(1)称取20mg-40mg(精确至0.0001g)粉碎均匀的燕窝置于安瓿瓶中；

b.碱处理及冻干前处理，包括如下步骤：

(1)称取20mg-40mg(精确至0.0001g)粉碎均匀的燕窝置于安瓿瓶中；

5、结果与讨论

(1)线性范围及相关系数

在设定试验条件下：赖氨酸：5.00-120ng/mL、胱氨酸：5.16-124ng/mL、天冬氨酸：10.0-240ng/mL、甘氨酸：10.0-240ng/mL L、组氨酸：4.00-96.0ng/mL、精氨酸：11.0-264ng/mL、丙氨酸：7.95-191ng/mL、丝氨酸：8.17-196ng/mL、苏氨酸：6.64-159ng/mL、谷氨酸：7.82-188ng/mL、脯氨酸：5.44-131ng/mL、缬氨酸：6.35-152ng/mL、甲硫氨酸：4.41-106ng/mL、亮氨酸：5.26-126ng/mL、异亮氨酸：5.82-140ng/mL、酪氨酸：6.09-146ng/mL、苯丙氨酸：6.85-164ng/mL和色氨酸：10.00-200ng/mL各取5μL进样，利用氨基酸的峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程，记录谱图得出18种氨基酸线性方程、相关系数，以苯丙氨酸为例，线性回归方程见图1，其线性相关系数大于0.999，其余结果见表3。采用标准溶液逐级稀释的方法确定仪器的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，分别以信噪比S/N≥3、S/N≥10时对应目标物浓度作为仪器检出限和定量限，具体结果见表3。

表3标准曲线回归方程及相关系数

(2)方法的精密度

因为燕窝中氨基酸含量高，所以采用不同的取样量考察其准确度，以梯度取样量20mg、30mg、40mg分别进行6平行精密度试验，计算精密度，RSD在0.85％～4.98％之间，具体结果见表4。

表4 18种氨基酸的精密度(n＝6)

(3)燕窝样品检测

购买收集市场上燕窝30批次，每批测定平行样品2份，测定燕窝中18种氨基酸含量。检测结果如图2、图3、图4、图5、图6，经与标准品在相同条件下所得谱图进行比较，可见30批次的燕窝中均含有18种氨基酸，根据所建立的标准曲线，计算30批次的燕窝中18种氨基酸含量，结果如表5所示，30批次的燕窝中18种氨基酸含量见表5，相对标准偏差在3.77％～14.83％之间见表6，各个批次燕窝氨基酸存在差异。

表5 30批次燕窝中18种氨基酸含量(n＝2)

表6 30批次燕窝中18种氨基酸燕窝氨基酸含量统计值(n＝2)

本发明实施案例采用酸水解联合冻干和碱水解的前处理方法对30批次燕窝中18种氨基酸进行分析。整个实验方法操作简单、快速高效、准确、灵敏且重现性好，适用于燕窝中氨基酸含量的快速检测分析。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，其特征在于，具体步骤包括：

I、绘制定量标准曲线并根据曲线计算出燕窝样品中氨基酸含量；

II、燕窝样品前处理

将燕窝粉碎分成两份，一份进行酸水解、定容、稀释、冻干、溶解、定容作为酸水解待测样品；另一份进行碱水解、定容、稀释作为碱水解待测样品；

III、将待测样品与标准物质分别进行超高效液相色谱-串联质谱联用检测分析，通过比较待测样品与标准物质的谱图，判断待测样品中是否含有氨基酸，以完成燕窝中氨基酸的含量测定。

2.根据权利要求1所述的燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，其特征在于，所述步骤I中绘制标准曲线时所用的标准物质包括如下标准物：天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)、甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)；

其中天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)和甲硫氨酸(Met)配制成混合标准溶液；色氨酸(Trp)单独配制成含单一标准物质的标准溶液。

3.根据权利要求1所述的燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-串联质谱联用的条件包括液相色谱条件和质谱条件；其中，所述液相色谱条件包括色谱柱为C18-AQ，流速为300μL/min，柱温为40℃，以300μL/min的流速进行梯度洗脱；

所述质谱条件包括电喷雾离子化电离源ESI和正离子多反应监测(MRM)。

4.根据权利要求3所述的燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，其特征在于，所述正离子多反应监测条件包括：接口电压2.5kv；雾化气流量3L/min；加热气流量10L/min；接口温度300℃；DL温度250℃；加热块温度400℃；干燥气流量10L/min；CID气270kpa。

5.根据权利要求3所述的燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，其特征在于，所述梯度洗脱采用流动相A和流动相B组成，其中流动相A为0.05％甲酸溶液，流动相B为甲醇；及流动相进行梯度洗脱的洗脱程序如下：0-2.50min，流动相A、流动相B的体积百分比分别为100％、0％；3.00min-4.0min流动相A、流动相B的体积百分比分别变换为70％、30％；5.0min-10.00min流动相A、流动相B的体积百分比分别变换为0％、100％；11.0min-16.00min流动相A、流动相B的体积百分比分别变换为100％、0％。

6.根据权利要求1所述的燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，其特征在于，所述酸水解处理步骤如下：称取燕窝样品置于安瓿瓶中加入6mol/L盐酸溶液和苯酚1-2滴，氮吹后封口，于110℃的恒温箱内水解22h后，取出，冷却至室温，将水解液转移至容量瓶中，水定容至刻度，振荡混匀，静置；移取稀释液移入试管中放入冻干燥机中进行干燥，用水进行溶解，定容容量瓶，离心取清液于进样瓶中以备进样，所述盐酸用量为3-7mL。

7.根据权利要求1所述的燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，其特征在于，所述碱水解处理步骤如下：称取燕窝样品置于安瓿瓶中加入5mol/L氢氧化钠溶液和苯酚1-2滴混匀，氮吹后封口，于110℃的恒温箱内水解22h后，取出，冷却至室温，将水解液转移至容量瓶中，用水定容至刻度，振荡混匀，静置；移取稀释液用水定容，甲酸调pH，所述氢氧化钠用量为2-6mL。

8.根据权利要求1所述的燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，其特征在于，步骤(2)中，待测样品进行超高效液相色谱-串联质谱联用技术检测分析时采用自动进样器进样，进样程序包括：(1)进样体积3-5μL；(2)采用内外壁清洗进样针，清洗量为500μL，进样。