CN103773685A - 一种亚硝酸菌的保藏方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种亚硝酸菌的保藏方法，包括如下步骤：（1）将亚硝酸菌培养至亚硝化率达80%以上，并收集菌体；（2）配制亚硝酸菌保藏营养液；（3）步骤（1）收集的亚硝酸菌体与步骤（2）配制的亚硝酸菌保藏营养液混合，pH为7.5～8.5，含水率为40%～80%，含水率指亚硝酸菌保藏体系中水的重量含量；（4）添加保藏剂；（5）低温冷冻保藏。与现有技术相比本发明具有方法简单、存活率高、活性恢复快速等优点，适宜于亚硝酸菌的大量长期保存。

Description

一种亚硝酸菌的保藏方法

技术领域

本发明涉及一种菌体保藏方法，具体涉及一种简单有效的低温冷冻保藏亚硝酸菌的方法。

背景技术

    氨氮是国家实现水污染控制总量控制的污染物，水体中氨氮含量过高会引起水质富营养化，导致水体中某些藻类过度繁殖，其它生物生长受到影响，从而破坏了水生生态***，导致水质恶化并影响到其使用功能。生物脱氮技术以其环保高效无二次污染等优点是目前国内外脱氮技术研究应用的热点。生物脱氮的硝化过程是在好氧条件下通过硝酸菌或亚硝酸菌将氨氮氧化为硝氮或亚硝氮，再通过缺氧条件下的反硝化菌将硝氮或亚硝氮还原成气态氮从水中除去。传统生物脱氮工艺中间浪费了一个将亚硝氮转化硝氮，硝氮又转化为亚硝氮的过程。短程硝化反硝化脱氮是将硝化反应控制在亚硝氮阶段，阻止亚硝氮的进一步硝化，然后直接进行反硝化。与传统硝化反硝化相比，短程硝化反硝化具有如下的优点：(1)硝化阶段可减少25%左右的需氧量，降低了能耗；(2)反硝化阶段可减少40%左右的有机碳源，降低了运行费用；(3)反应时问缩短，反应器容积可减小30%～40%左右；(4)具有较高的反硝化速率；(5)污泥产量降低；(6)减少了投碱量等。由此可见，控制硝化过程在亚硝化阶段具有重要意义，而完成短程硝化的高性能亚硝酸菌被选育出来后，如何长期有效的保藏至关重要。 

微生物菌种是重要的生物资源之一，一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低菌体性能，能长期应用于生产中。菌种保藏的基本原理主要是根据其生理生化特征，人工创造条件，使微生物代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态，即采取低温、干燥、缺氧等条件，使菌种暂时处于休眠状态。一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便在生产上能推广使用。为了有效地保藏微生物菌种，就需要针对菌种的特性研究选用适宜的保藏方法。菌种保藏方法很多，目前国内外常用的有定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、超低温冰箱冷冻法、超低温液氮冷冻法等。其中定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法不适合大量菌种的保藏；超低温液氮冷冻法和超低温冰箱冷冻法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等，目的是防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。冷冻保存是解决种质退化和防止自然积累性突变的一种有效途径，但传统的低温保存需要昂贵的程序降温仪器，步骤繁琐。完全玻璃化是低温保存的一种新方法，即在高浓度保护剂下，细胞连同保护剂于快速降温中都进入玻璃化状态，避免胞内冰晶形成，使器官和组织各部分都进入相同的状态，具有设备简单、程序简单和冻存效果好等优点。

CN200810124325.5提供了一种菌种保藏方法，采用半固体、低温密封培养的方法：将菌种接种于无菌的半固体培养基中，倒入无菌液体石蜡后竖直存放入6～8℃的环境温度中保存。所述菌种为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色链珠菌。采用此方法可延长菌种的保存时间，同时菌种的浓度保持相对稳定，为生产、试验节约了大量的成本，减少了菌种使用后废弃物的处理和排放，减少了对环境的危害。但是该方法工序复杂繁琐，不适合大量菌体的长期保藏。

CN201010299763.2提供了一种冷冻保存红细胞的方法，向红细胞中加入还原剂和甘油以及作为金属离子螯合剂的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐；还原剂为抗坏血酸或抗坏血酸盐、半胱氨酸盐酸盐或N-乙酰半胱氨酸、硼氢化钠、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠、还原型谷胱甘肽中的任意一种或者两种或两种以上的混合物，还原剂终浓度各为0.5～300mM；甘油的量以终体积比计为5%～10%；乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐的终浓度为0.1～10mM；充分混匀并调节酸度值至6.5～8.0，将容器封口，静置1小时后在-40℃以下冷冻保存。以该方法冷冻保存的红细胞，一年后解冻，红细胞破碎率大于95%，血红蛋白无变性，未被氧化为高铁血红蛋白。此种方法适合细胞保藏法，不适合菌种活性的保藏。

CN200810190852.6涉及一种菌种保藏方法，包括以下步骤：(1)将需要保藏的菌种接种到灭过菌的麸皮培养基中；培养基配方为50～60%麸皮、35～45%粉碎后的谷壳、1～2%硝酸钠、1～2%尿素、1～2%米粉、0.2～1%生物素营养添加剂，加入上述混合物相同重量的去离子水，混合均匀即可；(2)当菌丝长到需要的菌龄时，不需分离出菌丝制成菌悬液，直接将冻干液立即加入安瓿管中与培养物混合均匀；冻干液配方为10～20克脱脂牛奶、0.2～0.5克琼脂粉、0.2～0.5克还原型谷胱甘肽、0.1～0.5克***胶、0.5～1克叔丁醇，用去离子水定容到100毫升；(3)然后以2℃/分钟的降温速率降温，冷冻干燥；(4)冻干后对盛菌的安瓿管抽真空，然后封口；以及(5)将所得到的管置入低温下保藏。该法采用真空冷冻干燥法保藏菌体，需要采用缓慢的降温程序将菌体冻干进而低温保藏，步骤繁琐，能耗较高。

发明内容

    针对现有技术的不足，本发明提供一种亚硝酸菌的保藏方法。本发明具有方法简单、存活率高、活性恢复快速等优点，适宜于亚硝酸菌的大量长期保存。

本发明亚硝酸菌的保藏方法，包括如下步骤：

（1）将亚硝酸菌培养至亚硝化率达80%以上，并收集菌体；

（2）配制亚硝酸菌保藏营养液；

（3）步骤（1）收集的亚硝酸菌体与步骤（2）配制的亚硝酸菌保藏营养液混合，pH为7.5～9.0，含水率为40%～80%，含水率指亚硝酸菌保藏体系中水的重量含量；

（4）添加保藏剂；

（5）低温冷冻保藏。

本发明步骤（1）中，亚硝酸菌培养采用本领域常规的方法，如采用间歇式活性污泥法等。亚硝酸菌培养可以采用人工配置的培养液，也可采用废水对亚硝酸菌进行培养。培养液所含成分主要为铵盐，氨氮浓度为200～1500mg/L，还有少量Fe²⁺、Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺等金属离子以及磷酸根离子等。亚硝酸菌培养条件为温度30～40℃，pH为7.0～8.5，溶解氧为1.0～5.0mg/L，培养至氨氮去除率达99%、亚硝化率达80%以上时收集菌体（亚硝化率是指氨氮转化为亚硝氮的比率）。亚硝酸菌培养至亚硝化率达80%以上时，通过沉降、过滤、离心等方法收集亚硝酸菌体。亚硝酸菌培养的初始来源可以是任意需要保藏的亚硝酸菌。

本发明步骤（2）中，亚硝酸菌保藏营养液中含有（NH₄)₂SO₄，同时含有微量物质FeSO₄、KH₂PO₄、MgCl₂和CaCl₂。各种物质的用量按步骤（3）中所需浓度确定。

本发明步骤（3）中，亚硝酸菌与保藏营养液混合后，可以采用碳酸氢钠、碳酸钠和氢氧化钠等调节pH。亚硝酸菌与保藏营养液混合物中，NH₄ ⁺-N浓度为 0.1～1.5g/L，Fe²⁺浓度为0.01～0.06g/L，K⁺浓度为0.05～0.5g/L，Ca²⁺浓度为0.01 ～0.1g/L，Mg²⁺浓度为0.05～0.5g/L。

本发明步骤（4）中，所述的保藏剂可以是本领域应用的所有常规的保藏剂，优选为二甲亚砜，用量为亚硝酸菌加入营养液后混合物体积的2%～5%。

本发明步骤（5）中，低温冷冻保藏可以采用本领域常规的超低温冷冻设备。低温冷冻保藏温度为-20℃～-70℃。

本发明方法通过从菌体培养、含水率、营养液、保护剂等方面进行优化考察，得到了最适宜的亚硝酸菌低温冷冻保藏方法。本发明方法可以延长菌种的保存时间，同时使菌种的活性保持相对稳定，菌体保藏后存活率高，活性恢复迅速，对于大量菌体保藏经济方便，为生产、试验节约成本。本发明方法简单，不需特殊设备，方便快捷，适合大量菌种保藏，存活率可以达到90%以上。

具体实施方式

本发明的一种具体实施过程如下：

（1） 利用适宜的培养液，温度30～40℃，pH为7.0～8.5，溶解氧为1.0～5.0mg/L，培养至氨氮去除率达99%、亚硝化率达80%以上时收集菌体。

（2） 菌悬液的含水率对于胞内外冰晶的形成有影响，进而影响保藏效果，因此需要适宜的含水率。菌体培养液的初始含水量较高，因此需要降低菌体含水率。

（3） pH对控制硝化反应在亚硝化阶段和亚硝酸菌的活性均具有一定影响，在低温条件下，虽然菌体处于休眠状态，但是由于营养物质丰富，会使pH有所下降，因此控制混合液适宜的pH对于菌体的保藏至关重要。

（4） 营养物质是菌体生存的必备条件，可使菌体在低温冰箱中保藏若干年，而不影响其活性，需要按照适宜的营养物质浓度加入保藏所需营养液。

（5） 保藏剂可以是本领域应用的所有保藏剂，优选二甲亚砜C₂H₆SO作冷冻保藏剂。二甲亚砜是一种渗透性保护剂，对细胞无毒性，分子量小，溶解度好，能迅速透入细胞，降低冰点，提高细胞膜对水的通透性，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结之前透出细胞外，在胞外形成冰晶，提高细胞内的电解质浓度，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞冻伤。加入一定配比的冷冻保护剂，使用量为加入营养液后待保藏菌体体积的2%～5%。

（6） 低温冰箱冻存：低温冷冻是在-20℃～-70℃之间。保藏3～5年能力后，考察菌体存活率和活性。

实施例1

配制进水氨氮浓度为400mg/L的培养液，在100L生物曝气反应池中采用间歇式活性污泥法对亚硝酸菌进行培养，温度32℃，pH为7.8，溶解氧为1.0～2.5mg/L。当菌体的氨氮去除率达99%以上，亚硝化率达80%以上时停止培养，沉降或离心后进行多次洗涤，降低硝化产物浓度。按照50%的含水率，将菌体与配制的营养液混合，摇匀后加入3%的保藏剂二甲亚砜，于-50℃低温冰箱保藏。2年后取出考察菌体的活性和存活率，经过3d的恢复，菌体的活性可完全恢复，存活率可达94%。

亚硝酸菌与保藏营养液混合物中，营养物质的组成和浓度为：氨氮浓度为 0.4g/L，Fe²⁺浓度为0.02g/L，K⁺浓度为0.1g/L，Ca²⁺浓度为0.05g/L，Mg²⁺浓度为0.1g/L。

实施例2

配制进水氨氮浓度为600mg/L的培养液，在100L生物曝气反应池中采用间歇式活性污泥法对亚硝酸菌进行培养，温度35℃，pH为8.0，溶解氧为1.5～3.0mg/L。当菌体的氨氮去除率达99%以上，亚硝化率达80%以上时停止培养，沉降或离心后进行多次洗涤，降低硝化产物浓度。按照60%的含水率，将菌体与配制的营养液混合，摇匀后加入4%的保藏剂二甲亚砜，于-60℃低温冰箱保藏。4年后取出考察菌体的活性和存活率，经过5d的恢复，菌体的活性可完全恢复，存活率可达91%。

亚硝酸菌与保藏营养液混合物中，营养物质的组成和浓度为：氨氮浓度为 0.6g/L，Fe²⁺浓度为0.02g/L，K⁺浓度为0.1g/L，Ca²⁺浓度为0.05g/L，Mg²⁺浓度为0.1g/L。

实施例3

配制进水氨氮浓度为800mg/L的培养液，在100L生物曝气反应池中采用间歇式活性污泥法对亚硝酸菌进行培养，温度37℃，pH为8.5，溶解氧为1.5～2.5mg/L。当菌体的氨氮去除率达99%以上，亚硝化率达80%以上时停止培养，沉降或离心后进行多次洗涤，降低硝化产物浓度。按照70%的含水率，将菌体与配制的营养液混合，摇匀后加入5%的保藏剂二甲亚砜，于-70℃低温冰箱保藏。5年后取出考察菌体的活性和存活率，经过7d的恢复，菌体的活性可完全恢复，存活率可达90%。

亚硝酸菌与保藏营养液混合物中，营养物质的组成和浓度为：氨氮浓度为 0.6g/L，Fe²⁺浓度为0.02g/L，K⁺浓度为0.1g/L，Ca²⁺浓度为0.05g/L，Mg²⁺浓度为0.1g/L。

Claims (10)

1.一种亚硝酸菌的保藏方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将亚硝酸菌培养至亚硝化率达80%以上，并收集菌体；

（2）配制亚硝酸菌保藏营养液；

（3）步骤（1）收集的亚硝酸菌体与步骤（2）配制的亚硝酸菌保藏营养液混合，pH为7.5～8.5，含水率为40%～80%，含水率指亚硝酸菌保藏体系中水的重量含量；

（4）添加保藏剂；

（5）低温冷冻保藏。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，亚硝酸菌培养采用间歇式活性污泥法。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，亚硝酸菌培养条件为温度30～40℃，pH为7.0～8.5，溶解氧为1.0～5.0mg/L，培养至氨氮去除率达99%、亚硝化率达80%以上时收集菌体。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，亚硝酸菌培养至亚硝化率达80%以上时，通过沉降、过滤或离心方法收集亚硝酸菌体。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，亚硝酸菌保藏营养液中含有（NH₄)₂SO₄，同时含有微量物质FeSO₄、KH₂PO₄、MgCl₂和CaCl₂。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，亚硝酸菌与保藏营养液混合后，采用碳酸氢钠、碳酸钠或氢氧化钠调节pH。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，亚硝酸菌与保藏营养液混合物中，NH₄ ⁺-N浓度为0.1～1.5g/L，Fe²⁺浓度为0.01～0.06g/L，K⁺浓度为0.05～0.5g/L，Ca²⁺浓度为0.01～0.1g/L，Mg²⁺浓度为0.05～0.5g/L。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，保藏剂是二甲亚砜。

9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，保藏剂用量为亚硝酸菌加入营养液后混合物体积的2%～5%。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，低温冷冻保藏温度为-20℃～-70℃。