CN113684152A - 一种细菌保藏培养基及其制备方法 - Google Patents

一种细菌保藏培养基及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及菌种保藏技术领域，具体是指一种细菌保藏培养基及其制备方法。该培养基，包括如下组分：以1000ml计，含有：牛肉浸膏8‑13g、蛋白胨2‑6g、胆盐0.2‑0.5g、硫酸铝钾0.2‑0.3g、麦芽浸粉2‑5g、酵母浸出粉3‑7g、氯化钠0.3‑0.6g、琼脂5‑10g、可溶性铁盐0.2‑0.5g、补钙剂0.01‑0.05g、D‑环丝氨酸0.02‑0.05g、毛子草酮0.001‑0.004g、维生素K10.01‑0.02g、络蛋白磷酸肽0.1‑0.3g、葡萄糖3‑5g、硝酸镧1‑2.5g、赤藓醇3‑5g、甘油18‑23ml、华法林钠片0.1‑0.2mg、异烟肼8‑12mg、无菌脱纤维绵羊血75‑85ml。本发明配方营养物质丰富、全面，能保证菌种存活，即使保藏环境温度出现较大变化，本发明培养基依然能够保证菌种的有效性。

Description

一种细菌保藏培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及菌种保藏技术领域，具体是指一种细菌保藏培养基及其制备方法。
背景技术
细菌是主要的生物资源之一，在医学实验中使用频繁。一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低菌体性能，能长期在生产中应用。菌种保藏方法有很多，冷冻保存是解决种质退化和防止自然积累性突变的一种有效途径，但传统的低温保存需要昂贵的程序降温仪器，步骤繁琐。完全玻璃化是低温保存的一种新方法，即在高浓度保护剂下，细胞连同保护剂于快速降温中都进入玻璃化状态，避免胞内冰晶形成，使器官和组织各部分都进入相同的状态，比其它低温保存方法具有设备简单、程序简单和冻存效果好等优点，在保存组织的结构完整性方面具有独到之处。
现有技术中细菌保藏培养基琼脂使用量大，对于菌种的限制效果较差，保存之后菌种活性降低，并不利于菌种的长期保存。
发明内容
基于以上问题，本发明提供了一种细菌保藏培养基及其制作方法，以提高菌种保藏中的活性。具体技术方案如下：
一种细菌保藏培养基，包括如下组分：
以1000ml计，含有：牛肉浸膏8-13g、蛋白胨2-6g、胆盐0.2-0.5g、硫酸铝钾0.2-0.3g、麦芽浸粉2-5g、酵母浸出粉3-7g、氯化钠0.3-0.6g、琼脂5-10g、可溶性铁盐0.2-0.5g、补钙剂0.01-0.05g、D-环丝氨酸0.02-0.05g、毛子草酮0.001-0.004g、维生素K10.01-0.02g、络蛋白磷酸肽0.1-0.3g、葡萄糖3-5g、硝酸镧1-2.5g、赤藓醇3-5g、甘油18-23ml、华法林钠片0.1-0.2mg、异烟肼8-12mg、无菌脱纤维绵羊血75-85ml。
优选的，所述细菌保藏培养基，包括如下组分：
以1000ml计：牛肉浸膏10g、蛋白胨5g、胆盐0.3g、硫酸铝钾0.25g、麦芽浸粉4g、酵母浸出粉5g、氯化钠0.5g、琼脂8g、构椽酸铁按0.3g、乳酸钙0.03g、D-环丝氨酸0.03g、毛子草酮0.003g、维生素K10.01g、络蛋白磷酸肽0.1g、葡萄糖5g、硝酸镧2g、赤藓醇4g、甘油20ml、华法林钠片0.1mg、异烟肼10mg、无菌脱纤维绵羊血80ml,蒸馏水加至1000ml。
具体的，所述可溶性铁盐为枸橼酸铁铵。
具体的，所述补钙剂为乳酸钙。
本发明所述细菌保藏培养基，制备方法如下：
(1)按照原料配比，取牛肉浸膏、蛋白胨、胆盐、硫酸铝钾、麦芽浸粉、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂、可溶性铁盐、补钙剂、D-环丝氨酸、毛子草酮、维生素K1、络蛋白磷酸肽、葡萄糖、硝酸镧、赤藓醇、甘油、华法林钠片、异烟肼、无菌脱纤维绵羊血备用；
(2)将牛肉浸膏、蛋白胨、胆盐、硫酸铝钾、麦芽浸粉、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂混合均匀，倒入可溶性铁盐、补钙剂、D-环丝氨酸、毛子草酮、维生素K1、络蛋白磷酸肽、葡萄糖、硝酸镧、赤藓醇、甘油、华法林钠片、异烟肼、无菌脱纤维绵羊血，加蒸馏水到1000ml,加热到50-60℃使得所有物质溶解；
(3)将上述溶液灭菌，分装于培养器皿中冷藏备用。
具体的，所述灭菌条件为温度130-150℃、时间3-5h。
具体的，所述培养器皿为试管或培养皿中的任意一种。
具体的，所述冷藏温度为2-4℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明配方含有蛋白胨、胆盐、硫酸铝钾、麦芽浸粉、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂、构椽酸铁氨、乳酸钙、D-环丝氨酸、毛子草酮、维生素、络蛋白磷酸肽、葡萄糖、硝酸镧、赤藓醇、甘油、蒸馏水，其营养物质丰富、全面。含有的构椽酸铁按、乳酸钙、络蛋白磷酸肽、葡萄糖、维生素、硝酸镧等成分能保证菌种存活。其中胆盐、D-环丝氨酸、毛子草酮等物质，具有抑制细菌生长的作用，有利于细菌长期存活。华法林钠片、异烟肼可以降低细菌新陈代谢，抑制细菌生长。赤藓醇、甘油等物质，具有保湿作用，满足培养基水份充足。琼脂粉含量少，是培养基为半固体，利于细菌保存。利用本发明培养基保藏细菌,细菌生长周期缓慢，杂菌不能生长，又能保持细菌活性不易死亡，即使保藏环境出现较大变化，本发明培养基依然能够保证菌种的有效性。本发明培养基制作设备简单、成本低，有很高的实用价值。
具体实施方式
实施例1：
一种细菌保藏培养基，包括如下组分：
以1000ml计，含有：牛肉浸膏8g、蛋白胨2g、胆盐0.2g、硫酸铝钾0.2g、麦芽浸粉2g、酵母浸出粉3g、氯化钠0.3g、琼脂5g、可溶性铁盐0.2g、补钙剂0.01g、D-环丝氨酸0.02g、毛子草酮0.001g、维生素K10.01g、络蛋白磷酸肽0.1g、葡萄糖3g、硝酸镧1g、赤藓醇3g、甘油18ml、华法林钠片0.1mg、异烟肼8mg、无菌脱纤维绵羊血75ml；所述可溶性铁盐为枸橼酸铁铵；所述补钙剂为乳酸钙。
本实施例所述细菌保藏培养基，制备方法如下：
(1)按照原料配比，取牛肉浸膏、蛋白胨、胆盐、硫酸铝钾、麦芽浸粉、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂、可溶性铁盐、补钙剂、D-环丝氨酸、毛子草酮、维生素K1、络蛋白磷酸肽、葡萄糖、硝酸镧、赤藓醇、甘油、华法林钠片、异烟肼、无菌脱纤维绵羊血备用；
(2)将牛肉浸膏、蛋白胨、胆盐、硫酸铝钾、麦芽浸粉、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂混合均匀，倒入可溶性铁盐、补钙剂、D-环丝氨酸、毛子草酮、维生素K1、络蛋白磷酸肽、葡萄糖、硝酸镧、赤藓醇、甘油、华法林钠片、异烟肼、无菌脱纤维绵羊血，加蒸馏水到1000ml,加热到50℃使得所有物质溶解；
(3)将上述溶液灭菌，分装于培养器皿中冷藏备用；所述灭菌条件为温度130℃、时间3h；所述培养器皿为试管；所述冷藏温度为2℃。
实施例2
一种细菌保藏培养基，包括如下组分：
以1000ml计：牛肉浸膏10g、蛋白胨5g、胆盐0.3g、硫酸铝钾0.25g、麦芽浸粉4g、酵母浸出粉5g、氯化钠0.5g、琼脂8g、构椽酸铁按0.3g、乳酸钙0.03g、D-环丝氨酸0.03g、毛子草酮0.003g、维生素K10.01g、络蛋白磷酸肽0.1g、葡萄糖5g、硝酸镧2g、赤藓醇4g、甘油20ml、华法林钠片0.1mg、异烟肼10mg、无菌脱纤维绵羊血80ml,蒸馏水加至1000ml。
本实施例所述细菌保藏培养基，制备方法如下：
(1)按照原料配比，取牛肉浸膏、蛋白胨、胆盐、硫酸铝钾、麦芽浸粉、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂、可溶性铁盐、补钙剂、D-环丝氨酸、毛子草酮、维生素K1、络蛋白磷酸肽、葡萄糖、硝酸镧、赤藓醇、甘油、华法林钠片、异烟肼、无菌脱纤维绵羊血备用；
(2)将牛肉浸膏、蛋白胨、胆盐、硫酸铝钾、麦芽浸粉、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂混合均匀，倒入可溶性铁盐、补钙剂、D-环丝氨酸、毛子草酮、维生素K1、络蛋白磷酸肽、葡萄糖、硝酸镧、赤藓醇、甘油、华法林钠片、异烟肼、无菌脱纤维绵羊血，加蒸馏水到1000ml,加热到55℃使得所有物质溶解；
(3)将上述溶液灭菌，分装于培养器皿中冷藏备用；所述灭菌条件为温度140℃、时间4h；所述培养器皿为试管；所述冷藏温度为3℃。
实施例3
一种细菌保藏培养基，包括如下组分：
以1000ml计，含有：牛肉浸膏13g、蛋白胨6g、胆盐0.5g、硫酸铝钾0.3g、麦芽浸粉5g、酵母浸出粉7g、氯化钠0.6g、琼脂10g、可溶性铁盐0.5g、补钙剂0.05g、D-环丝氨酸0.05g、毛子草酮0.004g、维生素K10.02g、络蛋白磷酸肽0.3g、葡萄糖5g、硝酸镧2.5g、赤藓醇5g、甘油23ml、华法林钠片0.2mg、异烟肼12mg、无菌脱纤维绵羊血85ml；所述可溶性铁盐为枸橼酸铁铵；所述补钙剂为乳酸钙。
本实施例所述细菌保藏培养基，制备方法如下：
(1)按照原料配比，取牛肉浸膏、蛋白胨、胆盐、硫酸铝钾、麦芽浸粉、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂、可溶性铁盐、补钙剂、D-环丝氨酸、毛子草酮、维生素K1、络蛋白磷酸肽、葡萄糖、硝酸镧、赤藓醇、甘油、华法林钠片、异烟肼、无菌脱纤维绵羊血备用；
(2)将牛肉浸膏、蛋白胨、胆盐、硫酸铝钾、麦芽浸粉、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂混合均匀，倒入可溶性铁盐、补钙剂、D-环丝氨酸、毛子草酮、维生素K1、络蛋白磷酸肽、葡萄糖、硝酸镧、赤藓醇、甘油、华法林钠片、异烟肼、无菌脱纤维绵羊血，加蒸馏水到1000ml,加热到60℃使得所有物质溶解；
(3)将上述溶液灭菌，分装于培养器皿中冷藏备用；所述灭菌条件为温度150℃、时间5h；所述培养器皿为培养皿；所述冷藏温度为4℃。
为了验证本发明方案，设置如下对比例：
对比例1 与实施例1的区别是制作原料中未使用毛子草酮；
对比例2 与实施例1的区别是制作原料中未使用枸橼酸铁铵；
对比例3 与实施例1的区别是制作原料中未使用硝酸镧；
对比例4 与实施例1的区别是制作原料中未使用D-环丝氨酸；
对比例5 与实施例1的区别是制作原料中未使用异烟肼。
试验例
分别按照实施例1-3、对比例1-5制作培养基，在无菌环境下，将培养基倒入培养皿中，每个培养皿加入2ml菌液，放入零下50℃的冰箱中保存；测试菌种分别为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌，每种细菌接种后的培养皿独立保藏，保藏5个月、10个月后进行复苏，统计细菌的活性。
复活菌种时选用35℃的热水进行水浴加热解冻，选择各菌种最适培养基培养，统计复活数量。
试验结果如下表所示。
Figure BDA0003236184920000041
Figure BDA0003236184920000051
由表可以看出，使用本发明的细菌保藏培养基的实施例1-3细菌保藏效果极好，五个月以内金黄葡萄球菌、大肠杆菌、变形细菌保藏存活率达到100％，将保藏时间延长到1个月，金黄葡萄球菌的存活率达到98.94％以上、大肠杆菌的存活率达到98.41％以上、变形细菌的存活率达到98.31％以上，可见本发明培养基对于细菌保藏带来的显著效果。
在冷藏温度为零下30℃的冰箱中，重复以上细菌的冷藏操作，统计细菌冷藏5个月、10个月后的存活率。
试验结果如下表所示。
Figure BDA0003236184920000052
由表可以看出，使用本发明实施例1-3的培养基保藏细菌，在5个月的保藏中金黄色葡萄球菌的存活率超过99.50％、大肠杆菌的存活率超过99.70％、变形细菌的存活率超过99.65％；在10个月的保藏中金黄色葡萄球菌的存活率超过96.50％、大肠杆菌的存活率超过96.81％、变形细菌的存活率超过96.62％。可以看出本发明方法制备的培养基即使在菌种保藏温度升高的情况下，还是能保证菌种活性，如果实际使用中保藏设备出现问题导致环境较大变化，本发明依然能够保证菌种的有效性，其实用价值显著。

Claims (8)

1.一种细菌保藏培养基，其特征在于，包括如下组分：
以1000ml计，含有：牛肉浸膏8-13g、蛋白胨2-6g、胆盐0.2-0.5g、硫酸铝钾0.2-0.3g、麦芽浸粉2-5g、酵母浸出粉3-7g、氯化钠0.3-0.6g、琼脂5-10g、可溶性铁盐0.2-0.5g、补钙剂0.01-0.05g、D-环丝氨酸0.02-0.05g、毛子草酮0.001-0.004g、维生素K10.01-0.02g、络蛋白磷酸肽0.1-0.3g、葡萄糖3-5g、硝酸镧1-2.5g、赤藓醇3-5g、甘油18-23ml、华法林钠片0.1-0.2mg、异烟肼8-12mg、无菌脱纤维绵羊血75-85ml。
2.如权利要求1所述细菌保藏培养基，其特征在于，包括如下组分：
以1000ml计：牛肉浸膏10g、蛋白胨5g、胆盐0.3g、硫酸铝钾0.25g、麦芽浸粉4g、酵母浸出粉5g、氯化钠0.5g、琼脂8g、构椽酸铁按0.3g、乳酸钙0.03g、D-环丝氨酸0.03g、毛子草酮0.003g、维生素K10.01g、络蛋白磷酸肽0.1g、葡萄糖5g、硝酸镧2g、赤藓醇4g、甘油20ml、华法林钠片0.1mg、异烟肼10mg、无菌脱纤维绵羊血80ml,蒸馏水加至1000ml。
3.如权利要求1所述细菌保藏培养基，其特征在于，所述可溶性铁盐为枸橼酸铁铵。
4.如权利要求1所述细菌保藏培养基，其特征在于，所述补钙剂为乳酸钙。
5.如权利要求1所述细菌保藏培养基，其特征在于，制备方法如下：
(1)按照原料配比，取牛肉浸膏、蛋白胨、胆盐、硫酸铝钾、麦芽浸粉、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂、可溶性铁盐、补钙剂、D-环丝氨酸、毛子草酮、维生素K1、络蛋白磷酸肽、葡萄糖、硝酸镧、赤藓醇、甘油、华法林钠片、异烟肼、无菌脱纤维绵羊血备用；
(2)将牛肉浸膏、蛋白胨、胆盐、硫酸铝钾、麦芽浸粉、酵母浸出粉、氯化钠、琼脂混合均匀，倒入可溶性铁盐、补钙剂、D-环丝氨酸、毛子草酮、维生素K1、络蛋白磷酸肽、葡萄糖、硝酸镧、赤藓醇、甘油、华法林钠片、异烟肼、无菌脱纤维绵羊血，加蒸馏水到1000ml,加热到50-60℃使得所有物质溶解；
(3)将上述溶液灭菌，分装于培养器皿中冷藏备用。
6.如权利要求5所述细菌保藏培养基，其特征在于，所述灭菌条件为温度130-150℃、时间3-5h。
7.如权利要求5所述细菌保藏培养基，其特征在于，所述培养器皿为试管或培养皿中的任意一种。
8.如权利要求5所述细菌保藏培养基，其特征在于，所述冷藏温度为2-4℃。
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