CN109254155A - 一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸及制备方法和应用 - Google Patents

一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸及制备方法和应用，属于病毒疫病诊断技术和动物检疫领域，包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫。其中胶体金垫内有胶体金标记的抗ASFV p30抗原的一个表位的单克隆抗体Mab1；硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，检测线为针对ASFVp30抗原另一表位的单克隆抗体Mab2，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。本发明建立的胶体金免疫层析试纸条具有方便、快速、灵敏和特异等优点，可用于感染ASFV细胞直接检测，适合ASFV感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验。

Description

一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸及制备方法 和应用
技术领域
本发明属于病毒疫病诊断技术和动物检疫领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟 病毒抗原胶体金免疫层析试纸及制备方法和应用。
背景技术
非洲猪瘟(ASF)是猪的一种高度接触性传染病，高致病性的ASFV感染家 猪后死亡率可达100％，该病一直在许多非洲国家流行，目前已传播到格鲁齐亚、 亚美尼亚、阿塞拜疆和俄罗斯等邻国，对我国养猪业的威胁十分巨大。由于目前 无疫苗用于ASF防疫，因此快速、准确的诊断对防止该病的传播、流行十分重 要。世界动物卫生组织(OIE)推荐的ASF诊断技术包括病原检测、核酸鉴定和 血清学试验。
在病原检测常用的技术中，血吸附试验是经典的ASF诊断方法之一，敏感性 较高，但需要临时制备和培养猪骨髓细胞，不仅费时、操作繁琐，而且不能用于 非血吸附性毒株的诊断；检测ASFV抗原的荧光抗体试验可用于可疑病猪组织和 白细胞样品的检测，不仅适用于非血吸附性毒株的鉴定，而且能与其它病毒感染 进行鉴别诊断，但需要制备冰冻切片或涂片，技术难度较大，而且只能在专门的 ASF诊断参考实验室进行。
ASFV核酸鉴定常用的方法为聚合酶链式反应(PCR)和实时定量PCR，这 些方法具有快速、灵敏等优点，还适合腐败样品的病毒检测，已成为主要的ASF 诊断技术，但需要较昂贵的仪器设备和防污染措施，有时检测结果需用序列测定 等方法验证。
在血清学检测技术中，ASFV感染猪在感染后7-10天即可产生特异抗体，并 能维持很长时间，所以可用间接免疫荧光和酶联免疫吸附法(ELISA)等方法检 测。其中，ELISA是OIE规定的国际贸易检验方法，但检测抗原需从病毒感染 细胞制备，病毒培养有导致病毒扩散风险，诊断可靠性也有待提高，结果需用免 疫印迹(Western-blotting)等方法验证。为了解决这些问题，国内外都在进行重 组抗原ELISA的尝试，法国和西班牙已有商品化试剂盒供应，但因重组抗原制 备难度较大，不仅试剂盒供应有限、价格昂贵，而且不同地区病毒株的检测结果 有待进一步验证。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明提供一种准确率高、检测效率高的检测非洲猪瘟 病毒抗原胶体金免疫层析试纸及制备方法和应用。
申请人研发出针对ASFV抗体的多抗原间接ELISA试剂盒和胶体金试纸， 经验证具有较高的检测准确率。
ASFV p30是由ASFV ORF CP204L编码的一大小为30kD的蛋白，在病毒感 染早期，胞浆内大量表达的p30氨基末端丝氨酸残基发生磷酸化后，被包装进病 毒粒子；p30抗原性极好，可诱导机体产生强烈的体液免疫应答，激发动物机体 产生具有一定中和作用的抗体。根据p30在细胞胞浆内表达早、表达量大的特点， 本发明用制备的两株针对p30不同表位的单克隆抗体，建立双抗体夹心ELISA 胶体金免疫层析试纸，检测细胞内p30，从而确诊动物是否感染ASFV。该胶体 金免疫层析试纸可在短时间内获得明确的诊断结果，并能用于猪外周血单核细胞、 ASFV体外感染细胞内p30抗原的检测，特别适合ASFV感染诊断、流行病学调 查和生猪国际贸易检疫检验。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
抗ASFV p30单克隆抗体Mab1，分泌单克隆抗体Mab1的杂交瘤细胞保藏 于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:C2018158，分类命名为：杂交瘤细胞株6G12，保藏日期为：2018.9.5；抗 ASFV p30单克隆抗体Mab1针对的抗原表位位于p30aa145-aa154。
抗ASFV p30单克隆抗体Mab2，分泌单克隆抗体Mab2的杂交瘤细胞保藏于 中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:C2018159，分类命名为：杂交瘤细胞株3H6，保藏日期为：2018.9.5；抗ASFV p30单克隆抗体Mab2针对的抗原表位位于p30aa145-aa154。
抗ASFV p30单克隆抗体Mab1和Mab2，分泌单克隆抗体Mab1的杂交瘤细 胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为： CCTCC NO:C2018158，分类命名为：杂交瘤细胞株6G12，保藏日期为：2018.9.5； 分泌单克隆抗体Mab2的杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国. 武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:C2018159，分类命名为：杂交瘤细胞 株3H6，保藏日期为：2018.9.5；抗ASFV p30单克隆抗体Mab1和Mab2针对的 抗原表位均位于p30aa145-aa154，且Mab1和Mab2具体针对的表位不同。
本发明要求分别保护单克隆抗体Mab1和Mab2及其组合。
本发明提供一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸，其特征在于： 包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维 素膜以及吸水垫；其中胶体金垫内有胶体金标记抗ASFV p30抗原的一个表位的 单克隆抗体Mab1；硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，检测线为针对ASFV p30抗原另一表位的单克隆抗体Mab2，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。
抗ASFV p30单克隆抗体Mab1和Mab2，分泌单克隆抗体Mab1的杂交瘤细 胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为： CCTCC NO:C2018158，分类命名为：杂交瘤细胞株6G12，保藏日期为：2018.9.5； 分泌单克隆抗体Mab2的杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国. 武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:C2018159，分类命名为：杂交瘤细胞 株3H6，保藏日期为：2018.9.5；抗ASFV p30单克隆抗体Mab1和Mab2针对的 抗原表位均位于p30aa145-aa154，且Mab1和Mab2具体针对的表位不同。
胶体金标记抗ASFV p30抗原的单克隆抗体Mab1，具体为：用直径40nm 的胶体金标记Mab1，标记时pH8.0，Mab1标记浓度为10μg/mL；离心沉淀胶体 金标记物，用pH 8.5的复溶液溶解浓缩沉淀，复溶液由10％蔗糖，1％PVP，1％BSA， 0.5％Tween-20，0.1M TrisCl组成，复溶液浓缩比例为125μL/mL，最终胶体金复 合物喷涂于胶体金垫内，喷涂量为15μL/cm。
检测线的ab2工作浓度为1.6mg/mL，质控线的抗鼠IgG抗体工作浓度为 1.5mg/ml，Mab2抗体和羊抗鼠IgG抗体划膜时喷涂量均为1μL/cm，且检测线与 质控线之间距离为0.5cm。
一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸的制备方法，包括如下步骤：
1)SFVp30抗原单克隆抗体的制备、表位区域及抗体亚类鉴定；
2)检测ASFV p30抗原胶体金免疫层析试纸制备。
步骤2)具体为：标记p30单克隆抗体Mab1的胶体金垫制备；硝酸纤维素膜检 测线和质控线喷涂；试纸条组装。
检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸在制备ASFV感染诊断、流行病 学调查和生猪国际贸易检疫检验的试剂中的应用。
具体地，一种检测ASFV抗原胶体金免疫层析试纸制备方法包括以下步骤：
1.抗ASFVp30抗原单克隆抗体的制备、表位区域及抗体亚类鉴定
(1)p30重组抗原的制备
人工合成密码子优化了的ASFV p30基因
catatgGACTTCATCCTGAACATCTCTATGAAAATGGAAGTTATCTTCAAAACC GACCTGCGTTCTTCTTCTCAGGTTGTTTTCCACGCTGGTTCTCTGTACAACT GGTTCTCTGTTGAAATCATCAACTCTGGTCGTATCGTTACCACCGCTATCAA AACCCTGCTGTCTACCGTTAAATACGACATCGTTAAATCTGCTCACATCTAC GCTGGTCAGGGTTACACCGAACACCAGGCTCAGGAAGAATGGAACATGAT CCTGCACGTTCTGTTCGAAGAAGAAACCGAATCTTCTGCTTCTTCTGAATCT ATCCACGAAAAAAACGACAACGAAACCAACGAATGCACCTCTTCTTTCGA AACCCTGTTCGAACAGGAACCGTCTTCTGAAGAACCGAAAGACTCTAAAC TGTACATGCTGGCTCAGAAAACCGTTCAGCACATCGAACAGTACGGTAAAG CTCCGGACTTCAACAAAGTTATCCGTGCTCACAACTTCATCCAGACCATCCACGGTACCCCGCTGAAAGAAGAAGAAAAAGAAGTTGTTCGTCTGATGGTTATCAAACTGCTGAAAAAAAAAgtcgac(SEQ ID No.1)，NdeI、XhoI限制性内 切酶酶切后，***质粒pET30a(+)相应的酶切位点，构建重组质粒pET-p30，转 化感受态细胞BLR。按1∶100体积比，将携带质粒pET-p30的重组菌接种含 50μg/mL卡那霉素的2×YT培养基，37℃培养至OD600＝0.8，加入1mmol/L IPTG， 37℃诱导4h；8000rpm离心2min，离心得到的菌体用0.01MPBS溶液洗涤2 次，再次离心；再次离心得到的菌体用超声波仪裂解，超声波仪功率50W，10s/ 次，共10min；4℃、12000rpm离心20min，收集沉淀；采用Ni-NTA琼脂糖柱 纯化p30重组蛋白。
(2)抗p30单克隆抗体制备
用纯化的p30重组蛋白，免疫8周龄的BALB/c小鼠。首次免疫时，p30重 组蛋白与弗氏完全佐剂等体积乳化，腹腔接种小鼠，50μg p30蛋白/只；7天后 p30重组蛋白与弗氏不完全佐剂等体积乳化，第二次腹腔接种途径免疫小鼠， 50μg p30蛋白/只；7天后第三次小鼠腹腔途径直接免疫p30蛋白，50μg/只；免 疫后的第3天，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，HAT选择性培养基 培；10天后以重组p30为包被抗原，间接ELISA检测细胞上清，筛选阳性杂交 瘤。
(3)抗p30单克隆抗体针对的表位区域及抗体亚类鉴定
根据SEQ ID No.1基因序列，合成下列引物：
F15’-ATCATGGACTTCATCCTG-3’(SEQ ID No.2)
R1 5’-GCAActcgagAGAAGACGGTTCCTG-3’(SEQ ID No.3)
F2 5’-ATCTGGAACATGATCCTGC-3’(SEQ ID No.4)
R2 5’-CGAActcgagTTTTTTTTTCAGCAGTTTG-3’(SEQ ID No.5)
R3 5’-CGAActcgagGATAACTTTGTTGAAGTCC-3’(SEQ ID No.6)
R4 5’-CGAActcgagGGTTTTCTGAGCCAGCATG-3’(SEQ ID No.7)
R5 5’-CGAActcgagGTCTTTCGGTTCTTCAGAAG-3’(SEQ ID No.8)
R6 5’-CGAActcgag AGCTTTACCGTACTGTTCG-3’(SEQ ID No.9)
以pET-p30质粒为模板，分别用引物F1/R1、F2/R2、F1/R3、F1/R4、F1/R5、 F1/R6PCR扩增出相应的DNA片段，所用DNA聚合酶DNA聚 合酶，PCR产物经限制性内切酶XhoI酶切后，***质粒pET30a(+)EcoRV和XhoI 酶切位点，构建的重组质粒分别转化受态细胞BLR，利用上述方法诱导重组菌 上述***基因；裂解细菌，菌体蛋白SDS-PAGE电泳后转印硝酸纤维素膜，进 行免疫印迹实验，确定筛选出的单克隆抗体Mab1、Mab2所针对的表位均位于 p30aa145-aa154。以重组p30为包被抗原，采用间接ELISA法相加试验，计算相 加指数(AI)，确定单克隆抗体Mab1、Mab2分别针对不同的抗原表位。
用小鼠单克隆抗体Ig类/亚类鉴定ELISA试剂盒鉴定所获的单克隆抗体亚类， 确定单克隆抗体Mab1、Mab2均为小鼠IgG1亚类抗体，轻链均为κ链。
(4)Mab1、Mab2腹水制备
8周龄的BALB/c小鼠腹腔注射无菌液体石蜡，0.5mL/只；1周后，小鼠腹 腔分别注射分泌Mab1、Mab2的杂交瘤细胞，106个细胞/只，6天后收集腹水， 12000rpm离心去除细胞及脂肪，用Protein G亲和层析柱纯化后，超滤离心管离 心除盐，用等体积0.005％pH7.0的NaCl溶液复溶，-70℃冰箱保存。
2.检测ASFV p30抗原胶体金免疫层析试纸制备
(1)标记p30单克隆抗体Mab1的胶体金垫制备
Mab1腹水用直径40nm的胶体金标记Mab1，标记时pH8.0，Mab1标记浓 度为10μg/mL；离心沉淀胶体金标记物，用复溶液(10％蔗糖，1％PVP，1％BSA， 0.5％Tween-20，0.1MTrisCl，pH 8.5)溶解浓缩沉淀，复溶液浓缩比例为125μL/mL。 用喷金划膜一体机将浓缩后的胶体金复合物喷涂于胶体金垫内，喷涂量为 15μL/cm，自然干燥。
(2)硝酸纤维素膜检测线和质控线喷涂
在硝酸纤维素膜表面用喷金划膜一体机喷涂检测线(T)和质控线(C)，检 测线为针对ASFVp30抗原的单克隆抗体Mab2，质控线为羊抗小鼠IgG抗体； Mab2工作浓度为1.6mg/mL，羊抗鼠IgG抗体工作浓度为1.5mg/ml，两者划膜 时喷涂量均为1μL/cm，且检测线与质控线之间距离0.5cm。
(3)试纸条组装
PVC底板粘面朝上，将硝酸纤维素膜粘在PVC板中间位置；然后将金标垫 粘附于硝酸纤维素膜前，两者重叠0.2cm；再在金标垫前、硝酸纤维素膜后分别 将样品垫、吸水垫粘附在PVC底板上，样品垫、吸水垫分别和金标垫、硝酸纤 维素膜重叠0.2cm。切条机将组装好的PVC板及附着物切成0.4cm宽度的试纸 条，装入塑料卡内。
本发明不限于用本检测方法检测的ASFV产生的抗原，亦包括其它的可用于 ASFV检测的双抗体夹心胶体免疫层析技术。抗体标记可以替换成酶标记等其它 标记方法，重组抗原和单克隆抗体的序列和针对的病毒蛋白可以替换为其它序列、 针对不同的病毒蛋白。
本发明的一种检测ASFV抗原胶体金免疫层析试纸适用于猪外周血单核细 胞、猪***以及ASFV体外感染细胞内p30抗原的检测，可在短时间内诊断出 ASFV感染，特别适合现场ASFV感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫 检验。
附图说明
图1 Mab1针对p30抗原表位鉴定示意图；
M.蛋白分子质量标准，1.p30 aa1-aa128，2.p30 aa125-aa194，3.p30 aa1-aa161，4.p30 aa1-aa144，5.p30 aa1-aa134，6.p30 aa1-aa154；
图2 Mab2针对p30抗原表位鉴定示意图；
M.蛋白分子质量标准，1.p30 aa1-aa128，2.p30 aa125-aa194，3.p30 aa1-aa161，4.p30 aa1-aa144，5.p30 aa1-aa134，6.p30 aa1-aa154；
图3胶体金免疫层析试纸组装示意图；
A.胶体金免疫层析试纸内部右侧示意图；B.胶体金免疫层析试纸内部正面示 意图；C.包装塑料外壳的胶体金免疫层析试纸；
1.PVC底板，2.吸水垫，3.硝酸纤维素膜，4.胶体金垫，5.样品垫，6.塑料外 壳，7.质控线，8.检测线，9.加样孔；
图4胶体金免疫层析试纸最低检测灵敏度测定结果图；
图5胶体金免疫层析试纸检测ASFV体外感染细胞内的p30抗原结果图；
图6胶体金免疫层析试纸检测特异性试验结果图；
图7胶体金免疫层析试纸田间血清样品试验结果图；
图8胶体金免疫层析试纸田间组织样品试验结果图；
分泌单克隆抗体Mab1的杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址： 中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:C2018158，分类命名为：杂交 瘤细胞株6G12，保藏日期为：2018.9.5；分泌单克隆抗体Mab2的杂交瘤细胞保 藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:C2018159，分类命名为：杂交瘤细胞株3H6，保藏日期为：2018.9.5。
具体实施方式
为了阐述本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图说明及具体实施方式 对本发明做进一步的介绍。
生物材料来源：
大肠杆菌表达载体pET30a(+)：购于Novogen公司(Cat No.69909.3)；
真核表达载体pcDNA3.0：购于Invitrogen公司；
ASFV p30真核表达载体pcDNA-p30：本实验室构建；
大肠杆菌(E.coli)BLR感受态细胞：购于北京华越洋生物(Cat No，C345001)；
PK15细胞、Marc-145细胞、SP2/0细胞：本实验室保存；
Goat Anti-mouse IgG H&L(Alexa)，即羊抗鼠IgG：购于Abcam 公司(CatNo,ab150169)；
ASFVGenotype II(Russian)感染的COS-1细胞：由俄联邦病毒学与微生物学研 究中心提供；
猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)弱毒疫苗： 购于广东永顺生物制药有限公司；
猪2型圆环病毒(PCV-2)：扬州大学传染病教研室高崧教授惠赠；
猪瘟病毒(CSFV)T株：购于中国兽医药品监察所。
实施例1检测ASFV抗原胶体金免疫层析试纸制备
1.p30重组抗原的制备
人工合成并进行密码子优化的ASFV p30基因(SEQ ID No.1)***质粒 pET30a(+)，构建重组质粒pET-p30，转化感受态细胞BLR。按1∶100体积比， 将携带质粒pET-p30的重组菌接种含50μg/mL卡那霉素的2×YT培养基，37℃培 养至OD600＝0.8，加入1mmol/LIPTG，37℃诱导4h；8000rpm离心2min，离心 得到的菌体用0.01M PBS溶液洗涤2次，再次离心；再次离心得到的菌体用超 声波仪裂解，超声波仪功率50W，10s/次，共10min；4℃、12000rpm离心20min， 收集沉淀；采用Ni-NTA琼脂糖柱纯化p30重组蛋白。
2.抗p30单克隆抗体制备
用纯化的p30重组蛋白，免疫8周龄的BALB/c小鼠。首次免疫时，p30重 组蛋白与弗氏完全佐剂等体积乳化，腹腔接种小鼠，50μgp30蛋白/只；7天后p30 重组蛋白与弗氏不完全佐剂等体积乳化，第二次腹腔接种途径免疫小鼠，50μgp30 蛋白/只；7天后第三次小鼠腹腔途径直接免疫p30蛋白，50μg/只；免疫后的第3 天，取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，HAT选择性培养基培；10天 后以重组p30为包被抗原，间接ELISA检测细胞上清，筛选阳性杂交瘤。
3.抗p30单克隆抗体针对的表位区域及抗体亚类鉴定
根据SEQ ID No.1基因序列，合成下列引物：
F1 5’-ATCATGGACTTCATCCTG-3’(SEQ ID No.2)
R1 5’-GCAActcgagAGAAGACGGTTCCTG-3’(SEQ ID No.3)
F2 5’-ATCTGGAACATGATCCTGC-3’(SEQ ID No.4)
R2 5’-CGAActcgagTTTTTTTTTCAGCAGTTTG-3’(SEQ ID No.5)
R3 5’-CGAActcgagGATAACTTTGTTGAAGTCC-3’(SEQ ID No.6)
R4 5’-CGAActcgagGGTTTTCTGAGCCAGCATG-3’(SEQ ID No.7)
R5 5’-CGAActcgagGTCTTTCGGTTCTTCAGAAG-3’(SEQ ID No.8)
R6 5’-CGAActcgag AGCTTTACCGTACTGTTCG-3’(SEQ ID No.9)
以pET-p30质粒为模板，分别用引物F1/R1(p30 aa1-aa128)、F2/R2(p30 aa125-aa194)、F1/R3(p30 aa1-aa161)、F1/R4(p30 aa1-aa144)、F1/R5(p30 aa1-aa134)、F1/R6(p30 aa1-aa154)PCR扩增出相应的DNA片段，所用DNA 聚合酶DNA聚合酶(宝生物工程有限公司)，PCR产物经限制 性内切酶XhoI酶切后，***质粒pET30a(+)EcoRV和XhoI酶切位点，构建的重 组质粒分别转化受态细胞BLR，利用上述方法诱导重组菌上述***基因；裂解 细菌，菌体蛋白SDS-PAGE电泳后转印硝酸纤维素膜，进行免疫印迹实验，确定筛选出的单克隆抗体Mab1、Mab2所针对的表位均位于p30aa145-aa154(图1、 2)。以重组p30为包被抗原，采用间接ELISA法相加试验，计算相加指数(AI)， 确定单克隆抗体Mab1、Mab2分别针对不同的抗原表位。
用小鼠单克隆抗体Ig类/亚类鉴定ELISA试剂盒(上海士锋生物科技有限公 司)鉴定所获的单克隆抗体亚类，确定单克隆抗体Mab1、Mab2均为小鼠IgG1 亚类抗体，轻链均为κ链。
4.Mab1、Mab2腹水制备
8周龄的BALB/c小鼠腹腔注射无菌液体石蜡，0.5mL/只；1周后，小鼠腹 腔分别注射分泌Mab1、Mab2的杂交瘤细胞，106个细胞/只，6天后收集腹水， 12000rpm离心去除细胞及脂肪，用Protein G亲和层析柱(GE公司)纯化后， 超滤离心管(Millipore)6000rpm离心30min除盐，用等体积0.005％pH7.0的 NaCl溶液复溶，-70℃冰箱保存，准备用于下面胶体金的标记及划膜。
5.标记p30单克隆抗体Mab1的胶体金垫制备
(1)Mab1标记胶体金最佳pH确定：1.5mL指形管中分装1mL直径40nm 的胶体金溶液(潍坊百诺迪生物科技有限公司)，共9管，加入0.2mol/L盐酸 溶液或0.2mol/L K2CO3溶液，精密pH试纸测定胶体金溶液pH，使指形管中溶 液pH值按顺序分别为pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、 pH8.5、pH9.0；加入20μg的ASFV p54重组蛋白，混匀静置1h；再加入100μL 10％ 的NaCl，静置10min后观察结果，溶液的颜色没有变化的即为胶体金标记抗原 的最适pH值。经测定Mab1标记胶体金最佳pH值为8.0。
(2)Mab1与胶体金最佳标记浓度确定：0.005mol/L NaCl溶液将Mab1浓 度调成200μg/mL，分别取10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、 90μL的重组蛋白溶液以及0.005mol/L NaCl溶液加入装有1mL胶体金的指形管 中；根据上述结果，加入0.2mol/LK2CO3调至最佳pH值，混匀静置1h；再在上 述各管内分别加入100μL 10％NaCl，静置10min后，观察胶体金溶液颜色的变 化，如果颜色不变，此时加入的重组蛋白最小量能使胶体金稳定。经测定Mab1 与胶体金最佳标记浓度为10μg/mL。
(3)Mab1胶体金标记：用0.2mol/L K2CO3溶液调节胶体金溶液至pH8.0， 加入适量的200μg/mL Mab1溶液至终浓度为10μg/mL，搅拌30min；缓慢加入适 量的10％BSA，使其终浓度为1％，搅拌30min；然后将该溶液1000rpm 4℃离 心15min，取上清；再将上清12000rpm4℃离心30min，弃上清，沉淀用复溶 液(10％蔗糖，1％PVP，1％BSA，0.5％Tween-20，0.1MTrisCl，pH 8.5)溶解浓 缩沉淀，复溶液浓缩比例为125μL/mL。用Biodot XYZ3060喷金划膜一体机将浓 缩后的胶体金复合物喷涂于胶体金垫内(AlhStorm 8964)，喷涂量为15μL/cm，自然干燥。
6.硝酸纤维素膜检测线和质控线喷涂
在硝酸纤维素膜(Sartorius CN140)表面用喷金划膜一体机喷涂检测线(T) 和质控线(C)，检测线为针对ASFVp30抗原的单克隆抗体Mab2，质控线为羊 抗小鼠IgG抗体；Mab2工作浓度为1.6mg/mL，羊抗鼠IgG抗体工作浓度为 1.5mg/ml，两者划膜时喷涂量均为1μL/cm，且检测线与质控线之间距离0.5cm。
7.胶体金免疫层析试纸组装
(1)8cm宽的PVC底板粘面朝上(潍坊百诺迪生物科技有限公司)，将2.5cm 宽的固相硝酸纤维素膜黏附于中间；
(2)0.5cm宽的金标垫(AlhStorm 8964)粘附于硝酸纤维素膜前，与固相 硝酸纤维素膜重叠0.2cm；
(3)2.7cm宽的样品垫(潍坊百诺迪生物科技有限公司)粘附于金标垫前， 与金标垫重叠0.2cm；
(4)3.2cm宽的吸水垫(潍坊百诺迪生物科技有限公司)粘附于硝酸纤维 素膜后，与固相硝酸纤维素膜重叠0.2cm；
(5)微电脑自动斩切机(上海金标公司ZQ2000)切割成4mm宽的条带；
(6)条带装上保护性塑料外壳(潍坊百诺迪生物科技有限公司)。
8.胶体金免疫层析试纸结果判定
如果检测线(T)和质控线(C)均出现红色条带，则待检样品中ASFV抗 原判定为阳性；如果质控线(C)出现红色条带，检测线(T)处无红色条带， 则待检样品中ASFV抗原判定为阴性；如果质控线(C)处无红色条带，则该试 纸条失效。组装试纸条的结构和外观如图3所示。
实施例2胶体金免疫层析试纸最低检测灵敏度测定
将纯化的重组蛋白p30稀释成943μg/mL、9.43μg/mL、94.3ng/mL、0.943ng/mL， 分别吸取85μL的稀释液，加入试纸的加样孔中，5min内观察结果。结果显示四 种不同浓度的样品检测时，质控线和检测线均能出现红色条带，而0.943ng/mL 浓度的样品检测时检测线颜色稍浅(图4)，表明该胶体金免疫层析试纸最低能 检测80pg的ASFV p30蛋白。
实施例3胶体金免疫层析试纸检测猪血细胞内ASFV p30抗原
1.pcDNA-p30质粒转染PK15细胞
3μg pcDNA-p30真核表达质粒、9μL Lipofectamine2000(Invitrogen)分别溶 于500μL Opti-MEM培养基(Gibco)，室温静置20min，将两者混合后继续室温 静置5min；将6孔细胞培养板(Corning)中长至95％的PK15细胞培养基弃去， 无菌的PBS洗涤后，加入上述转染混合物，37℃5％CO2培养箱中静置4h；弃 去转染混合物，换成含1％胎牛血清的DMEM培养基(Gibco)，48h后胰酶消化 PK15细胞，离心沉淀细胞，灭菌PBS悬浮，同时设立pcDNA3.0空载体转染对 照组。
取少量悬浮细胞，加入等体积8％多聚甲醛固定10min，PBS洗涤细胞，离 心沉淀细胞；加入抗ASFV p30单克隆抗体Mab1，37℃作用30min，PBS洗涤 细胞3遍，离心沉淀细胞；加入稀释至工作浓度的Goat Anti-mouse IgG H&L (Alexa)荧光抗体，37℃作用30min，PBS洗涤细胞3遍；流式细胞 仪(CyAn ADP7)测定细胞转染效率为17.93％。
2.胶体金免疫层析试纸检测PK15细胞内ASFV p30抗原
PK15转染细胞经细胞计数后，离心沉淀细胞，弃去上清液，加入1％NP-40 (0.01MpH7.4 PBS配制)细胞裂解液，充***解细胞，并用细胞裂解液10倍 梯度稀释，分别吸取85μL细胞裂解产物，加入胶体金免疫层析试纸检测孔，5min 内观察结果。结果如表1所示，该胶体金免疫层析试纸最低可检出9.1×102个表 达ASFV p30细胞。
表1胶体金免疫层析试纸检测猪细胞内ASFV p30结果
3.胶体金免疫层析试纸检测猪血细胞内的ASFV p30抗原
(1)采集猪血，加入1/10体积的3.8％枸橼酸钠溶液，颠倒混匀；4个1.5mL 离心管中分别加入300μL上述抗凝血；再在离心管中分别加入如表2所示的不 同数量PK15细胞。
(2)3000rpm离心2min，弃去血浆上清，各加入900μL RBC裂解液(0.16M NH4Cl,0.13mM EDTA,12mM NaHCO3)，颠倒混匀后室温静置5min。
(3)3000rpm离心2min，弃去红细胞裂解上清。
(4)各加入85μL有核细胞裂解液(1％NP-40)，移液器吹吸裂解后，加入 胶体金免疫层析试纸加样孔，5min内观察结果。
表2猪血细胞中添加表达p30的PK15细胞检测结果
结果该胶体金免疫层析试纸最低可检出血细胞中9.1×103个表达ASFV p30 细胞。
实施例4胶体金免疫层析试纸检测ASFV体外感染细胞内的p30抗原
在6孔细胞培养板中用ASFVGenotype II(Russian)感染COS-1细胞，48h后 吸出细胞培养上清，加入3mL 1％NP-40细胞裂解液，移液器吹吸裂解细胞，吸 取85μL细胞裂解液，加入胶体金免疫层析试纸加样孔，5min内观察结果。检测 结果显示为阳性(图5)。
实施例5胶体金免疫层析试纸检测特异性试验
将PRV、PCV-2和CSFV T株分别接种24孔细胞培养板中长至95％的PK15 细胞，PRRSV接种24孔细胞培养板中长至90％的Marc-145细胞；48h后吸出 细胞培养上清，加入200μL 1％NP-40细胞裂解液，移液器吹吸裂解细胞，吸取 85μL细胞裂解液，加入胶体金免疫层析试纸加样孔，5min内观察结果。检测结 果显示为阴性(图6)。
实施例6胶体金免疫层析试纸田间样品试验
猪全血4份(qPCR检测为ASFV核酸阳性)，各取血清50μL，加入50μL 1％NP-40细胞裂解液，移液器吹吸裂解细胞，吸取85μL细胞裂解液，加入胶体 金免疫层析试纸加样孔，5min内观察结果，检测结果显示为阳性(图7)；4份 猪肺、脾、肾以及扁桃体(qPCR检测为ASFV核酸阴性)，各取200μg上述组 织，加入1mL无菌PBS，研磨后，吸取上清50μL，加入50μL1％NP-40细胞裂 解液，移液器吹吸裂解细胞，吸取85μL细胞裂解液，加入胶体金免疫层析试纸 加样孔，5min内观察结果，检测结果显示为阴性(图8)。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只 是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种 变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护 范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸及制备方法和应用
<130> xhx2018092501
<141> 2018-09-25
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 591
<212> DNA
<213> African swine fever virus
<400> 1
catatggact tcatcctgaa catctctatg aaaatggaag ttatcttcaa aaccgacctg 60
cgttcttctt ctcaggttgt tttccacgct ggttctctgt acaactggtt ctctgttgaa 120
atcatcaact ctggtcgtat cgttaccacc gctatcaaaa ccctgctgtc taccgttaaa 180
tacgacatcg ttaaatctgc tcacatctac gctggtcagg gttacaccga acaccaggct 240
caggaagaat ggaacatgat cctgcacgtt ctgttcgaag aagaaaccga atcttctgct 300
tcttctgaat ctatccacga aaaaaacgac aacgaaacca acgaatgcac ctcttctttc 360
gaaaccctgt tcgaacagga accgtcttct gaagaaccga aagactctaa actgtacatg 420
ctggctcaga aaaccgttca gcacatcgaa cagtacggta aagctccgga cttcaacaaa 480
gttatccgtg ctcacaactt catccagacc atccacggta ccccgctgaa agaagaagaa 540
aaagaagttg ttcgtctgat ggttatcaaa ctgctgaaaa aaaaagtcga c 591
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> African swine fever virus
<400> 2
atcatggact tcatcctg 18
<210> 3
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<212> DNA
<213> African swine fever virus
<400> 3
gcaactcgag agaagacggt tcctg 25
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> African swine fever virus
<400> 4
atctggaaca tgatcctgc 19
<210> 5
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<212> DNA
<213> African swine fever virus
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cgaactcgag tttttttttc agcagtttg 29
<210> 6
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<212> DNA
<213> African swine fever virus
<400> 6
cgaactcgag gataactttg ttgaagtcc 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> African swine fever virus
<400> 7
cgaactcgag ggttttctga gccagcatg 29
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> African swine fever virus
<400> 8
cgaactcgag gtctttcggt tcttcagaag 30
<210> 9
<211> 29
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<213> African swine fever virus
<400> 9
cgaactcgag agctttaccg tactgttcg 29

Claims (10)

1.一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸，其特征在于：包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；其中胶体金垫内有胶体金标记抗ASFV p30抗原的一个表位的单克隆抗体Mab1；硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，检测线为针对ASFV p30抗原另一表位的单克隆抗体Mab2，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸，其特征在于：抗ASFV p30单克隆抗体Mab1和Mab2，分泌单克隆抗体Mab1的杂交瘤细胞保藏于在中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:C2018158，分类命名为：杂交瘤细胞株6G12，保藏日期为：2018.9.5；分泌单克隆抗体Mab2的杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:C2018159，分类命名为：杂交瘤细胞株3H6，保藏日期为：2018.9.5；抗ASFV p30单克隆抗体Mab1和Mab2针对的抗原表位均位于p30aa145-aa154，且Mab1和Mab2具体针对的表位不同。
3.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸，其特征在于：胶体金标记抗ASFV p30抗原的单克隆抗体Mab1，具体为：用直径40nm的胶体金标记Mab1，标记时pH8.0，Mab1标记浓度为10μg/mL；离心沉淀胶体金标记物，用pH 8.5的复溶液溶解浓缩沉淀，复溶液由10%蔗糖，1%PVP，1%BSA，0.5%Tween-20，0.1M TrisCl组成，复溶液浓缩比例为125μL/mL，最终胶体金复合物喷涂于胶体金垫内，喷涂量为15μL/cm。
4.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸，其特征在于：检测线的ab2工作浓度为1.6mg/mL，质控线的抗鼠IgG抗体工作浓度为1.5mg/ml，Mab2抗体和羊抗鼠IgG抗体划膜时喷涂量均为1μL/cm，且检测线与质控线之间距离为0.5cm。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸的制备方法，包括如下步骤：
1）SFVp30抗原单克隆抗体的制备、表位区域及抗体亚类鉴定；
2）检测ASFV p30抗原胶体金免疫层析试纸制备。
6.根据权利要求5所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，步骤2）具体为：标记p30单克隆抗体Mab1的胶体金垫制备；硝酸纤维素膜检测线和质控线喷涂；试纸条组装。
7.权利要求1-4任意一项所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原胶体金免疫层析试纸在制备ASFV感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验的试剂中的应用。
8.抗ASFV p30单克隆抗体Mab1，其特征在于，分泌单克隆抗体Mab1的杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:C2018158，分类命名为：杂交瘤细胞株6G12，保藏日期为：2018.9.5；抗ASFV p30单克隆抗体Mab1针对的抗原表位位于p30aa145-aa154。
9.抗ASFV p30单克隆抗体Mab2，其特征在于，分泌单克隆抗体Mab2的杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:C2018159，分类命名为：杂交瘤细胞株3H6，保藏日期为：2018.9.5；抗ASFV p30单克隆抗体Mab2针对的抗原表位位于p30aa145-aa154。
10.抗ASFV p30单克隆抗体Mab1和Mab2，其特征在于，分泌单克隆抗体Mab1的杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:C2018158，分类命名为：杂交瘤细胞株6G12，保藏日期为：2018.9.5；分泌单克隆抗体Mab2的杂交瘤细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:C2018159，分类命名为：杂交瘤细胞株3H6，保藏日期为：2018.9.5；抗ASFV p30单克隆抗体Mab1和Mab2针对的抗原表位均位于p30aa145-aa154，且Mab1和Mab2具体针对的表位不同。
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