CN112730723B - 一种超高效液相色谱-串联质谱检测血浆中22种游离氨基酸的方法 - Google Patents

一种超高效液相色谱-串联质谱检测血浆中22种游离氨基酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明采用一种超高效液相色谱‑串联质谱检测血浆中22种游离氨基酸的方法；血浆经甲酸甲醇和乙酸乙酯萃取血浆中游离氨基酸并氮气吹干，吹干样品复溶后经超高效反相色谱将氨基酸分离和串联质谱的多反应模式监测，采用一种结构类似物内标即可能够准确地完成血浆中22种游离氨基酸浓度的定量，无需繁多的同位素氨基酸内标，降低方法应用的成本；本发明具有样品前处理净化能力强、易操作、血浆处理体积小、色谱分离度高、选择性好、灵敏度高和分析时间短等优点，为血液中游离氨基酸的临床分析提供了一种可靠的检测方法。

Description

一种超高效液相色谱-串联质谱检测血浆中22种游离氨基酸 的方法
技术领域
本发明涉及血液检测技术，具体涉及一种超高效液相色谱-串联质谱同时检测血浆中22种游离氨基酸，可以快速高通量的进行样品前处理操作和高灵敏的检测人血浆中22种游离氨基酸。
背景技术
氨基酸是一类非常重要的小分子，在人体中主要功能是合成多肽、蛋白质以及转变为其他含氮的生理活性物质，尤其是组成蛋白质基本单元的20种α-氨基酸。人体内氨基酸代谢紊乱会引起一系列的代谢综合征疾病。现代医学研究认为，心血管疾病、2型糖尿病、脂质紊乱、肥胖等慢性疾病与氨基酸代谢紊乱密切相关。越来越多的代谢组学研究证据表明，癌症、神经***退行性疾病等疾病也与体内氨基酸类代谢生物标志物异常有关。因此监测血液中游离氨基酸含量可以为临床诊断提供重要依据。
目前，常用最多的氨基酸分析检测方法有氨基酸分析仪测定法、高效液相色谱法，气相色谱法，毛细管电泳法。最近几年，高特异性和高灵敏度检测工具同样在分析生物样本中小分子氨基酸含量发挥着重要的作用，如液相/气相色谱-质谱联用在代谢性疾病生物标志物的发现研究起着举足轻重的作用，提高了临床诊断的能力。目前同类专利所采用的液相色谱-串联质谱联用技术检测血液氨基酸的分析时间较长，超过15min甚至长达40min，影响检测通量，大多所采用的液相色谱法主要是与质谱仪兼容性较好的亲水相互作用色谱和反相色谱，前者分析长，对流动相配制要求高，影响因素要多；后者流动相配制简便，为大多数检测分析人员采用，但往往需要进行柱前衍生化，样品前处理流程繁琐。且所采用的各自氨基酸的同位素氨基酸标记物作为内标，其方法应用的成本较高。
发明内容
基于现有的技术存在上述之问题，本发明采用了一种超高效液相色谱-串联质谱能够高灵敏的、高通量的快速检测人血浆中22种游离氨基酸浓度，其采用了一种非衍生化的超高效反相色谱法、一种新的样品前处理去除杂质的操作流程和一种内标即可高灵敏定量的方法，具有检测时间短，检测所需血浆体积用量小、样品前处理简单、检测灵敏度高、选择性好、色谱分离度高等特点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
超高效液相色谱-串联质谱检测血浆中的22种游离氨基酸的方法，其中待检测的氨基酸包括：天冬酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、脯氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、组氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸；
(1)氨基酸标准品溶液配制为：
分别精确称取各氨基酸标准品10mg，精确加入0.1mol/L稀盐酸水溶液溶解配制成浓度为10mg/mL氨基酸标准品母液，再从氨基酸标准品母液各取适量体积混合均匀，用50％(V/V)甲醇水溶液配制得到相应浓度的氨基酸标准品工作液，并以此氨基酸标准品工作液稀释成不同的校准曲线工作浓度范围；
天冬酰胺标准品工作液浓度为180μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为45ng/mL～90μg/mL；
丝氨酸标准品工作液浓度为100μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为25ng/mL～50μg/mL；
天冬氨酸标准品工作液浓度为60μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为30ng/mL～30μg/mL；
甘氨酸标准品工作液浓度为300μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为75ng/mL～150μg/mL；
谷氨酰胺标准品工作液浓度为300μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为60ng/mL～150μg/mL；
苏氨酸标准品工作液浓度为180μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为45ng/mL～90μg/mL；
谷氨酸标准品工作液浓度为150μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为30ng/mL～75μg/mL；
半胱氨酸标准品工作液浓度为80μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为3μg/mL～40μg/mL；
丙氨酸标准品工作液浓度为200μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为80ng/mL～100μg/mL；
瓜氨酸标准品工作液浓度为150μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为30ng/mL～75μg/mL；
脯氨酸标准品工作液浓度为100μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为25ng/mL～50μg/mL；
缬氨酸标准品工作液浓度为100μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为25ng/mL～50μg/mL；
鸟氨酸标准品工作液浓度为120μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为30ng/mL～60μg/mL；
组氨酸标准品工作液浓度为200μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为50ng/mL～100μg/mL；
蛋氨酸标准品工作液浓度为80μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为800ng/mL～40μg/mL；
赖氨酸标准品工作液浓度为120μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为30ng/mL～60μg/mL；
酪氨酸标准品工作液浓度为200μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为50ng/mL～100μg/mL；
精氨酸标准品工作液浓度为60μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为15ng/mL～30μg/mL；
异亮氨酸标准品工作液浓度为75μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为25ng/mL～37.5μg/mL；
亮氨酸标准品工作液浓度为75μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为25ng/mL～37.5μg/mL；
苯丙氨酸标准品工作液浓度为60μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为30ng/mL～30μg/mL；
色氨酸标准品工作液浓度为60μg/mL，其校准曲线工作浓度范围为15ng/mL～30μg/mL；各氨基酸标准品工作液，按照校准曲线工作浓度范围稀释为6～12个浓度梯度；
(2)内标标准品溶液配制为：
精确称取内标标准品10mg，精确加入纯甲醇溶液溶解配制成浓度为10mg/mL内标标准品母液，再把内标标准品溶液用纯甲醇溶液稀释成浓度为10μg/mL的内标标准品工作液；
内标标准品为2-氯-苯丙氨酸；
(3)样品前处理方法为：
取人血浆10μL，加入内标溶液10μL(内标溶液为含10μg/mL的2-氯-苯丙氨酸的甲醇溶液)，再依次加入含0.1％(V/V)甲酸的甲醇溶液20μL和乙酸乙酯溶液40μL，漩涡振荡60～120s，于-20℃静置10～15min，在4℃离心温度下16000×g离心力离心10～15min，取60μL上清液于氮吹仪室温吹干，用500μL流动相A溶液复溶，漩涡振荡60～120s，超声5～10s，再4℃离心温度下16000×g离心力离心10～15min，取100μL上清液转移至进样小瓶，用于超高效液相色谱-串联质谱检测；
(4)上述方法中，超高效液相色谱条件为：
色谱柱：ACE 3C18-PFP，150×2.1mm id，3μm；
流动相A：含2.5％(V/V)乙酸、0.05％(V/V)甲酸和0.2％(V/V)七氟丁酸的水溶液；
流动相B：纯甲醇溶液；
柱温箱：40℃；
进样箱：6℃；
流速：0.3mL/min；
进样体积：5μL；
洗针液：50％(V/V)甲醇水溶液；
洗脱方式：梯度洗脱；
所述洗脱程序为：
Figure BDA0002873524740000031
Figure BDA0002873524740000041
(5)上述方法中，串联质谱检测条件为：
离子源：电喷雾离子源ESI源；
极性模式：正离子模式；
监测模式：多反应监测模式MRM；
雾化帘气压CUR：35psi；
离子化电压IS：5500V；
碰撞室强度CAD：medium；
雾化温度TEM：550℃；
辅助气压GS1：55psi；
辅助气压GS2：55psi；
由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：
本发明建立了一种超高效液相色谱-串联质谱可同时检测血浆中的22种游离氨基酸的方法，通过一种内标即可能够精准地完成血浆氨基酸浓度的定量，无需繁多的同位素氨基酸标记物，减少了方法运行的成本。
本发明采用了一种新的样品前处理方法，按照样本:甲酸甲醇:乙酸乙酯＝1:2:2～6(V/V/V)可很好的去除血浆中蛋白质等物质干扰，提高检测灵敏度，且样品前处理方法操作简便，处理体积小，检测分析时间短，可提高样品前处理的样品通量和检测分析通量。
本发明采用一级和二级质谱扫描的MRM模式监测，获取母离子Q1和子离子Q3的质谱信号，并以各氨基酸和内标的Q1/Q3的离子对的色谱峰面积比和浓度比进行定量，以及采用了一种独特的流动相组分，极大地提高了质谱检测方法地精密度、准确度和线性，其线性相关系数均大于0.99，为血液中游离氨基酸检测分析提供了一种可靠的分析检测方法。
附图说明
图1是典型的氨基酸标准品混标的总离子流色谱图；
图2是典型的血浆样本的总离子流色谱图；
图3是天冬酰胺定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图4是丝氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图5是天冬氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图6是甘氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图7是谷氨酰胺定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图8是苏氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图9是谷氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图10是半胱氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图11是丙氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图12是瓜氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图13是脯氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图14是缬氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图15是鸟氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图16是组氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图17是蛋氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图18是赖氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图19是酪氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图20是精氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图21是异亮氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图22是亮氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图23是苯丙氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图24是色氨酸定量离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
图25是内标定性离子对Q1/Q3色谱图，(a)为氨基酸标准品混标，(b)为血浆样本；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明。
实施例：
1、仪器和试剂
超高效液相色谱-串联质谱仪：EXionLC AD UPLC-QTRAP5500，美国AB SCIEX公司；低温高速离心机：Eppendorf 5415R，德国Eppendorf公司；氮吹仪：YN-D03-012，上海安谱实验科技股份有限公司；超纯水仪：MilH-QBiocel型，美国Millipore公司；漩涡振荡器：MX-S，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司；精密电子天平：MM-A-018，瑞士METTLER TOLEDO公司；超声波清洗机：SB-5200DTD，宁波新芝生物科技股份有限公司；移液器：10μL、50μL、100μL、200μL和1000μL移液器，德国Eppendorf公司；
22种氨基酸标准品(天冬酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、脯氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、组氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)、内标标准品(2-氯-苯丙氨酸)、甲酸(HPLC级)、乙酸(HPLC级)、七氟丁酸(HPLC级)、浓盐酸(优级纯)、甲醇(HPLC级)、乙酸乙酯(HPLC级)均购自美国Sigma公司；
2、标准品溶液配制
分别精确称取各氨基酸标准品10mg，精确加入0.1mol/L稀盐酸水溶液溶解配制成浓度为10mg/mL氨基酸标准品母液，再从氨基酸标准品母液各取适量体积混合均匀，用50％(V/V)甲醇水溶液配制得到相应浓度的氨基酸标准品工作液，并以此氨基酸标准品工作液稀释成不同的校准曲线工作浓度范围，各氨基酸标准品工作液和校准曲线工作浓度范围如下；
表1各氨基酸标准品工作液和校准曲线工作浓度范围
氨基酸标准品 工作液浓度 校准曲线工作浓度范围
天冬酰胺 180μg/mL 45ng/mL～90μg/mL
丝氨酸 100μg/mL 25ng/mL～50μg/mL
天冬氨酸 60μg/mL 30ng/mL～30μg/mL
甘氨酸 300μg/mL 75ng/mL～150μg/mL
谷氨酰胺 300μg/mL 60ng/mL～150μg/mL
苏氨酸 180μg/mL 45ng/mL～90μg/mL
谷氨酸 150μg/mL 30ng/mL～75μg/mL
半胱氨酸 80μg/mL 3μg/mL～40μg/mL
丙氨酸 200μg/mL 80ng/mL～100μg/mL
瓜氨酸 150μg/mL 30ng/mL～75μg/mL
脯氨酸 100μg/mL 25ng/mL～50μg/mL
缬氨酸 100μg/mL 25ng/mL～50μg/mL
鸟氨酸 120μg/mL 30ng/mL～60μg/mL
组氨酸 200μg/mL 50ng/mL～100μg/mL
蛋氨酸 80μg/mL 800ng/mL～40μg/mL
赖氨酸 120μg/mL 30ng/mL～60μg/mL
酪氨酸 200μg/mL 50ng/mL～100μg/mL
精氨酸 60μg/mL 15ng/mL～30μg/mL
异亮氨酸 75μg/mL 25ng/mL～37.5μg/mL
亮氨酸 75μg/mL 25ng/mL～37.5μg/mL
苯丙氨酸 60μg/mL 30ng/mL～30μg/mL
色氨酸 60μg/mL 15ng/mL～30μg/mL
精确称取内标标准品(2-氯-苯丙氨酸)10mg，精确加入纯甲醇溶液溶解配制成浓度为10mg/mL内标标准品母液，再把内标标准品溶液用纯甲醇溶液稀释成浓度为10μg/mL的内标标准品工作液；
所述的各氨基酸标准品工作液，按照校准曲线工作浓度范围稀释为10个浓度梯度；
3、血浆样品的前处理：
取人血浆10μL，加入内标溶液10μL(内标溶液为含10μg/mL的2-氯-苯丙氨酸的甲醇溶液)，再依次加入含0.1％(V/V)甲酸的甲醇溶液20μL和乙酸乙酯溶液40μL，漩涡振荡90s，于-20℃静置10min，在4℃离心温度下16000×g离心力离心15min，取60μL上清液于氮吹仪室温吹干，用500μL流动相A溶液复溶，漩涡振荡90s，超声10s，再4℃离心温度下16000×g离心力离心15min，取100μL上清液转移至进样小瓶，用于超高效液相色谱-串联质谱检测；4、超高效液相色谱条件
色谱柱：ACE 3C18-PFP，150×2.1mm id，3μm；
流动相A：含2.5％(V/V)乙酸、0.05％(V/V)甲酸和0.2％(V/V)七氟丁酸的水溶液；
流动相B：纯甲醇溶液；
柱温箱：40℃；
进样箱：6℃；
流速：0.3mL/min；
进样体积：5μL；
洗针液：50％(V/V)甲醇水溶液；
洗脱方式：梯度洗脱；
所述洗脱程序为：
时间(min) A(％，V/V) B(％，V/V)
0 92 8
1 92 8
11 35 65
11.5 1 99
12.8 1 99
12.9 92 8
15 92 8
5、串联质谱检测条件
离子源：电喷雾离子源ESI源；
极性模式：正离子模式；
监测模式：多反应监测模式MRM；
雾化帘气压CUR：35psi；
离子化电压IS：5500V；
碰撞室强度CAD：medium；
雾化温度TEM：550℃；
辅助气压GS1：55psi；
辅助气压GS2：55psi；
同时检测目标氨基酸离子对以及内标离子对Q1/Q3，MRM监测参数包括：各离子对及其对应的驻留时间(Time)、保留时间(RT)、去簇电压(DP)、引入电压(EP)、碰撞电压(CE)和碰撞池出口电压(CXP)，MRM监测参数如下；
表2 MRM监测参数
Figure BDA0002873524740000081
Figure BDA0002873524740000091
下面对本实施例的检测结果作进一步的分析，以验证本发明专利提供的方法可行性：采用内标定量法制作校准曲线，以氨基酸标准品浓度与内标浓度之比为X轴，氨基酸标准品的色谱峰面积与内标的色谱峰面积比为Y轴，建立校准曲线。根据该校准曲线计算血浆中各氨基酸的浓度。以定量离子对MRM色谱峰的信噪比大于10为检测限，信噪比大于20为定量限，各氨基酸的校准曲线结果如下：
表3各氨基酸的校准曲线结果
氨基酸 线性方程 相关系数 线性范围 检测限 定量限
天冬酰胺 Y＝1.61271X+0.00401 0.99740 45ng/mL～90μg/mL 22ng/mL 45ng/mL
丝氨酸 Y＝3.46975X+0.00662 0.99616 25ng/mL～50μg/mL 12ng/mL 25ng/mL
天冬氨酸 Y＝1.79844X+0.03067 0.99552 30ng/mL～30μg/mL 15ng/mL 30ng/mL
甘氨酸 Y＝0.31989X+0.00286 0.99671 75ng/mL～150μg/mL 38ng/mL 75ng/mL
谷氨酰胺 Y＝2.62277X+0.00236 0.99530 60ng/mL～150μg/mL 30ng/mL 60ng/mL
苏氨酸 Y＝4.36933X+0.01430 0.99649 45ng/mL～90μg/mL 22ng/mL 45ng/mL
谷氨酸 Y＝3.35163X+0.01014 0.99708 30ng/mL～75μg/mL 15ng/mL 30ng/mL
半胱氨酸 Y＝1.22830X+0.50243 0.99028 3μg/mL～40μg/mL 1.5μg/mL 3μg/mL
丙氨酸 Y＝2.10455X+0.06767 0.99538 80ng/mL～100μg/mL 40ng/mL 80ng/mL
瓜氨酸 Y＝4.46587X+0.00683 0.99683 30ng/mL～75μg/mL 15ng/mL 30ng/mL
脯氨酸 Y＝13.87306X+0.00838 0.99385 25ng/mL～50μg/mL 12ng/mL 25ng/mL
缬氨酸 Y＝12.38494X+0.02148 0.99575 25ng/mL～50μg/mL 12ng/mL 25ng/mL
鸟氨酸 Y＝5.37030X+0.00113 0.99607 30ng/mL～60μg/mL 15ng/mL 30ng/mL
组氨酸 Y＝7.59807X–1.31512e-6 0.99735 50ng/mL～100μg/mL 25ng/mL 50ng/mL
蛋氨酸 Y＝3.32865X–0.11485 0.99552 800ng/mL～40μg/mL 400ng/mL 800ng/mL
赖氨酸 Y＝6.16537X+9.82585e-4 0.99556 30ng/mL～60μg/mL 15ng/mL 30ng/mL
酪氨酸 Y＝3.03231X+0.00255 0.99625 50ng/mL～100μg/mL 25ng/mL 50ng/mL
精氨酸 Y＝7.19642X–0.00185 0.99498 15ng/mL～30μg/mL 8ng/mL 15ng/mL
异亮氨酸 Y＝15.63037X+0.01037 0.99508 25ng/mL～37.5μg/mL 12ng/mL 25ng/mL
亮氨酸 Y＝14.21678X+0.04655 0.99568 25ng/mL～37.5μg/mL 12ng/mL 25ng/mL
苯丙氨酸 Y＝13.37987X+0.05052 0.99642 30ng/mL～30μg/mL 15ng/mL 30ng/mL
色氨酸 Y＝8.33792X+0.00406 0.99645 15ng/mL～30μg/mL 8ng/mL 15ng/mL
22种氨基酸在各自浓度线性范围内呈良好的线性关系，满足定量要求，且能快速、方便、稳定和准确地定量检测血浆中的氨基酸。
本发明采用了一种全新的血浆样品前处理去除杂质的方法，按照样本:甲酸甲醇:乙酸乙酯＝1:2:4(V/V/V)可很好的去除血浆中蛋白质等物质干扰，提高检测灵敏度，且样品前处理方法操作简便，处理体积小，检测分析时间短，可提高样品前处理的样品通量和检测分析通量，非常适合96孔板规模化处理；
本发明建立了一种超高效液相色谱-串联质谱可同时检测血浆中的22种游离氨基酸的方法，采用了一种独特的色谱条件，包括流动相组分和比例，色谱柱以及色谱程序，通过一种内标即可能够精准地完成血浆氨基酸浓度的定量，无需繁多的同位素氨基酸标记物，减少了方法运行的成本，并极大地提高了质谱检测方法地精密度、准确度和线性，为血液中游离氨基酸检测分析提供了一种可靠的分析检测方法。
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种超高效液相色谱-串联质谱检测血浆中22种游离氨基酸的方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一：取人血浆样品，加入内标溶液，再加入甲酸甲醇/乙酸乙酯混合溶液，震荡后静置、离心；
步骤二：取上清液于氮吹仪吹干，再用流动相A溶液复溶，震荡后超声、离心，取上清液进行超高效液相色谱-串联质谱检测；
22种游离氨基酸包括天冬酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、脯氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、组氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸；
步骤一中，内标溶液为含10μg/mL的2-氯-苯丙氨酸的甲醇溶液；
步骤一中，人血浆样本、甲酸甲醇、乙酸乙酯的体积比为1:2:2~6；
步骤二中，超高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱：ACE 3C18-PFP，150×2.1mm id，3μm；柱温箱：40℃；进样箱：6℃；流速：0.3mL/min；进样体积：5μL；洗针液：50%体积浓度的甲醇水溶液；洗脱方式：梯度洗脱；
梯度洗脱的洗脱程序为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
流动相A：含2.5%体积浓度乙酸、0.05%体积浓度甲酸和0.2%体积浓度七氟丁酸的水溶液；流动相B：甲醇溶液；
串联质谱检测条件为：离子源：电喷雾离子源ESI源；极性模式：正离子模式；监测模式：多反应监测模式MRM；雾化帘气压CUR：35psi；离子化电压IS：5500V；碰撞室强度CAD：medium；雾化温度TEM：550℃；辅助气压GS1：55psi；辅助气压GS2：55psi。
2.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱-串联质谱检测血浆中22种游离氨基酸的方法，其特征在于：步骤一中，内标溶液的体积为10μL。
3.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱-串联质谱检测血浆中22种游离氨基酸的方法，其特征在于，步骤一中，震荡后静置、离心的步骤如下：漩涡震荡60~120s后，于-20℃静置10~15min，并在4℃下离心10~15min。
4.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱-串联质谱检测血浆中22种游离氨基酸的方法，其特征在于，步骤二中，震荡后超声、离心的步骤如下：漩涡振荡60~120s后，超声5~10s，并在4℃下离心10~15min。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种超高效液相色谱-串联质谱检测血浆中22种游离氨基酸的方法，其特征在于，步骤如下，
（1）氨基酸标准品溶液配制：
分别称取各氨基酸标准品10mg，加入0.1mol/L稀盐酸水溶液配制成浓度为10mg/mL氨基酸标准品母液，再加入50%体积浓度甲醇水配制得氨基酸标准品工作液；
（2）内标标准品溶液配制为：
称取内标标准品10mg，加入甲醇溶液配制成浓度为10mg/mL内标标准品母液，再加入甲醇溶液稀释成浓度为10μg/mL的内标标准品工作液；
（3）血浆样品的前处理：
取人血浆10μL，加入内标溶液10μL，再依次加入含0.1%体积浓度甲酸的甲醇溶液20μL和乙酸乙酯溶液40μL，震荡后静置、离心，取60μL上清液于氮吹仪吹干，用500μL流动相A溶液复溶，震荡后超声、离心，取100μL上清液进行高效液相色谱-串联质谱检测。
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Denomination of invention: A method for detecting 22 free amino acids in plasma using ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

Granted publication date: 20221104

Pledgee: Bank of China Limited Nanjing Jiangbei New Area Branch

Pledgor: Shenyou Genomics Research Institute (Nanjing) Co.,Ltd.

Registration number: Y2024980011460