CN115478017B - 一种提高保加利亚乳杆菌活性的冷冻保护剂及冷冻方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提高保加利亚乳杆菌活性的冷冻保护剂及冷冻方法和应用，所述冷冻保护剂按质量份计包括4‑20份甘油、0.2‑5份L‑亚油酸、0.2‑5份α‑亚麻酸。本发明创造性地将甘油、L‑亚油酸和α‑亚麻酸三者的组合应用于保加利亚乳杆菌的冷冻保存中，三者相辅相成，在提高和维持短期和长期的存活率和菌体活性方面具有协同增效的作用。本发明使用含有甘油、L‑亚油酸和α‑亚麻酸的冷冻保护剂，实现了保加利亚乳杆菌活菌数和菌活稳定性的大幅提升，可以为大规模生产提供借鉴思路。

Description

一种提高保加利亚乳杆菌活性的冷冻保护剂及冷冻方法和 应用

技术领域

本发明属于微生物冷冻保藏技术领域，具体涉及一种提高保加利亚乳杆菌活性的冷冻保护剂及冷冻方法和应用。

背景技术

保加利亚乳杆菌为革兰阳性、厌氧或兼性厌氧及无芽孢杆菌，广泛应用于乳制品发酵食品中。保加利亚乳杆菌菌体较一般的乳酸菌长，大小为(0.6-1)×(2-20)μm，因其菌体大在冷冻保存过程中容易细胞膜的损伤，造成其抗冻性差，冷冻稳定性差，进而影响种子液的活性，生产批次稳定性。目前保加利亚乳杆菌的保存方法主要采用甘油法，该保存方法成熟，但是在冷冻储存过程中，保加利亚乳杆菌细胞衰亡快，不易长期保存，对产业化生产影响较大。亟需探索出一种能够延长保加利亚乳杆菌甘油管保存时间的方法。目前，冷冻对保加利亚乳杆菌菌体造成损伤的机制尚不完全清楚。目前已经提出了两种取决于冷却速率的损伤机制，其一是在低冷冻速率下，细胞损伤主要是由对细胞的渗透压力引起的(所谓的“溶液效应”)。其二是冷冻过程中细胞外冰晶的形成，在介质中诱导高溶质浓度，从而破坏细胞膜。

专利文件CN111107877A公开了一种用于培养和保存细菌的方法和组合物，其中与通过除主题方法以外的手段保存/储存的细菌相比，培养和保存的细菌展现出改进的活力/生长。更具体地，该发明公开了用于在冷冻保存后改进细菌活力的方法和组合物。所述方法包括：a)将第一细菌物种与至少一种第二细菌物种组合以产生细菌混合物，其中所述第一细菌物种是氨基酸球菌属物种或氨基酸球菌科的成员，其中所述第一细菌物种以足以对所述至少一种第二细菌物种赋予冷冻保护的量存在于所述细菌混合物中，并且其中氨基酸球菌科物种的成员是运动琥珀酸螺菌；b)培养所述细菌混合物以产生培养的细菌混合物，其中所述培养持续足以对所述培养的细菌混合物中的所述至少一种第二细菌物种赋予所述冷冻保护的时间段；和c)冷冻保存所述培养的细菌混合物以产生冷冻保存的细菌培养物；其中在细菌增殖测定中，所述冷冻保存的细菌培养物在重构后，相对于包含所述至少一种第二细菌物种且不含所述第一细菌物种的冷冻保存的细菌培养物在重构后的细菌增殖，展现出所述至少一种第二细菌物种的至少10×增加的细菌增殖。

保加利亚乳杆菌菌体较大，在冷冻保存过程中易出现细胞膜损伤，造成其抗冻性差，稳定性差。现有技术中保加利亚乳杆菌的保存方法主要采用的甘油法，保加利亚乳杆菌细胞衰亡快，不易长期保存，对产业化生产影响较大，因此，探索优化提高保加利亚乳杆菌低温冷冻的方法是非常有意义的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种冷冻保护剂及冷冻方法和应用，具体提供一种提高保加利亚乳杆菌活性的冷冻保护剂及冷冻方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种提高保加利亚乳杆菌活性的冷冻保护剂，所述冷冻保护剂按质量份计包括4-20份甘油、0.2-5份L-亚油酸、0.2-5份α-亚麻酸。

所述甘油提取物的质量份数可以为4份、6份、8份、10份、12份、14份、16份、18份或20份等。

所述L-亚油酸的质量份数可以为0.2份、0.8份、1.4份、2份、2.8份、3.6份、4.4份或5份等。

所述α-亚麻酸的质量份数可以为0.2份、0.8份、1.4份、2份、2.8份、3.6份、4.4份或5份等。

上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

本发明所涉及的冷冻保护剂包括甘油、L-亚油酸和α-亚麻酸，其中，甘油分子量小，溶解度大，容易穿透细菌，发挥降低冰点的作用，在低温条件下减少冰晶的形成，起到菌体的抗冻保护作用；L-亚油酸和α-亚麻酸是保加利亚乳杆菌细胞膜上重要的有机酸，合适的亚油酸和亚麻酸的比例，能够在冷冻保存过程中减少由于渗透压的变化和细胞膜的脂质氧化，引起地细胞膜的损伤；本发明创造性地将甘油、L-亚油酸和α-亚麻酸应用于提高保加利亚乳杆菌在冷冻保存中的活性，三者相辅相成，在提高和维持短期和长期存活率及菌体活性方面具有协同增效的作用。本发明使用含有甘油、L-亚油酸和α-亚麻酸的冷冻保护剂，实现了保加利亚乳杆菌活菌数和稳定性的大幅提升，可以为大规模生产提供借鉴思路。

优选地，所述冷冻保护剂还包括抗冻蛋白。

优选地，所述冷冻保护剂按质量份计还包括0.02-2份抗冻蛋白。

所述抗冻蛋白的质量份数可以为0.02份、0.2份、0.6份、1份、1.4份、1.8份或2份等。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

本发明所述的冷冻保护剂还包括抗冻蛋白，抗冻蛋白是提高生物体对低温适应能力的一种蛋白质。目前发现的抗冻蛋白避免低温胁迫对生物体造成伤害，提高生物体对低温的适应能力的作用机制主要包括：降低冰点、改变冰晶形态和抑制冰晶生长等。抗冻蛋白的来源主要是鱼类、昆虫类和植物。在本发明的冷冻保护剂中加入抗冻蛋白可以与甘油、L-亚油酸和α-亚麻酸3种成分配合，协同增效，在降低保加利亚乳杆菌细胞损伤、增强保加利亚乳杆菌酸化活性和存活率方面具有更强的功用；当抗冻蛋白份数小于0.02份时，抗冻蛋白与3种成分联合应用效果增强不显著，当抗冻蛋白特定选择0.02-2份时，冷冻保护剂具有更优异的抗冻活性，且更经济实惠。

第二方面，如第一方面所述的冷冻保护剂在保加利亚乳杆菌冷冻保存中的应用。

第三方面，一种提高保加利亚乳杆菌活性的冷冻方法，所述冷冻方法包括将保加利亚乳杆菌菌液与如第一方面所述的冷冻保护剂混匀，进行降温再冷冻。

本发明所述的保加利亚乳杆菌菌液先与冷冻保护剂混匀后再降温冷冻，最后放置并长期储存，此方法操作简单，仅需简单的混匀降温即可，具有更高的工业化使用价值。且降温冷冻步骤的加入有利于减缓保加利亚乳杆菌菌液冷冻体系的成核与细胞内外小冰晶的形成，进而达到在冷冻的整体过程中更小的细胞损伤，保加利亚乳杆菌短期、长期储存活性和存活率更高。

优选地，所述保加利亚乳杆菌菌液由如下方法制得：将保加利亚乳杆菌菌种接种、培养，得所述保加利亚乳杆菌菌液。

优选地，所述保加利亚乳杆菌菌种接种使用的培养基包括MRS培养基。

本发明所述保加利亚乳杆菌菌种接种使用的培养基包括MRS培养基，其中MRS培养基为常规培养基，主要成分包括蛋白胨、牛肉膏粉、酵母膏粉、葡萄糖、吐温-80、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸三铵、硫酸镁、硫酸锰、琼脂粉。

优选地，所述保加利亚乳杆菌菌种接种的培养温度为30-40℃。

所述30-40℃中的具体数值可以为30℃、32℃、34℃、36℃、38℃或40℃等。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述保加利亚乳杆菌菌种接种的培养时间为1-3天。

所述1-3天中的具体数值可以选择1天、2天或3天。

优选地，所述接种的具体操作为在固体培养基表面划线，得保加利亚乳杆菌单菌落。

优选地，所述划线重复1-3次。

所述1-3次中的具体数值可以为1次、2次或3次。

优选地，所述培养包括挑取所述单菌落，接种至液体培养基中培养的步骤。

优选地，所述培养的温度为30-40℃，所述培养的时间为6-12h。

所述30-40℃中的具体数值可以为30℃、32℃、34℃、36℃、38℃或40℃等。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

所述6-12h中的具体数值可以为6h、7h、8h、9h、10h、11h或12h等。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述培养用培养基的原料包括甘氨酸、山梨糖醇、甜菜碱和氯化钠。

本发明所涉及的培养用培养基的原料包括甘氨酸、山梨糖醇、甜菜碱和氯化钠，其中甘氨酸、山梨糖醇和甜菜碱可以进入保加利亚乳杆菌细胞中，减少在冷冻过程中细胞内部形成的冰晶，有效控制细胞内部大冰晶的形成，进一步地减少由胞内冰晶造成的细胞内损伤，提高细胞存活率和细胞活性；氯化钠的加入可以有效的维持保加利亚乳杆菌的胞内渗透压，在高渗透压的胁迫条件下促进甘氨酸、山梨糖醇、甜菜碱进入胞内发挥保护作用。甘氨酸、山梨糖醇和甜菜碱，三种成分相辅相成，可协同增效，再配合氯化钠的增强作用，包含着4种原料的培养基具有更强的减少细胞受损，提高保加利亚乳杆菌短期和长期冷冻条件下的活性和活菌数的作用。

优选地，所述培养基的原料以质量份数包括1-8份甘氨酸、3-40份山梨糖醇、1-14份甜菜碱和30-60份氯化钠。

所述甘氨酸的质量份数可以为1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份或8份等。

所述山梨糖醇的质量份数可以为3份、5份、8份、11份、14份、17份、20份、23份、26份、29份、32份、35份、38份或40份等。

所述甜菜碱的质量份数可以为1份、2份、4份、6份、8份、10份、12份或14份等。

所述氯化钠的质量份数可以为30份、35份、40份、45份、50份、55份或60份等。

上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述培养基的原料还包括碳源、氮源、无机盐、表面活性剂。

优选地，所述碳源包括葡萄糖、果糖或蔗糖中的任意一种或至少两种的组合，例如葡萄糖和果糖的组合、果糖和蔗糖的组合、葡萄糖和蔗糖的组合等，其他组合均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述氮源包括蛋白胨、酵母膏或玉米浆中的任意一种或至少两种的组合，例如蛋白胨和酵母膏的组合、酵母膏和玉米浆的组合、蛋白胨和玉米浆的组合等，其他组合均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述无机盐包括柠檬酸二铵、磷酸氢二钾、硫酸镁或硫酸锰中的任意一种或至少两种的组合，例如柠檬酸二铵和磷酸氢二钾的组合、磷酸氢二钾和硫酸镁的组合、硫酸镁和硫酸锰的组合等，其他组合均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述表面活性剂包括吐温-80、吐温-40或吐温-20中的任意一种或至少两种的组合，例如吐温-80和吐温-40的组合、吐温-40和吐温-20的组合，或吐温-80和吐温-20的组合等，其他组合均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述保加利亚乳杆菌菌液与冷冻保护剂的质量比为(0.5-10):1。

所述(0.5-10)中的具体数值可以选择0.5、1、3、5、7、9或10等。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

本发明所述的保加利亚乳杆菌菌液与冷冻保护剂的质量比为(0.5-10):1时，冷冻保护剂对保加利亚乳杆菌的保护作用更强，保加利亚乳杆菌短期和长期冷冻条件下的活性更高、活菌数更多。

优选地，所述降温的降温速度为2-10℃/min，降至-5℃。

所述2-10℃/min中的具体数值可以选择2℃/min、4℃/min、6℃/min、8℃/min或10℃/min等。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

本发明所述的降温时降温速率在2-10℃/min之间时，降温处于缓慢降温的状态，含有保加利亚乳杆菌的体系成核更缓慢，细胞内外大冰晶的形成更少，细胞损伤更小，保加利亚乳杆菌的酸化活性和活菌数均更高。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明所涉及的冷冻保护剂包括甘油、L-亚油酸和α-亚麻酸，其中，甘油分子量小，溶解度大，容易穿透细菌，发挥降低冰点的作用，在低温条件下减少冰晶的形成，起到菌体的抗冻保护作用；L-亚油酸和α-亚麻酸是保加利亚乳杆菌细胞膜上重要的有机酸，合适的亚油酸和亚麻酸的比例，能够在冷冻保存过程中减少由于渗透压的变化和细胞膜的脂质氧化，引起地细胞膜的损伤；本发明创造性地将甘油、L-亚油酸和α-亚麻酸应用于提高保加利亚乳杆菌在冷冻保存中的活性，三者相辅相成，在提高和维持短期和长期存活率及菌体活性方面具有协同增效的作用。本发明使用含有甘油、L-亚油酸和α-亚麻酸的冷冻保护剂，实现了保加利亚乳杆菌活菌数和稳定性的大幅提升，可以为大规模生产提供借鉴思路。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

下述实施例、对比例、测试例所涉及的抗冻蛋白为购自南京安飞生物科技有限公司的安飞生物抗冻蛋白产品；商业化MRS固体培养基为购自海博生物科技有限公司的型号为HB0384-5的产品。

制备例1

本制备例提供一种保加利亚乳杆菌的单菌落，具体制备方法如下：取保加利亚杆菌ATCC BAA-365甘油管融化后，用接种环在商业化MRS固体培养基划线，37℃恒温箱培养，2天后，挑取固体平板上的单菌落，再次在商业化MRS固体培养基划线，37℃恒温箱培养2天，挑取固体平板上的单菌落，得保加利亚乳杆菌ATCC BAA-365的单菌落。

实施例1

本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系包括菌液和冷冻保护剂，其制备方法如下：配置培养基，其中所述培养基成分为：2份甘氨酸、5份山梨糖醇、2份甜菜碱、35份氯化钠、20份蛋白胨、5份酵母膏、40份葡萄糖、2份柠檬酸二铵、1份吐温-80、6份硫酸镁、2份硫酸锰、2份磷酸氢二钾，培养基各组分按比例配置后121℃灭菌20min。将制备例1制得的保加利亚乳杆菌单菌落接种至培养基中，37℃恒温培养10h，4℃放置15min，得所述保加利亚乳杆菌菌液。

将6份甘油、1份L-亚油酸、0.8份α-亚麻酸、0.2份抗冻蛋白混匀，得冷冻保护剂。

将5份保加利亚乳杆菌液与5份冷冻保护剂混匀，利用控温冷冻机，2℃/min的速率从4℃冷却到-5℃，置于-80℃冷藏，得所述保加利亚乳杆菌冷冻保存体系。

实施例2

本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系包括菌液和冷冻保护剂，其制备方法如下：配置培养基，其中所述培养基成分为：1份甘氨酸、3份山梨糖醇、8份甜菜碱、40份氯化钠、18份蛋白胨、4份酵母膏、36份葡萄糖、2份柠檬酸二铵、1份吐温-80、6份硫酸镁、1份硫酸锰、2份磷酸氢二钾，培养基各组分按比例配置后121℃灭菌20min。将制备例1制得的保加利亚乳杆菌单菌落接种至培养基中，35℃恒温培养8h，4℃放置15min，得所述保加利亚乳杆菌菌液。

将4份甘油、1.5份L-亚油酸、0.7份α-亚麻酸、0.02份抗冻蛋白混匀，得冷冻保护剂。

将4份保加利亚乳杆菌液与6份冷冻保护剂混匀，利用控温冷冻机，3℃/min的速率从4℃冷却到-5℃，置于-70℃冷藏，得所述保加利亚乳杆菌冷冻保存体系。

实施例3

本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系包括菌液和冷冻保护剂，其制备方法如下：配置培养基，其中所述培养基成分为：8份甘氨酸、10份山梨糖醇、1份甜菜碱、30份氯化钠、18份蛋白胨、6份酵母膏、41份葡萄糖、2份柠檬酸二铵、1份吐温-80、6份硫酸镁、2份硫酸锰、1份磷酸氢二钾，培养基各组分按比例配置后121℃灭菌20min。将制备例1制得的保加利亚乳杆菌单菌落接种至培养基中，38℃恒温培养11h，4℃放置15min，得所述保加利亚乳杆菌菌液。

将15份甘油、0.5份L-亚油酸、1.8份α-亚麻酸、0.4份抗冻蛋白混匀，得冷冻保护剂。

将6份保加利亚乳杆菌液与4份冷冻保护剂混匀，利用控温冷冻机，5℃/min的速率从4℃冷却到-5℃，置于-80℃冷藏，得所述保加利亚乳杆菌冷冻保存体系。

实施例4

本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于培养基中不含甘氨酸，并将甘氨酸的质量份数按比例分配至山梨糖醇、甜菜碱，其余均与实施例1相同。

实施例5

本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于培养基中不含山梨糖醇，并将山梨糖醇的质量份数按比例分配至甘氨酸、甜菜碱，其余均与实施例1相同。

实施例6

本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于培养基中不含甜菜碱，并将甜菜碱的质量份数按比例分配至甘氨酸、山梨糖醇，其余均与实施例1相同。

实施例7

本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于培养基中不含甘氨酸、山梨糖醇，并将甘氨酸、山梨糖醇的质量份数全部分配至甜菜碱，其余均与实施例1相同。

实施例8

本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于培养基中不含甘氨酸、甜菜碱，并将甘氨酸、甜菜碱的质量份数全部分配至山梨糖醇，其余均与实施例1相同。

实施例9

本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于培养基中不含甜菜碱、山梨糖醇，并将甜菜碱、山梨糖醇的质量份数全部分配至甘氨酸，其余均与实施例1相同。

实施例10

本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于冷冻保护剂中不含抗冻蛋白，并将抗冻蛋白的份数按比例分配至甘油、L-亚油酸、α-亚麻酸，其余均与实施例1相同。

实施例11

本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于将5份保加利亚乳杆菌菌液与5份冷冻保护剂(保加利亚乳杆菌液与冷冻保护剂的质量比为1:1)替换为2份保加利亚乳杆菌菌液与8份冷冻保护剂(保加利亚乳杆菌液与冷冻保护剂的质量比为0.25:1)，其余均与实施例1相同。

实施例12

本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于将5份保加利亚乳杆菌菌液与5份冷冻保护剂(保加利亚乳杆菌液与冷冻保护剂的质量比为1:1)替换为9.2份保加利亚乳杆菌菌液与0.8份冷冻保护剂(保加利亚乳杆菌液与冷冻保护剂的质量比为11.5:1)，其余均与实施例1相同。

实施例13

本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于所述降温的降温速度为1℃/min，降至-5℃，其余均与实施例1相同。

实施例14

本实施例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于所述降温的降温速度为11℃/min，降至-5℃，其余均与实施例1相同。

对比例1

本对比例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于所述冷冻保护剂不含甘油，并将甘油的质量份数按比例分配至L-亚油酸和α-亚麻酸，其余均与实施例1相同。

对比例2

本对比例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于所述冷冻保护剂不含L-亚油酸，并将L-亚油酸的质量份数按比例分配至甘油和α-亚麻酸，其余均与实施例1相同。

对比例3

本对比例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于所述冷冻保护剂不含α-亚麻酸，并将α-亚麻酸的质量份数按比例分配至甘油和L-亚油酸，其余均与实施例1相同。

对比例4

本对比例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于所述冷冻保护剂仅含7.8份甘油、0.2份抗冻蛋白，其余均与实施例1相同。

对比例5

本对比例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于所述冷冻保护剂仅含7.8份L-亚油酸、0.2份抗冻蛋白，其余均与实施例1相同。

对比例6

本对比例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于所述冷冻保护剂仅含7.8份α-亚麻酸、0.2份抗冻蛋白，其余均与实施例1相同。

对比例7

本对比例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于不添加冷冻保护剂，其余均与实施例1相同。

对比例8

本对比例提供一种保加利亚乳杆菌冷冻保存体系，所述保存体系与实施例1的区别仅在于冷冻保护剂中不含甘油、L-亚油酸、α-亚麻酸，仅含8份抗冻蛋白，其余均与实施例1相同。

测试例1

对实施例与对比例制得的保加利亚乳杆菌冷冻保存体系中的保加利亚乳杆菌的冷冻存活率进行评价，具体评价方法为：根据GB 4789.35-2016的检验方法检测，(1)取实施例1-14和对比例1-8降温后当天未进行冷藏的保加利亚乳杆菌液与冷冻保护剂混合体系，吸取1mL加入9mL生理盐水，涡旋混匀，重复一次，实施例1-14和对比例1-8制得当天的活菌量为初始活菌数；实施例1-14和对比例1-8制得的保加利亚乳杆菌冷冻保存体系放置1天、6个月后分别解冻，吸取1mL液体加入9mL生理盐水，涡旋混匀，重复一次。(2)将混匀的液体分别使用生理盐水稀释10倍、20倍、50倍，得不同浓度梯度的混合菌液。(3)吸取1ml混合菌液加入平板中，倒入已融化并冷却至45℃左右的培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，30℃培养，48h后取出计数，得活菌数。冷冻1天/6个月的存活率(％)＝冷冻1天/6个月的活菌数(cfu/mL)/初始活菌数(cfu/mL)。

表1

由表1数据可知，实施例4-9所述培养用培养基中分别缺失甘氨酸、山梨糖醇、甜菜碱中的一种成分或仅含其中的一种成分，其冷冻1天、6个月的存活率均较实施例1低，表明培养基中甘氨酸、山梨糖醇、甜菜碱三种成分协同增效，在短期增加保加利亚乳杆菌液的抗冻能力和长期维持保加利亚乳杆菌存活率方面有显著的提升。

实施例10所述冷冻保护剂不含抗冻蛋白，对比例8所述冷冻保护剂仅含抗冻蛋白，其冷冻1天、6个月的存活率均较实施例1低，表明抗冻蛋白与甘油、L-亚油酸、α-亚麻酸组合使用在增强保加利亚乳杆菌的冷冻存活率方面具有更强的协同增效作用。实施例11、12所述保加利亚乳杆菌液与冷冻保护剂的质量比不在(0.5-10):1的范围内，其冷冻1天及6个月的存活率均较实施例1低，表明保加利亚乳杆菌液与冷冻保护剂的质量比在(0.5-10):1的范围内时，保加利亚乳杆菌的抗冻性更好，存活率更高；实施例13、14所述降温的降温速度不在2-10℃/min的范围内，其冷冻1天及6个月的存活率均较实施例1低，表明降温速度在2-10℃/min的范围内时，通过控温冷冻机梯度降温，延缓保护体系成核，能够有效提升冷冻活菌数。

对比例7不添加冷冻保护剂，其第1天和第6个月的存活率较实施例1更差，表明冷冻保护剂的加入可以有效的提升保加利亚乳杆菌的抗冻性和存活率；对比例1-6分别缺失甘油、L-亚油酸、α-亚麻酸中的一种成分，或仅含甘油、L-亚油酸、α-亚麻酸中的一种成分，其存活率实施例1低，表明甘油、L-亚油酸、α-亚麻酸三种成分的组合在提高保加利亚乳杆菌的冷冻存活率方面具有显著的协同增效作用。

测试例2

对实施例与对比例制得的保加利亚乳杆菌冷冻保存体系中的保加利亚乳杆菌的酸化活性进行评价，具体评价方法为：(1)将测试例1步骤(3)得到的保加利亚乳杆菌接种至煮沸灭菌的脱脂牛奶中，接菌量为2％v/v，42℃培养。(2)检测脱脂牛奶pH达到最低的pH＝4.4时所需要的时间，来表示菌种的酸化活性。实施例1-14和对比例1-8制得当天的未进行冷藏的保加利亚乳杆菌液与冷冻保护剂混合体系为初始酸化活性。冷冻1天或6个月的酸化活性差异率＝(冷冻1天或6个月的酸化活性-初始酸化活性)/初始酸化活性。

表2

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由表2数据可知，实施例4-9所述培养用培养基中分别缺失甘氨酸、山梨糖醇、甜菜碱中的一种成分或仅含其中的一种成分，结果显示冷冻1天、6个月的酸化差异率较实施例1升高明显，即冷冻后酸化活性较实施例1降低明显，表明培养基中甘氨酸、山梨糖醇、甜菜碱三种成分协同增效，在短期增加保加利亚乳杆菌液的抗冻能力和长期维持保加利亚乳杆菌活性方面有显著的提升。

实施例10所述冷冻保护剂不含抗冻蛋白，对比例8所述冷冻保护剂仅含抗冻蛋白，其冷冻1天、6个月的酸化活性差异率均较实施例1高，表明抗冻蛋白与甘油、L-亚油酸、α-亚麻酸组合使用在增强保加利亚乳杆菌的抗冻性，增加短期和长期冷冻保存活性方面具有更强的协同增效作用。实施例11、12所述保加利亚乳杆菌液与冷冻保护剂的质量比不在(0.5-10):1的范围内，其冷冻1天及6个月的酸化活性差异率均较实施例1高，即冷冻后酸化活性较实施例1降低明显，表明保加利亚乳杆菌液与冷冻保护剂的质量比在(0.5-10):1的范围内时，保加利亚乳杆菌的抗冻性更好，活性维持状态更优；实施例13、14所述降温的降温速度不在2-10℃/min的范围内，其冷冻1天及6个月的酸化活性差异率均较实施例1高，表明降温速度在2-10℃/min的范围内时，通过缓慢降温，可以减少较大冰晶形成对细胞的损伤，能够有效维持保加利亚乳杆菌的活性。

对比例7仅不添加冷冻保护剂，其第1天和第6个月的酸化活性差异率较实施例1更高，即冷冻后酸化活性降低更明显，表明冷冻保护剂的加入可以有效的提升保加利亚乳杆菌的存活率且细胞还保持较好的活性；对比例1-6分别缺失甘油、L-亚油酸、α-亚麻酸中的一种成分，或仅含甘油、L-亚油酸、α-亚麻酸中的一种成分，其冷冻6个月的酸化活性差异率较实施例1高，表明甘油、L-亚油酸、α-亚麻酸三种成分的组合在提高保加利亚乳杆菌的长时间冷冻活性维持方面具有协同增效作用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围。

Claims (5)

1.一种提高保加利亚乳杆菌活性的冷冻保护剂，其特征在于，所述冷冻保护剂按质量份计由4-20份甘油、0.2-5份L-亚油酸、0.2-5份α-亚麻酸和0.02-2份抗冻蛋白组成。

2.如权利要求1所述的冷冻保护剂在保加利亚乳杆菌冷冻保存中的应用。

3.一种提高保加利亚乳杆菌活性的冷冻方法，其特征在于，所述冷冻方法包括将保加利亚乳杆菌菌液与如权利要求1所述的冷冻保护剂混匀，以 2-10℃/min的速度进行降温，降至-5℃再冷冻；

所述保加利亚乳杆菌菌液培养用培养基的原料以质量份数包括1-8份甘氨酸、3-40份山梨糖醇、1-14份甜菜碱和30-60份氯化钠；

所述保加利亚乳杆菌菌液与冷冻保护剂的质量比为(0.5-10):1。

4.如权利要求3所述的冷冻方法，其特征在于，所述保加利亚乳杆菌菌液由如下方法制得：

将保加利亚乳杆菌菌种接种、培养，得所述保加利亚乳杆菌菌液。

5.如权利要求4所述的冷冻方法，其特征在于，所述培养的温度为30-40℃，所述培养的时间为6-12h。