CN113671178A - 基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪瘟病毒抗体检测试纸及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明设计一种基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸及制备方法，该试纸包括支撑底板，在支撑底板上按顺序依次固定有样品垫、金标蛋白垫、层析检测膜和吸水垫；其中金标蛋白垫由玻璃纤维棉包被，固定有胶体金标记的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白；层析检测膜为硝酸纤维素膜，其上设置有检测线和质控线，其中检测线上固定有葡萄球菌蛋白A，质控线上固定有抗非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。该试纸特异、敏感、快捷、简便，可用于ASFV血清学诊断和流行病学调查，易于在生产实践中推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸及制备方法，属于免疫检测技术领域。
背景技术
病原的抗体检测是评价动物是否感染某种病原的主要手段。病毒侵入机体后，体内会产生相应的特异性抗体，通过检测血液样本中的特异性抗体的存在及含量，可间接判断病毒感染情况。和直接检测病原方法比，抗体检测的血液标本更易获取且标本质量有保证，检测灵敏度高，在疫病检测和监测方面不易漏检。目前用于抗体检测的方法主要是酶联免疫吸附试验(ELISA)，但ELISA检测方法不仅需要专门仪器，且操作繁琐，时间长。胶体金免疫层析技术作为一种新型免疫层析技术，具有操作简单、10min左右出结果方便快捷、准确、判断直观等优点，广泛应用于医学检测和临床诊断，已成为目前快速检测的主要方向，具有广阔的应用前景。
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASF virus，ASFV)引起的一种猪的急性、高致死性传染病。我国2018年8月首次报告疫情来，该病严重威胁我国生猪养殖及相关产业。由于养殖地区环境污染、传染源与污染源尚未彻底消除，非洲猪瘟病毒污染环节和传播环节多样化，同时面临着非洲猪瘟病毒基因缺失毒株这一新的传染源，非洲猪瘟疫情形势十分严峻。根除非洲猪瘟是我国生猪产业生存和发展的必由之路，建立非洲猪瘟抗体快速检测技术对于检测、监测疫情，最终实现净化具有重要意义。
ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，为大型双链DNA病毒，主要在巨噬细胞胞质中复制，其基因组约170-193kb，含有150-167个开放阅读框，编码150-200种蛋白质。目前已知功能的病毒编码蛋白约有50个，大部分为病毒的结构蛋白，其中由ASFVORF B646L基因编码的p72是ASFV的重要抗原蛋白，是病毒二十面体的主要成分，约占蛋白总量的三分之一，对于病毒衣壳的形成至关重要。对受感染存活猪的血清中抗体分析发现病毒衣壳蛋白p72是免疫***所识别的病毒主要抗原之一，可诱导机体产生特异性的体液免疫应答，且蛋白序列高度保守。有关研究表明，在不同地区由ASFV毒株诱导的p72抗体的相应抗原表位均相当保守，在血清学检测中，正确折叠的三聚体蛋白p72抗原是最具免疫原性的ASFV蛋白之一，是理想的检测靶标。
目前ASF防控中无疫苗和治疗性药物，因此对感染动物的早期检测对于控制该病的暴发及传播极其重要。为了满足非洲猪瘟病毒抗体的实时精准检测需求，我们建立了一种ASFV抗体检测胶体金免疫层析试纸条，能够用于检测可疑猪血清中的病毒抗体，适合现场ASFV血清学诊断、流行病学调查。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸及制备方法，该试纸特异、敏感、快捷、简便，可用于ASFV血清学诊断和流行病学调查，易于在生产实践中推广应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸，包括支撑底板，在支撑底板上按顺序依次固定有样品垫、金标蛋白垫、层析检测膜和吸水垫；其中金标蛋白垫由玻璃纤维棉包被，固定有胶体金标记的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白；层析检测膜为硝酸纤维素膜，其上设置有检测线和质控线，其中检测线上固定有葡萄球菌蛋白A，质控线上固定有抗非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。
所述胶体金标记的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的制备方法为：取1mL胶体金溶液，加入2μL 0.2mol/L K2CO3及120μL的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白，室温反应5-10min后，加入3％酪蛋白溶液100μL，室温封闭10min，以12 000r/min的速度离心25min，弃上清，加入100μL的含1.2wt％BSA、0.05wt％叠氮钠的PBS缓冲液重悬，即得。
所述胶体金溶液的制备方法为：取100mL超纯水，加入1mL 10g/L的氯金酸煮沸；在加热搅拌状态下迅速加入新鲜配制的1.6mL 10g/L的柠檬酸三钠溶液，观察颜色由无色→蓝色→深红色→亮红色，直至颜色不再发生变化，待溶液冷却至室温，用超纯水定容至100mL，4℃避光保存。
所述非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的制备方法为：
根据GenBank:MK333180.1获取编码p72蛋白的基因序列B646L和其伴侣蛋白基因序列B602L，分别在蛋白N段添加His和Flag标签，构建pCMV载体，进行密码子优化，交由上海生工生物工程有限公司合成，得到两个质粒，分别命名为pCMV-B646L和pCMV-B602L；
将两个质粒共转染到HEK293F细胞，HEK293F细胞的密度为2.0×106cells/mL，培养72h后以100g/min的转速离心10min收取细胞；弃去培养液后，加入400mM NaCl和20mMHEPES Buffer重悬细胞沉淀，进行超声破碎，超声3s间隔4s，共超声20min；然后以12000rpm/min的转速离心15min；
收集离心后的上清，经0.45um滤膜过滤后，使用Ni-NAT亲和层析柱，经100mM的咪唑洗去杂质，300mM的咪唑洗脱纯化后，再经超滤浓缩及凝胶过滤层析纯化处理后，分离得到非洲猪瘟病毒p72重组蛋白，分装后于-80℃保存备用。
所述抗非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的多克隆抗体制备方法为：
以权利要求4制备的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白为免疫原免疫健康新西兰兔，首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，以200μg/只的剂量皮下多点注射；每次加强免疫间隔3周，以弗氏不完全佐剂乳化抗原进行注射；最后一次加强免疫2周后，将非洲猪瘟病毒p72重组蛋白以1.6μg/mL的浓度，每孔50μL的用量包被酶联免疫吸附板，用ELISA方法测定免疫血清抗体效价；当效价达到1:6.4×104时，采集高免兔全血，37℃放置2h后，于4℃分离血清，以3000rpm/min的速度离心10min，收取上清；
取1mL上清，将上清逐滴加入10mL含18％(wt)的无水硫酸钠溶液中，于37℃温箱静置2h，以10000r/min的速度离心20min，弃上清；取沉淀用1mL的超纯水重悬，用生理盐水进行透析，换液3-4次，即得，分装后冻存，备用。
所述的胶体金免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤：
(1)层析检测膜的制备
将硝酸纤维素检测膜切成2.5×30cm的长条，置于喷点仪平台上，并以压条固定；使用0.1mol/L Tris-Hcl缓冲液稀释葡萄球菌蛋白A至浓度为1mg/mL，以1μL/cm的量喷涂于硝酸纤维素膜，为检测线T印迹；用pH为7.2的PBS溶液将抗非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的多克隆抗体的浓度稀释到1mg/mL，以1μL/cm的量喷涂于硝酸纤维素膜，为质控线C印迹；检测线与质控线相距0.5cm；于42℃干燥4h，加干燥剂室温密闭保存备用；
(2)样品垫的制备
将玻璃棉切成1.8×30cm的长条，先经样品垫处理液浸泡后，再置45℃干燥箱干燥30min，加干燥剂室温密闭保存备用；其中样品垫处理液为含有10g/L BSA、5g/L Tween20、3g/L NaN3O的0.1mol/L的PBS溶液；
(3)金标蛋白垫的制备
将胶体金标记的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白按照4μL/cm的量喷涂于金标垫，于45℃干燥1h，加干燥剂室温密闭保存备用；
(4)吸水垫的制备
将吸水纸切成2.5×30cm的长条，加干燥剂室温密闭保存备用；
(5)支撑板的制备
将双面胶贴于PVC支撑板，切成7.5×30cm的长板，制备支撑板；
(6)试纸的组装
手工或利用试纸装配仪，在支撑底板上按顺序依次固定上样品垫、金标蛋白垫、层析检测膜、吸水垫；先将检测膜粘贴于支撑板中央，然后自上而下将吸水纸粘贴于靠近质控线的检测膜端，将金标蛋白垫和样品垫依次粘贴于靠近检测膜的检测线端，各层间重叠2mm；利用切割仪将装配好的试纸板切成宽度为0.25cm的试纸条，干燥密封保存。
所述的胶体金免疫层析试纸在制备非洲猪瘟病毒感染诊断试剂中的应用。
所述的胶体金免疫层析试纸在制备生猪贸易检疫检验试剂中的应用。
所述的胶体金免疫层析试纸在流行病学调查中的应用。
本发明有益效果
本发明以胶体金作为标记示踪物，利用抗原抗体反应和侧向层析方法对样品进行检测。标记后的复合物和抗体结合稳定，颜色鲜明、肉眼可见，在抗体检测方面，极具优势，是一种理想的非洲猪瘟抗体检测方法。
本发明采用共转染ASFV p72基因及其伴侣蛋白基因的方法获取正确折叠的ASFV-p72重组蛋白，使用凝胶过滤层析方法纯化获得p72蛋白正确稳定的三聚体形式，进一步使用折叠正确的p72蛋白进行胶体金标记，制备了抗体检测胶体金免疫层析试纸，提高了检测的灵敏度，降低了非特异反应。
本发明选用ASFV-p72重组蛋白为检测靶标，是非洲猪瘟病毒最具免疫原性的抗原，也是最早被鉴定出在自然感染后诱导抗体的病毒蛋白之一。与以往采用原核表达***等其他***获取的p72蛋白不同，我们不仅利用能够指导蛋白质的正确折叠，且完成多种翻译后加工功能的哺乳动物细胞表达***，且同时表达帮助其正确折叠的分子伴侣蛋白，在此基础上所获得的重组蛋白与哺乳动物体内的病毒蛋白具有相似的抗原性、免疫原性和高生物活性，无论在免疫角度还是胶体金标记层面均具有优势。
本发明利用ASFV-p72重组蛋白作为抗原制备的快速检测非洲猪瘟病毒抗体的胶体金免疫层析试纸，能够准确、快速的检测待测血清中是否存在非洲猪瘟病毒抗体，检测时间小于10min，且检测特异性强，灵敏度高，是一种携带方便、快速、准确检测非洲猪瘟病毒抗体的产品。能够较好满足不同层次、场合人员的需要，如疫病监测、海关检疫、卫生防疫、养殖等，具有推广应用价值和较大的经济、社会效益。可用于ASFV感染诊断试剂、生猪贸易检疫检验试剂的制备，及流行病学的调查研究。
附图说明
图1是纯化的ASFV-p72重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。
其中，(a)为纯化的ASFV-p72重组蛋白通过凝胶过滤层析柱的洗脱图谱；(b)为洗脱图谱对应样品的SDS-PAGE分析。图中峰3所得的蛋白通过凝胶过滤层析获取了具有天然构象的三聚体蛋白。峰1、峰2在后续的标记过程中均存在不佳反应。
图2是为本发明非洲猪瘟抗体检测的胶体金免疫层析试纸的整体结构示意图。
图中，1为支撑底板，2为样品垫，3为金标蛋白垫，4为层析检测膜，5为吸水垫，6为检测线，7为质控线。
图3是本发明非洲猪瘟抗体检测的胶体金免疫层析试纸的检测结果示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明所用生物材料及来源：
1)感受态细胞：E.coli DH5α购自全式金生物技术有限公司；
2)质粒：使用的pCMV载体来自上海生工生物工程有限公司；
3)细胞和培养基：HEK293F细胞、培养基和转染试剂购自北京义翘神州科技股份有限公司；
4)试剂盒：无内毒素质粒大提试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；
本发明所使用的仪器设备如无特别说明，均为市售常规仪器设备；所用其他试剂材料，如无特别说明，均为市售常规试剂材料；重组质粒的合成服务由上海生工生物工程有限公司提供。
实施例1 ASFV-p72重组蛋白的制备
根据GenBank:MK333180.1获取编码p72蛋白的基因序列B646L和其伴侣蛋白基因序列B602L，分别在蛋白N段添加His和Flag标签，构建pCMV载体，进行密码子优化，交由上海生工生物工程有限公司合成，得到两个质粒，分别命名为pCMV-B646L和pCMV-B602L。
将两个质粒共转染到HEK293F细胞(密度为2.0×106cells/mL)，培养72h后以100g/min的转速离心10min收取细胞，弃去培养液后，加入含有400mM NaCl和20mM HEPESBuffer重悬细胞沉淀，进行超声破碎，超声3s间隔4s，共超声20min。然后以12000rpm/min的转速离心15min。离心后的上清经0.45um滤膜过滤后，使用Ni-NAT亲和层析柱，经100mM的咪唑洗杂，300mM的咪唑洗脱；洗脱所得目的蛋白使用超滤离心管进行浓缩(至蛋白浓度为3mg/mL)，浓缩后的样品通过凝胶过滤预装柱(Superdex 200Increase 10/300GL)处理，并根据蛋白大小分离蛋白，收集具有正确空间结构的三聚体目的蛋白，即ASFV-p72重组蛋白。
所述三聚体目的蛋白的空间结构是由三个p72分子形成稳定的三聚体形式，每个p72包含两个串联的卷筒蛋糕样结构域，每个结构域由8个β折叠片组成。
取适量ASFV-p72重组蛋白样品进行SDS-PAGE检测(图1)，纯度达到98％，测定蛋白浓度，浓度在0.8mg/mL上下，分装后-80℃保存备用，用于后续免疫层析试纸的制备。
由图1可知，亲和层析纯化的重组蛋白p72以多种聚集形式存在，通过凝胶过滤层析将其不同聚集形式的目的蛋白进行分离，所收集的每个峰对应的SDS PAGE分析结果均为p72，将三者分别拿去进行胶体金标记，峰1和峰2对应的蛋白均出现板结现象，只有峰3对应的样品能够很好的维持胶体金的胶体状态。其中，图1a中峰3对应的横坐标为收集时的体积11.55mL处，根据凝胶过滤预装柱的特性及其Marker绘制标准曲线分析11.55mL处对应蛋白大小为180kDa，与已有文献报道一致，即收集峰3区域对应样品，我们成功制备出具有三聚体形式的重组蛋白，即具有正确构象的天然结构。用于胶体金试纸的研制，实验结果良好。
实施例2抗ASFV-p72重组蛋白多克隆抗体的制备
以纯化的ASFV-p72重组蛋白为免疫原免疫2.0kg左右健康新西兰兔，首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，以200μg/只的剂量皮下多点注射；每次加强免疫间隔3周，以弗氏不完全佐剂乳化抗原进行注射。最后一次加强免疫2周后，将ASFV-p72重组蛋白以1.6μg/ml的浓度，50μL每孔的用量包被酶联免疫吸附板，用ELISA方法测定免疫血清抗体效价。效价达到1:6.4×104，采集高免兔全血，放置37℃2h后，于4℃分离血清，3000rpm/min离心10min收取上清，即得兔抗ASFV-p72重组蛋白的多克隆抗体。
多克隆抗体的纯化：以1mL多抗血清为例，配制10mL含18％(wt)无水硫酸钠溶液，在室温下搅拌至充分溶解；将多抗血清逐滴加入无水硫酸钠溶液中，37℃温箱静置2h后，10000r/min离心20min，弃上清；取沉淀用1mL的超纯水重悬，用生理盐水进行透析，换液3-4次，得到纯化后的抗ASFV-p72重组蛋白多克隆抗体。
以分光光度计法测定纯化后多克隆抗体蛋白的含量为8mg/mL用ELISA试验方法测定纯化后多克隆抗体的效价为1:64000，分装，冻存，用于后续免疫层析试纸质控线C印迹的印制。
实施例3非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸的制备
(1)胶体金溶液的制备
取100mL超纯水于500mL洁净的烧杯中，加入1mL 10g/L氯金酸煮沸；在加热搅拌状态下迅速加入新鲜配制的1.6mL 10g/L柠檬酸三钠溶液，观察颜色由无色→蓝色→深红色→亮红色，直至颜色不再发生，待溶液冷却至室温，用超纯水定容至100mL，4℃避光保存。
(2)ASFV-p72重组蛋白的胶体金标记
以1mL胶体金溶液为例，加入2μL 0.2mol/L K2CO3调节胶体金溶液的pH，加入120μL纯化的ASFV-p72重组蛋白室温反应5-10min，加入3％酪蛋白溶液100μL，室温封闭10min，12000r/min离心25min，弃上清，加入100μL的含1.2wt％BSA、0.05wt％叠氮钠的PBS缓冲液重悬，获得ASFV-p72重组蛋白的胶体金复合物溶液。
(3)层析检测膜的制备
将硝酸纤维素检测膜切成2.5×30cm的长条，置于XYZ3000喷点仪平台上，并以压条固定；使用0.1mol/L Tris-Hcl缓冲液稀释SPA至浓度为1mg/mL，利用Biojet Quanti3000以1μL/cm的量喷涂于硝酸纤维素膜，为检测线T印迹；用PBS(pH7.2)将抗重组蛋白ASFV-p72的多克隆抗体浓度稀释到1mg/mL，利用Biojet Quanti 3000以1μL/cm的量喷涂于硝酸纤维素膜，为质控线C印迹；检测线与质控线相距0.5cm；于42℃干燥4h；将检测膜置于自封袋中，加干燥剂密闭保存备用。
(4)样品垫的制备
将玻璃棉切成1.8×30cm的长条，使用含有BSA10g/L，Tween 20 5g/L，NaN3O 3g/L的0.1mol/L PBS溶液的样品垫处理液浸泡玻璃棉条；置45℃干燥箱干燥30min；将样品垫置塑料袋，加干燥剂室温密闭保存备用。
(5)金标蛋白垫的制备
将金标蛋白(步骤(2)制备的胶体金标记的ASFV-p72重组蛋白)按照4μL/cm的量喷涂于金标垫(由玻璃纤维棉包被)，于45℃干燥1h，抽真空加干燥剂密封保存备用。
(6)吸水垫的制备
将吸水纸切2.5×30cm的长条，加干燥剂室温密闭保存备用。
(7)支撑板的制备
将双面胶贴于PVC支撑板，切成7.5×30cm的长板，制备支撑板。
(8)试纸的组装
手工或利用LM5000试纸装配仪将上述材料装配成试纸板，在支撑底板上按顺序依次有样品垫、金标蛋白垫、层析检测膜、吸水垫。先将检测膜粘贴于支撑板中央，然后自上而下将吸水纸粘贴于靠近质控线的检测膜端，将金标蛋白垫和样品垫依次粘贴于靠近检测膜的检测线端，各层间重叠2mm。利用CM4000切割仪将装配好的试纸板切成宽度为0.25cm的试纸条，干燥密封保存(图2)。
检测反应原理：
当试纸样品端***待检测样品溶液后，待检溶液通过虹吸作用带动待检样品中抗原及金标蛋白一起向硝酸纤维素膜扩散，并最终渗透到滤纸层中。如果待检样品中含有ASFV-p72抗体，在扩散过程血清中的ASFV特异抗体与金标抗原结合，形成的抗原-抗体-胶体金复合物被检测线拦截，呈现红色检测线(T)，质控线拦截金标抗原后呈现红色质控线(C)；当被检血清中不含ASFV特异抗体时，检测线不显色，只呈现红色质控线。如果检测膜上没有标记显示，则表明试纸已失效，该检测结果无效。
实施例4对非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸初步应用
用实施例3制备的非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸进行血清样品检测，待测血清分别为：ASFV猪阳性血清、猪阴性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清猪瘟病毒(CSFV)阳性血清和猪流行性腹泻(PEDV)阳性血清，检测方法如下：
将样品使用生理盐水进行1：200稀释，将试纸条的检测端***待处理样品中，静置，任其沿着试纸自由扩散，10min内观察结果；
检测结果分为(如图3所示)：
试纸有效：在质控线(C)处出现红色线，说明本试纸有效。
阴性(-)：仅在质控线(C)处出现一条红色线，而检测线(T)处不出现红色线。
阳性(+)：在质控线(C)和检测线(T)处出现两条红色线(检测线和质控线)；检测线颜色深度与抗体水平在一定范围内成正比，抗体滴度越高检测线颜色越深。
具体检测结果与商品化ELISA抗体检测试剂盒完全一致，且与猪阴性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清、猪瘟病毒(CSFV)阳性血清和猪流行性腹泻(PEDV)阳性血清呈阴性反应；表明该试纸条能够准确检测ASFV阳性血清，与其他病毒阳性血清无交叉反应。
灵敏度检测：
以猪阴性血清为对照，将购自中国兽医药品监察所ASFV阳性参考血清，使用生理盐水进行倍比稀释：1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1：16000。检测结果显示，检测稀释倍数为1：16000的ASFV阳性血清时，所制备的试纸条检测线和质控线位置依旧同时出现两条反应带，与阴性对照明显不同，可判定为阳性；该阳性血清的IFA效价为1：4000，表明该非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸灵敏度高。
重复性及质量检测：
随机抽取不同批次的实施例3的方法制备的检测试纸条10根，分两组，不同的人员对相同的5份样品进行试纸检测，结果显示不同批次的样品均无差异，表明该非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸重复性良好，质量稳定。
将保存3个月的检测试纸条寄给合作实验室，该实验室针对两份核酸检测为阳性的样品进行抗体检测，抗体检测采用ELISA试剂盒和本试纸，结果均为阳性，且样品稀释到1：10000依旧检测为阳性，同样的样品，ELISA试剂盒仅在样品1：100稀释后检测为阳性。再次表明该非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析具有良好的灵敏性及稳定性。
Claims (9)
1.一种基于衣壳蛋白p72建立的非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸，其特征在于，包括支撑底板，在支撑底板上按顺序依次固定有样品垫、金标蛋白垫、层析检测膜和吸水垫；其中金标蛋白垫由玻璃纤维棉包被，固定有胶体金标记的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白；层析检测膜为硝酸纤维素膜，其上设置有检测线和质控线，其中检测线上固定有葡萄球菌蛋白A，质控线上固定有抗非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。
2.如权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述胶体金标记的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的制备方法为：取1mL胶体金溶液，加入2μL 0.2mol/L K2CO3及120μL的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白，室温反应5-10min后，加入3％酪蛋白溶液100μL，室温封闭10min，以12 000r/min的速度离心25min，弃上清，加入100μL的含1.2wt％BSA、0.05wt％叠氮钠的PBS缓冲液重悬，即得。
3.如权利要求2所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述胶体金溶液的制备方法为：取100mL超纯水，加入1mL 10g/L的氯金酸煮沸；在加热搅拌状态下迅速加入新鲜配制的1.6mL 10g/L的柠檬酸三钠溶液，观察颜色由无色→蓝色→深红色→亮红色，直至颜色不再发生变化，待溶液冷却至室温，用超纯水定容至100mL，4℃避光保存。
4.如权利要求2所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的制备方法为：
根据GenBank:MK333180.1获取编码p72蛋白的基因序列B646L和其伴侣蛋白基因序列B602L，分别在蛋白N段添加His和Flag标签，构建pCMV载体，进行密码子优化，交由上海生工生物工程有限公司合成，得到两个质粒，分别命名为pCMV-B646L和pCMV-B602L；
将两个质粒共转染到HEK293F细胞，HEK293F细胞的密度为2.0×106cells/mL，培养72h后以100g/min的转速离心10min收取细胞；弃去培养液后，加入400mM NaCl和20mM HEPESBuffer重悬细胞沉淀，进行超声破碎，超声3s间隔4s，共超声20min；然后以12000rpm/min的转速离心15min；
收集离心后的上清，经0.45um滤膜过滤后，使用Ni-NAT亲和层析柱，经100mM的咪唑洗去杂质，300mM的咪唑洗脱纯化后，再经超滤浓缩及凝胶过滤层析纯化处理后，分离得到非洲猪瘟病毒p72重组蛋白，分装后于-80℃保存备用。
5.如权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述抗非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的多克隆抗体制备方法为：
以权利要求4制备的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白为免疫原免疫健康新西兰兔，首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，以200μg/只的剂量皮下多点注射；每次加强免疫间隔3周，以弗氏不完全佐剂乳化抗原进行注射；最后一次加强免疫2周后，将非洲猪瘟病毒p72重组蛋白以1.6μg/mL的浓度，每孔50μL的用量包被酶联免疫吸附板，用ELISA方法测定免疫血清抗体效价；当效价达到1:6.4×104时，采集高免兔全血，37℃放置2h后，于4℃分离血清，以3000rpm/min的速度离心10min，收取上清；
取1mL上清，将上清逐滴加入10mL含18％(wt)的无水硫酸钠溶液中，于37℃温箱静置2h，以10000r/min的速度离心20min，弃上清；取沉淀用1mL的超纯水重悬，用生理盐水进行透析，换液3-4次，即得，分装后冻存，备用。
6.如权利要求1-5任一项所述的胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)层析检测膜的制备
将硝酸纤维素检测膜切成2.5×30cm的长条，置于喷点仪平台上，并以压条固定；使用0.1mol/L Tris-Hcl缓冲液稀释葡萄球菌蛋白A至浓度为1mg/mL，以1μL/cm的量喷涂于硝酸纤维素膜，为检测线T印迹；用pH为7.2的PBS溶液将抗非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的多克隆抗体的浓度稀释到1mg/mL，以1μL/cm的量喷涂于硝酸纤维素膜，为质控线C印迹；检测线与质控线相距0.5cm；于42℃干燥4h，加干燥剂室温密闭保存备用；
(2)样品垫的制备
将玻璃棉切成1.8×30cm的长条，先经样品垫处理液浸泡后，再置45℃干燥箱干燥30min，加干燥剂室温密闭保存备用；其中样品垫处理液为含有10g/L BSA、5g/L Tween20、3g/L NaN3O的0.1mol/L的PBS溶液；
(3)金标蛋白垫的制备
将胶体金标记的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白按照4μL/cm的量喷涂于金标垫，于45℃干燥1h，加干燥剂室温密闭保存备用；
(4)吸水垫的制备
将吸水纸切成2.5×30cm的长条，加干燥剂室温密闭保存备用；
(5)支撑板的制备
将双面胶贴于PVC支撑板，切成7.5×30cm的长板，制备支撑板；
(6)试纸的组装
手工或利用试纸装配仪，在支撑底板上按顺序依次固定上样品垫、金标蛋白垫、层析检测膜、吸水垫；先将检测膜粘贴于支撑板中央，然后自上而下将吸水纸粘贴于靠近质控线的检测膜端，将金标蛋白垫和样品垫依次粘贴于靠近检测膜的检测线端，各层间重叠2mm；利用切割仪将装配好的试纸板切成宽度为0.25cm的试纸条，干燥密封保存。
7.如权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸在制备非洲猪瘟病毒感染诊断试剂中的应用。
8.如权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸在制备生猪贸易检疫检验试剂中的应用。
9.如权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸在流行病学调查中的应用。
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