CN113637065A - 新型胰岛素类似物及其用途 - Google Patents

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李钟守
林亨奎
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Abstract

本发明涉及新型胰岛素类似物，更具体地说，涉及与天然胰岛素相比具有改善的体外作用的胰岛素类似物、编码它的核酸、包含所述核酸的表达载体、引入了表达所述表达载体的转化体、从所述转化体产生胰岛素类似物的方法、含有所述胰岛素类似物作为活性成分的用于治疗糖尿病的药物组合物、以及使用所述胰岛素类似物或药物组合物治疗糖尿病的方法。

Description

新型胰岛素类似物及其用途
本申请为申请号为201680062814.5的中国专利申请(申请日：2016年8月29日，发明名称：新型胰岛素类似物及其用途)的分案申请。
技术领域
本发明涉及新型胰岛素类似物，更具体地涉及与天然胰岛素相比具有改善的体外作用的胰岛素类似物及其用途。
背景技术
胰岛素是由胰腺分泌的控制血糖水平的激素，用于将血液中多余的葡萄糖转运到细胞中，从而提供能量来源并保持正常的葡萄糖水平。然而，由于胰岛素缺乏、胰岛素抵抗和β细胞功能丧失，糖尿病患者不能维持正常的胰岛素功能。结果，糖尿病患者不能利用血液中的葡萄糖作为能量来源，而是表现出伴有高血糖水平的高血糖症状，同时葡萄糖***到尿液中，引起各种并发症。因此，那些具有胰岛素分泌异常(I型)或胰岛素抵抗(II型)的糖尿病患者实质上需要胰岛素治疗，通过胰岛素给药，他们可以保持其血糖水平正常。
人胰岛素由两条多肽链组成，即A链和B链，其分别包含21个氨基酸和30个氨基酸，通过二硫键彼此连接。由于与其他蛋白质和肽类激素一样，胰岛素的体内半衰期非常短，不能表现出持续的治疗效果，因此存在的问题在于，必须连续重复施用以发挥其作用。频繁施用胰岛素会引起患者的严重疼痛和不适，因此需要从患者依从性、安全性和便利性方面改进给药方式。
因此，研究集中在各种蛋白质制剂、化学缀合物等的开发上，通过增加这些蛋白质药物如胰岛素的体内半衰期来减少给药频率以改善治疗效果和患者的生活质量。
已知胰岛素通过与胰岛素受体结合而消除血糖，并且可以通过改变天然胰岛素的序列来控制胰岛素的作用。可以通过用不同的氨基酸取代胰岛素的氨基酸或通过缺失胰岛素的特定氨基酸来控制胰岛素的体内作用。由于具有高活性的胰岛素衍生物甚至在少量的情况下就可以发挥与天然胰岛素相当或更好的作用，从治疗的角度来看，它们可能是非常令人希望的。具体而言，从皮下注射后的胰岛素作用的药代动力学效应方面，广泛研究了胰岛素中所含的A链和/或B链的氨基酸取代。
在这些情况下，本发明人进行了深入研究以改善胰岛素作用的效果，结果发现，特别是在胰岛素A链和/或B链中具有氨基酸残基修饰的胰岛素类似物与天然胰岛素相比显示出显著改善的体外作用，并且因此它们可以有效地用于治疗糖尿病，由此完成了本发明。
发明公开
技术问题
本发明的目的是提供一种新型胰岛素类似物，特别是与天然胰岛素相比具有改善的体外作用的胰岛素类似物。
本发明的另一个目的是提供含有所述胰岛素类似物作为活性成分的用于治疗糖尿病的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供治疗糖尿病的方法，其包括向有需要的受试者施用所述胰岛素类似物或含有所述胰岛素类似物作为活性成分的药物组合物。
技术方案
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种胰岛素类似物，其包含由以下通式1表示的A链SEQ ID NO:3和由以下通式2表示的B链SEQ ID NO:4。
通式1
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa2-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa3-Leu-Xaa4-Gln-Xaa5-Glu-Asn-Xaa6-Cys-Xaa7(SEQ ID NO:3)
在上述通式1中，
Xaa1是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺；
Xaa2是丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸或天冬酰胺；
Xaa3是丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸或天冬酰胺；
Xaa4是丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
Xaa5是丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺；
Xaa6是丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸或天冬酰胺；并且
Xaa7是天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸或丙氨酸。
通式2
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa8-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa9-Tyr-Xaa10-Xaa11-Lys-Thr(SEQ ID NO:4)
在上述通式2中，
Xaa8是酪氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，或不存在；
Xaa9是苯丙氨酸，或不存在；
Xaa10是苏氨酸，或不存在；并且
Xaa11是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，或不存在；
(条件是排除包含A链SEQ ID NO:1和B链SEQ ID NO:2的肽)。
在更具体的示例性实施方案中，胰岛素类似物的特征在于其包含通式1的A链和B链，其中，在B链SEQ ID NO:4中，Xaa8是酪氨酸，Xaa9不存在，并且Xaa10是苏氨酸。
胰岛素类似物的特征在于其包含通式1的A链和B链，其中，在B链SEQ ID NO:4中，Xaa8是酪氨酸，Xaa9是苯丙氨酸，并且Xaa10不存在。
在另一个示例性实施方案中，胰岛素类似物的特征在于，在A链SEQ ID NO:3中，Xaa1是甘氨酸，Xaa2是谷氨酰胺，Xaa3是丝氨酸，Xaa4是谷氨酸，Xaa5是亮氨酸，Xaa6是酪氨酸，并且Xaa7是天冬酰胺，在B链SEQ ID NO:4中，Xaa8是酪氨酸，Xaa9是苯丙氨酸，Xaa10是苏氨酸，并且Xaa11是脯氨酸。
在又另一个示例性实施方案中，胰岛素类似物的特征在于，在A链SEQ ID NO:3中，Xaa1是甘氨酸，Xaa2是谷氨酰胺，Xaa3是丝氨酸，Xaa4是天冬酰胺，Xaa5是亮氨酸，Xaa6是酪氨酸，并且Xaa7是天冬酰胺，在B链SEQ ID NO:4中，Xaa8是酪氨酸，Xaa9是苯丙氨酸，Xaa10是苏氨酸，并且Xaa11是脯氨酸。
在又另一个示例性实施方案中，胰岛素类似物的特征在于，在A链SEQ ID NO:3中，Xaa1是甘氨酸，Xaa2是谷氨酰胺，Xaa3是丝氨酸，Xaa4是谷氨酸，Xaa5是亮氨酸，Xaa6是酪氨酸，并且Xaa7是天冬酰胺，在B链SEQ ID NO:4中，Xaa8是酪氨酸，Xaa9不存在，Xaa10是苏氨酸，并且Xaa11是脯氨酸。
在又另一个示例性实施方案中，胰岛素类似物的特征在于，在A链SEQ ID NO:3中，Xaa1是甘氨酸，Xaa2是谷氨酰胺，Xaa3是丝氨酸，Xaa4是丙氨酸，Xaa5是亮氨酸，Xaa6是酪氨酸，并且Xaa7是天冬酰胺，在B链SEQ ID NO:4中，Xaa8是谷氨酸，Xaa9不存在，Xaa10是苏氨酸，并且Xaa11是脯氨酸。
在又另一个示例性实施方案中，根据本发明的胰岛素类似物的特征在于，在A链SEQ ID NO:3中，Xaa4是谷氨酸，并且，在B链SEQ ID NO:4中，Xaa9是苯丙氨酸；或者
在A链SEQ ID NO:3中，Xaa4是天冬酰胺，并且，在B链SEQ ID NO:4中，Xaa9是苯丙氨酸；或者
在A链SEQ ID NO:3中，Xaa4是谷氨酸，并且，在B链SEQ ID NO:4中，Xaa9不存在；或者
在A链SEQ ID NO:3中，Xaa4是丙氨酸，并且，在B链SEQ ID NO:4中，Xaa8是谷氨酸，Xaa9不存在，
但不限于此。
在又另一个示例性实施方案中，根据本发明的胰岛素类似物包含由SEQ ID NO:16、18、20或22表示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了编码胰岛素类似物的核酸。
在一个示例性实施方案中，根据本发明的核酸包含选自SEQ ID NO:15、17、19和21的核苷酸序列。
在又另一个方面，本发明提供了包含所述核酸的重组表达载体。
在又另一个方面，本发明提供了用所述重组表达载体转化的转化体。
在又另一个方面，本发明提供了制备所述胰岛素类似物的方法，其包括：
a)制备包含编码胰岛素类似物肽的核酸的重组表达载体；
b)将所述重组表达载体转化到宿主细胞中并由此获得转化体；
c)培养所述转化体并表达胰岛素类似物肽；和
d)分离和纯化表达的胰岛素类似物肽。
在又另一个方面，本发明提供了含有胰岛素类似物作为活性成分和药学上可接受的载体的用于治疗糖尿病的药物组合物。
发明的有益效果
根据本发明的胰岛素类似物与天然胰岛素相比表现出显著改善的体外作用，因此预期甚至在少量施用所述胰岛素类似物的情况下也可以提供足够的治疗，并且因此可以有效地用于治疗糖尿病。
附图说明
图1显示了通过蛋白质电泳分析的根据本发明的胰岛素类似物的纯度的结果，代表性地为胰岛素类似物1(泳道1：大小标记，泳道2：胰岛素类似物1)的结果。
图2显示了通过反相色谱法和大小排阻色谱法分析的根据本发明的胰岛素类似物的纯度的结果，代表性地为胰岛素类似物1的结果。
图3显示了根据本发明的类似物的肽图谱的结果，并且代表性地为胰岛素类似物1的结果，其中USP-胰岛素指示用作对照的天然胰岛素。
实施发明的最佳方式
下文将更详细地描述本发明。
同时，本文中公开的每个解释和示例性实施方案可以应用于其他解释和示例性实施方案。也就是说，本文中公开的各种要素的所有可能的组合都属于本发明的范围。另外，本发明的范围不应该受到下文提供的具体描述的限制。
本发明涉及一种新型胰岛素，特别是与天然胰岛素相比具有改善的体外作用的胰岛素类似物。
如本文中使用的，术语“胰岛素类似物”是指通过以***、缺失或取代形式修饰天然胰岛素的一部分氨基酸制备的修饰的天然胰岛素类似物，具体而言其包括天然胰岛素的各种与天然胰岛素相比具有改善的体外作用的胰岛素类似物。
天然胰岛素是由胰腺分泌的激素，并且通常在促进细胞内葡萄糖吸收和抑制脂肪分解中起作用，由此控制体内血糖水平。胰岛素是由其前体胰岛素原的加工产生的，胰岛素原没有控制血糖水平的功能。胰岛素由两条多肽链组成，即A链和B链，其分别包含21个氨基酸和30个氨基酸，并通过二硫键连接。A链和B链中各自可以包含由下面示出的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列。
A链：
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO:1)
B链：
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO:2)
根据本发明的胰岛素是指通过遗传重组技术制备的胰岛素类似物，但所述胰岛素不限于此，并且包括与天然胰岛素相比具有改善的体外作用的所有胰岛素。优选地，本发明的胰岛素包括转化胰岛素、胰岛素变体、胰岛素片段等。不仅可以通过重组方法而且可以通过固相合成制备胰岛素，但制备方法不限于此。
这些胰岛素类似物是具有与天然胰岛素相当或对应的体内血糖水平控制能力的肽，包括所有的胰岛素激动剂、胰岛素衍生物、胰岛素片段、胰岛素变体等。
如本文中使用的，术语“胰岛素激动剂”是指不论胰岛素的结构如何均可与胰岛素的体内受体结合并由此表现出与胰岛素的生物学活性等同的生物学活性的物质。
如本文中使用的，术语“胰岛素衍生物”可以指与天然胰岛素的A链和B链各自的氨基酸序列具有同源性并且处于具有体内血糖控制能力的形式的肽，其中氨基酸残基中的一部分基团通过化学取代(例如α-甲基化、α-羟基化)、缺失(例如脱氨)或修饰(例如N-甲基化)而被修饰。
另外，如本文中使用的，术语“胰岛素衍生物”可以指肽模拟物和低分子量或高分子量化合物，其可通过与胰岛素受体结合来控制体内血糖水平，尽管与天然胰岛素的氨基酸序列没有序列同源性。
如本文中使用的，术语“胰岛素片段”是指这样的胰岛素形式，其中至少一个氨基酸被***或缺失并且***的氨基酸可以是天然不存在的氨基酸(例如，D型氨基酸)，并且所述胰岛素片段具有体内血糖水平控制能力。
如本文中使用的，术语“胰岛素变体”是指与胰岛素的至少一个氨基酸序列具有差异的肽，并且所述肽也具有体内血糖水平控制能力。
用于制备胰岛素激动剂、衍生物、片段和变体的方法可以独立使用或组合使用。例如，具有至少一个氨基酸序列的差异并且其中N末端的氨基酸残基被脱氨基的具有体内血糖水平控制能力的那些肽可以包括在本发明的范围内。
通过在天然胰岛素的A链和B链的氨基酸序列(SEQ ID NO:1和2)中引入氨基酸的取代、***或缺失或翻译后修饰(例如，甲基化、酰化、泛素化和分子间共价键)，根据本发明的胰岛素类似物专有地包括任何与天然胰岛素相比具有改善的体内作用的肽。为了取代或***氨基酸，不仅可以使用在人类蛋白质中常规观察到的20种氨基酸，而且可以使用非典型或非天然氨基酸。可以在商业上从Sigma-Aldrich,ChemPep,Genzymepharmaceuticals等获得非典型氨基酸。含有这些氨基酸和典型肽序列的肽可以由商业肽合成公司合成或购自商业肽合成公司，例如美国肽公司(American Peptide Company),Bachem(美国)和Anygen(韩国)。
具体地说，根据本发明的胰岛素类似物可以是包含天然胰岛素的A链和B链的特定氨基酸残基的修饰或缺失的那些胰岛素类似物，并且优选地可以是其中天然胰岛素的A链的特定氨基酸残基被修饰并且天然胰岛素的B链的特定氨基酸残基被修饰和/或缺失的那些胰岛素类似物。
优选地，本发明的胰岛素类似物可以是其中在由SEQ ID NO:1表示的A链的氨基酸序列中的第14个氨基酸残基酪氨酸被谷氨酸、天冬酰胺或丙氨酸取代的类似物，或其中第16个氨基酸残基酪氨酸被谷氨酸取代的类似物，和/或在由SEQ ID NO:2表示的B链的氨基酸序列中的第25个氨基酸残基苯丙氨酸被缺失的类似物；或者可以包括所有这些类似物。
更优选地，本发明的胰岛素类似物可以是包含由以下通式1表示的A链SEQ ID NO:3和由以下通式2表示的B链SEQ ID NO:4的那些类似物。
通式1
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa2-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa3-Leu-Xaa4-Gln-Xaa5-Glu-Asn-Xaa6-Cys-Xaa7(SEQ ID NO:3)
在上述通式1中，Xaa1是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺；
Xaa2是丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸或天冬酰胺；
Xaa3是丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸或天冬酰胺；
Xaa4是丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
Xaa5是丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺；
Xaa6是丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸或天冬酰胺；并且
Xaa7是天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸或丙氨酸。
通式2
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa8-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa9-Tyr-Xaa10-Xaa11-Lys-Thr(SEQ ID NO:4)
在上述通式2中，
Xaa8是酪氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，或不存在；
Xaa9是苯丙氨酸，或不存在；
Xaa10是苏氨酸，或不存在；并且
Xaa11是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，或不存在；
(其中可以排除包含A链SEQ ID NO:1和B链SEQ ID NO:2的肽)。
在更具体的示例性实施方案中，胰岛素类似物可以是这样的胰岛素类似物，其中，在通式1中，
Xaa1是甘氨酸，
Xaa2是谷氨酰胺，
Xaa3是丝氨酸，
Xaa4是丙氨酸、谷氨酸或天冬酰胺，
Xaa5是亮氨酸，
Xaa6是酪氨酸，并且
Xaa7是天冬酰胺；并且
在通式2中，
Xaa8是酪氨酸或谷氨酸，
Xaa9是苯丙氨酸，或不存在，
Xaa10是苏氨酸，并且
Xaa11是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，或不存在，
但不限于此。
在另一个具体的示例性实施方案中，胰岛素类似物可以是这样的胰岛素类似物，其中，在通式1中，
Xaa1是甘氨酸，
Xaa2是谷氨酰胺，
Xaa3是丝氨酸，
Xaa4是谷氨酸或天冬酰胺，
Xaa5是亮氨酸，
Xaa6是酪氨酸，并且
Xaa7是天冬酰胺；并且
在通式2中，
Xaa8是酪氨酸，
Xaa9是苯丙氨酸，或不存在，
Xaa10是苏氨酸，并且
Xaa11是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，或不存在，
但不限于此。
在又另一个具体的示例性实施方案中，胰岛素类似物可以包含通式1的A链和B链，其中，在B链SEQ ID NO:4中，Xaa8是酪氨酸，Xaa9不存在，Xaa10是苏氨酸，并且Xaa11是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或不存在，但不限于此。
胰岛素类似物可以包含通式1的A链和B链，其中，在B链SEQ ID NO:4中，Xaa8是酪氨酸，Xaa9是苯丙氨酸，Xaa10不存在，并且Xaa11是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或不存在，但不限于此。
胰岛素类似物的特征可能在于，在A链SEQ ID NO:3中，Xaa1是甘氨酸，Xaa2是谷氨酰胺，Xaa3是丝氨酸，Xaa4是谷氨酸，Xaa5是亮氨酸，Xaa6是酪氨酸，并且Xaa7是天冬酰胺，在B链SEQ ID NO:4中，Xaa8是酪氨酸，Xaa9是苯丙氨酸，Xaa10是苏氨酸，并且Xaa11是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或不存在，但不限于此。
胰岛素类似物的特征可能在于，在A链SEQ ID NO:3中，Xaa1是甘氨酸，Xaa2是谷氨酰胺，Xaa3是丝氨酸，Xaa4是天冬酰胺，Xaa5是亮氨酸，Xaa6是酪氨酸，并且Xaa7是天冬酰胺，在B链SEQ ID NO:4中，Xaa8是酪氨酸，Xaa9是苯丙氨酸，Xaa10是苏氨酸，并且Xaa11是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或不存在，但不限于此。
在又另一个具体的示例性实施方案中，胰岛素类似物的特征可能在于，在A链SEQID NO:3中，Xaa1是甘氨酸，Xaa2是谷氨酰胺，Xaa3是丝氨酸，Xaa4是谷氨酸，Xaa5是亮氨酸，Xaa6是酪氨酸，并且Xaa7是天冬酰胺，在B链SEQ ID NO:4中，Xaa8是酪氨酸，Xaa9不存在，Xaa10是苏氨酸，并且Xaa11是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或不存在，但不限于此。
在又另一个具体的示例性实施方案中，胰岛素类似物的特征可能在于，在A链SEQID NO:3中，Xaa1是甘氨酸，Xaa2是谷氨酰胺，Xaa3是丝氨酸，Xaa4是丙氨酸，Xaa5是亮氨酸，Xaa6是酪氨酸，并且Xaa7是天冬酰胺，在B链SEQ ID NO:4中，Xaa8是谷氨酸，Xaa9不存在，Xaa10是苏氨酸，并且Xaa11是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或不存在，但不限于此。
在一个示例性实施方案中，本发明的胰岛素类似物可以包括以下类似物：
i)胰岛素类似物1：其中在SEQ ID NO:3所示的A链的氨基酸序列中的第14个氨基酸残基是谷氨酸并且在SEQ ID NO:4所示的B链的氨基酸序列中的第25个氨基酸残基是苯丙氨酸的肽，其具有由含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列的核酸编码的SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
ii)胰岛素类似物2：其中在SEQ ID NO:3所示的A链的氨基酸序列中的第14个氨基酸残基是天冬酰胺并且在SEQ ID NO:4所示的B链的氨基酸序列中的第25个氨基酸残基是苯丙氨酸的肽，其具有由含SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的核酸编码的SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
iii)胰岛素类似物3：其中在SEQ ID NO:3所示的A链的氨基酸序列中的第14个氨基酸残基是谷氨酸并且在SEQ ID NO:4所示的B链的氨基酸序列中的第25个氨基酸残基被缺失的肽，其具有由含SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列的核酸编码的SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
iv)胰岛素类似物4：其中在SEQ ID NO:3所示的A链的氨基酸序列中的第14个氨基酸残基是丙氨酸并且在SEQ ID NO:4所示的B链的氨基酸序列中的第16个氨基酸残基是谷氨酸、并且第25个氨基酸残基不存在的肽，其具有由含SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列的核酸编码的SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
如本文中使用的，术语“体外作用”是指借助于胰岛素类似物的葡萄糖摄取，它通过关于分化为脂肪细胞的小鼠来源的3T3-L1细胞的葡萄糖摄取的EC50的测量结果来表示。
在一个示例性实施方案中，当测量胰岛素类似物1至3的体外作用时，分别与天然胰岛素相比，胰岛素类似物1显示葡萄糖摄取增加238.4％，胰岛素类似物2显示增加241.7％，胰岛素类似物3显示增加705％，由此证实，与天然胰岛素相比，本发明的胰岛素类似物展现出2-7倍增加的显著体外作用(表1)。
在另一个方面，本发明提供了编码上述胰岛素类似物的核酸。
如本文中使用的，术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)，包括基因组DNA、cDNA和从其转录的RNA，并且作为基本组成单元的核苷酸不仅包括天然核苷酸，而且还包括具有糖或碱基修饰的类似物(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York,1980；Uhlman和Peyman,Chemical Reviews,90:543-584,1990)。可以使用分子生物学中的标准技术分离或制备本发明的核酸。例如，本发明的核酸可以使用基于天然胰岛素(NM_000207.2,NCBI)的基因序列的适当引物序列通过PCR扩增来制备，并且可以使用自动DNA合成仪通过标准合成技术来制备。
优选地，本发明的核酸包括由SEQ ID NO:15、17、19和21表示的核苷酸序列。本发明的核酸不仅包括由SEQ ID NO:15、17、19和21表示的核苷酸序列，而且还包括与上述序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、和最优选至少98％序列同源性的所有序列，并且由上述核酸编码的肽可以与胰岛素的体内受体结合，由此表现出与胰岛素基本上相同的生物学活性。
如本文中使用的，术语“同源性”是指与天然野生型蛋白质的给定氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列的相似性程度，并且包括与本发明的氨基酸序列或多核苷酸序列具有上述百分比或更高的同一性的那些序列。同源性可以通过用肉眼比较两个给定序列来确定，或者可以使用生物信息学算法来确定，所述算法通过排列用于比较的主题序列而能够分析同源性。两个给定氨基酸序列之间的同源性可以以百分比表示。有用的自动化算法可用于威斯康星遗传学软件包的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA计算机软件模块(GeneticsComputer Group,Madison,WI,USA)。在上述模块中自动化的排列算法包括Needleman&Wunsch、Pearson&Lipman和Smith&Waterman的序列排列算法。在包括FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLAST和CLUSTAL W在内的软件中，将其他有用的关于序列排列和同源性测定的算法自动化。
在另一个方面，本发明提供了包含编码胰岛素类似物的核酸的重组载体。根据本发明的重组载体可以构建为用于常规克隆或表达的载体，并且可以构建为使用原核细胞或真核细胞作为宿主细胞的载体。
如本文中使用的，术语“载体”是指能够在适当的宿主细胞中表达靶蛋白的重组载体，其为包含可操作连接以使核酸***物能够表达的关键调控因子的基因构建体。本发明可以制备包含编码胰岛素类似物的核酸的重组载体，并且本发明的胰岛素类似物可以通过将所述重组载体转化或转染到宿主细胞中而获得。
在本发明中，编码胰岛素类似物的核酸与启动子可操作连接。如本文中使用的，术语“可操作连接”是指在用于核酸表达的调控序列(例如启动子、信号序列、核糖体结合位点、转录终止序列等)与不同的核苷酸序列之间的功能连接，并且调控序列可以通过它调控不同核苷酸序列的转录和/或翻译。
如本文中使用的，术语“启动子”是指位于编码区上游的非翻译核酸序列，其包含聚合酶结合位点并且具有启动位于启动子下游的基因转录成mRNA的活性，即，聚合酶与其结合并启动基因转录的DNA结构域，它位于mRNA转录起始的5'结构域。
例如，当本发明的载体是重组载体并且使用原核细胞作为宿主细胞时，通常，应当包括能够执行转录的强启动子(例如tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子、T7启动子等)、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。
另外，通过操作本领域常用的质粒(例如pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列、pPICZα系列、pUC19等)、噬菌体(例如λgt4·λB、λ-Charon、λ△z1、M13等)或病毒(例如SV40等)，可以制备用于本发明的载体.
同时，当本发明的载体是重组载体并且使用真核细胞作为宿主细胞时，可以使用衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、***瘤病毒的7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子和HSV的tk启动子)，并且，载体通常包含多腺苷酸化序列(例如，牛生长激素终止子和衍生自SV40的多腺苷酸化序列)作为转录终止序列。
另外，本发明的重组载体包含本领域常用的抗生素抗性基因作为选择标志物，并且可以包含例如对氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素具有抗性的基因。
本发明的重组载体可另外包含不同的序列以使得易于纯化所收集的靶蛋白，即单链胰岛素类似物、胰岛素原或其类似物。另外包含的序列可以是用于蛋白质纯化的标签序列，例如谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia,USA)、麦芽糖结合蛋白(NEB,USA)、FLAG(IBI,USA)、6-组氨酸等，但是纯化靶蛋白所需的序列的种类并不限于此。
由包含上述标签序列的重组载体表达的融合蛋白可以通过亲和色谱纯化。例如，当谷胱甘肽S-转移酶融合时，可以使用谷胱甘肽作为酶底物，并且当使用6-组氨酸标签时，可以通过Ni-NTA柱容易地收集期望的靶蛋白。
在又另一个方面，本发明提供了由包含编码胰岛素类似物的核酸的重组载体转化的转化体。
如本文中使用的，术语“转化”是指将DNA引入宿主细胞并使其中的DNA作为染色体因子或通过完成染色体整合而使其可复制的过程，其为人工地通过引入外源DNA到细胞中引起遗传改变的现象。
用于本发明的转化方法可以是任何转化方法，并且可以容易地根据本领域中使用的常规方法来进行。常用的转化方法的实例可以包括CaCl2沉淀法、在CaCl2沉淀法中使用二甲基亚砜(DMSO)作为还原剂提高效率的Hanahan法、电穿孔、CaPO4沉淀法、原生质体融合法、使用碳化硅纤维的搅拌法、土壤杆菌介导的转化、使用PEG的转化，以及硫酸葡聚糖介导的、lipofectamine介导的和干燥/抑制介导的转化等。
用于转化包含编码根据本发明的胰岛素类似物的核酸的重组载体的方法可以不限于这些方法，而是可以使用本领域常用的任何转化或转染方法而没有限制。
可以通过将包含编码胰岛素类似物的靶核酸的重组载体引入宿主细胞中获得本发明的转化体。用于本发明的适当的宿主可以不受特别限制，只要它能表达本发明的核酸即可。适当的宿主的实例可以包括大肠杆菌等属于埃希氏菌属的细菌，枯草芽孢杆菌等属于芽孢杆菌属的细菌，恶臭假单胞菌属等属于假单胞菌属的细菌，巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母和粟酒裂殖酵母等酵母，草地贪夜蛾(SF9)等昆虫细胞，以及CHO、COS和BSC等动物细胞。优选使用大肠杆菌作为宿主细胞。
在一个示例性实施方案中，通过PCR扩增编码根据本发明的胰岛素类似物1至3的对应核苷酸序列，并将扩增的基因片段克隆到pET22b载体(Novagen)中。为了在细胞中以包涵体形式表达胰岛素类似物，用限制酶NdeI和BamHI处理pET22b载体以除去其中的信号序列，将胰岛素类似物的PCR扩增产物用相同的限制酶NdeI和BamHI处理，并且使用T4 DNA连接酶将对应的分离的DNA***到pET22b克隆载体中。如此获得的表达载体分别命名为pET22b-胰岛素类似物1至4。
表达载体pET22b-胰岛素类似物1至4分别编码在T7启动子控制下的SEQ ID NO:16、18、20和22所示的氨基酸序列，并且每种胰岛素类似物分别在宿主细胞中以包涵体形式表达。
将包含编码SEQ ID NO:16、18、20和22的每种胰岛素类似物的核酸的重组载体pET22b-胰岛素类似物1至4分别转化到大肠杆菌中，由此获得以包涵体形式表达它们的转化体。
在又另一个方面，本发明提供了使用所述转化体制备所述胰岛素类似物的方法。
优选地，本发明提供了制备胰岛素类似物的方法，其包括：
a)制备包含编码胰岛素类似物的核酸的重组表达载体；
b)将所述重组表达载体转化到宿主细胞中并由此获得转化体；
c)培养所述转化体并表达所述胰岛素类似物；和
d)分离和纯化表达的胰岛素类似物肽。
在培养本发明转化体中使用的培养基应该以适当的方式满足宿主细胞培养的要求。可以根据所制备的转化体通过本领域技术人员的决定来适当选择将要包含在宿主细胞生长培养基中的碳源，并且可以选择适当的培养条件来控制培养的周期和量。
使用的糖源的实例可以包括糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，如大豆油、葵花子油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，如甘油和乙醇；和有机酸，如乙酸。这些物质可以单独使用或组合使用。
使用的氮源的实例可以包括蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素；或无机化合物，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源也可以单独使用或组合使用。
使用的磷源的实例可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。另外，培养基可含有转化体生长所需的金属盐，如硫酸镁或硫酸铁。此外，可以使用必需的生长物质，如氨基酸和维生素。此外，还可以使用适当的用于培养基的前体。可以通过分批培养或连续培养在培养过程中向培养物中适当添加上述来源。可以使用氢氧化钠、氢氧化钾、氨等碱性化合物，或磷酸或硫酸等酸性化合物适当调整培养基的pH值。另外，可加入消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯以防止泡沫产生。另外，为了维持培养物的好氧状态，可以将氧气或含氧气体(例如空气)注入培养物中。可以在20℃至45℃，优选25℃至40℃培养本发明的转化体。另外，继续培养直至获得所需胰岛素类似物的最大产量时为止，并且在这方面，培养通常可以持续10小时至160小时。
如上所述，当根据宿主细胞提供适当的培养条件时，本发明的转化体可以产生胰岛素类似物，并且根据宿主细胞的载体构成和特征产生的肽-N-糖苷酶可以分泌在宿主细胞的细胞质内或周质空间中或细胞外。
可以通过常规方法纯化在宿主细胞内部或外部表达的蛋白质。
纯化方法的实例可以包括盐析(例如，硫酸铵沉淀、磷酸铵沉淀等)、溶剂沉淀(例如使用丙酮或乙醇等沉淀蛋白质部分)、透析、凝胶过滤、离子交换或色谱法如反相柱色谱法、超滤等，这些方法可以单独使用或组合使用。
本发明的转化体的特征在于，胰岛素类似物1至3在T7启动子控制下以包涵体形式从重组载体pET22b-胰岛素类似物1至3表达。因此，优选将以包涵体形式表达的胰岛素类似物1至3转化成可溶形式，然后分离和纯化。
在一个示例性实施方案中，本发明可以进一步包括从转化体中分离和纯化以包涵体形式表达的胰岛素类似物的以下步骤：
d-1)从培养物中获得转化体细胞并将其粉碎；
d-2)从粉碎的细胞裂解物中回收表达的胰岛素类似物肽，随后使其再折叠；
d-3)通过阳离子交换色谱纯化所述再折叠的胰岛素类似物肽；
d-4)用胰蛋白酶和羧肽酶B处理纯化的胰岛素类似物肽；和
d-5)依次通过阳离子交换色谱和阴离子交换色谱纯化所述处理的胰岛素类似物肽。
在又另一个方面，本发明提供了含有上述胰岛素类似物的用于治疗糖尿病的药物组合物。
含有根据本发明的胰岛素类似物的药物组合物可以含有药学上可接受的载体。用于口服给药的药学上可接受的载体的实例可以包括粘合剂、助流剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、调味剂等；对于注射制剂，可以混合使用缓冲剂、防腐剂、止痛剂、等渗剂、稳定剂等；并且对于局部制剂，可以使用碱、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。通过与上述药学上可接受的载体组合，可以不同地制备根据本发明的药物组合物的制剂类型。例如，对于口服给药，药物组合物可以配制成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等。对于注射剂，药物组合物可以配制在单剂量安瓿或多剂量容器中。另外，药物组合物还可以配制成溶液、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊和缓释制剂。
同时，适合的载体、赋形剂和稀释剂的实例可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、***胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等。另外，本发明的药物组合物可以进一步含有填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。
仍然在另一个方面，本发明提供了用于治疗糖尿病的方法，其包括向有需要的受试者施用含有本发明的胰岛素类似物的药物组合物。
根据本发明的胰岛素类似物与天然胰岛素相比表现出显著改善的体外作用，并且因此预期含有上述胰岛素类似物的药物组合物的施用可以有效治疗糖尿病。
如本文中使用的，术语“施用”是指通过适当的方式向患者引入特定的物质，并且本发明的缀合物可以通过任何常用的途径施用，只要药物能够到达靶组织即可。例如，可以进行腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内和直肠内施用，但施用途径不限于此。然而，由于肽在口服施用后被消化，因此用于口服施用的组合物的活性成分应该被包衣或配制为防止在胃中降解。优选地，本发明组合物可以以可注射形式施用。另外，可以使用能够将活性成分转运到靶细胞中的某种装置来施用药物组合物。
另外，本发明的药物组合物可能取决于作为活性成分的药物类型以及几个相关因素，包括待治疗疾病类型，施用途径，患者的年龄、性别和体重，以及疾病的严重程度。由于本发明的药物组合物具有优异的体内持续时间和效价，因此可以显著降低本发明药物的给药频率和剂量。
发明的模式
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明目的，并且本发明并不旨在受这些实施例的限制。
实施例1：构建胰岛素类似物的表达载体
为了构建其中天然胰岛素的A链和/或B链的氨基酸被修饰的胰岛素类似物，合成了用于扩增引入相应的修饰的胰岛素类似物的由正向引物和反向引物组成的引物对，然后使用胰岛素原cDNA作为模板进行PCR。具体而言，所使用的模板为：其中胰岛素原cDNA(SC128255,OriGene)(参见序列：BC005255.1和AAH05255)被克隆到pET22b载体(Novagen)中，并且为了胰岛素的顺利重组表达，将编码氨基酸序列Met Ala Thr Thr Ser Thr AlaThr Thr Arg(SEQ ID NO:24)的核苷酸序列SEQ ID NO:23(ATG GCA ACA ACA TCA ACA GCAACT ACG CGT)***到克隆的胰岛素原cDNA中作为N端融合伴侣。
具体地说，在本发明中，合成了包含表1所示的氨基酸修饰的下列胰岛素类似物。
【表1】
氨基酸修饰
胰岛素类似物1 A<sup>14</sup> Tyr→Glu
胰岛素类似物2 A<sup>14</sup> Tyr→Asn
胰岛素类似物3 A<sup>14</sup> Tyr→Glu+B<sup>25</sup>缺失
胰岛素类似物4 A<sup>14</sup> Tyr→Ala+B<sup>16</sup> Tyr→Glu,B<sup>25</sup>缺失
在上面的表1中，胰岛素类似物1是包含在SEQ ID NO:1所示的天然胰岛素的A链氨基酸序列中的第14个氨基酸的取代(即，酪氨酸被谷氨酸取代)的类似物；
胰岛素类似物2是包含在SEQ ID NO:1所示的天然胰岛素的A链氨基酸序列中的第14个氨基酸的取代(即，酪氨酸被天冬酰胺取代)的类似物；
胰岛素类似物3是包含在SEQ ID NO:1所示的天然胰岛素的A链氨基酸序列中的第14个氨基酸的取代(即，酪氨酸被谷氨酸取代)以及在SEQ ID NO:2所示的天然胰岛素的B链氨基酸序列中的第25个氨基酸(即，苯丙氨酸)的缺失的类似物。
胰岛素类似物4是包含在SEQ ID NO:1所示的天然胰岛素的A链氨基酸序列中的第14个氨基酸的取代(即，酪氨酸被丙氨酸取代)、以及在SEQ ID NO:2所示的天然胰岛素的B链氨基酸序列中的第16个氨基酸的取代(即，酪氨酸被谷氨酸取代)、以及在SEQ ID NO:2所示的天然胰岛素的B链氨基酸序列中的第25个氨基酸(即，苯丙氨酸)的缺失的类似物。
下表2中显示了为扩增胰岛素类似物1至3而设计的正向引物和反向引物的对应引物对。
【表2】
Figure BDA0003144448910000181
Figure BDA0003144448910000191
在上面的表2中，设计了由SEQ ID NO:5和6组成的引物对，用于在天然胰岛素的A链氨基酸序列中的第14个氨基酸的取代(即，酪氨酸取代为谷氨酸)；设计了由SEQ ID NO:7和8组成的引物对，用于在天然胰岛素的A链氨基酸序列中的第14个氨基酸的取代(即，酪氨酸取代为天冬酰胺)；设计了由SEQ ID NO:9和10组成的引物对，用于在天然胰岛素的B链氨基酸序列中的第25个氨基酸(即，苯丙氨酸)的缺失；设计了由SEQ ID NO:11和12组成的引物对，用于在天然胰岛素的A链氨基酸序列中的第14个氨基酸的取代(即，酪氨酸取代为丙氨酸)；并且设计了由SEQ ID NO:13和14组成的引物对，用于在天然胰岛素的B链氨基酸序列中的第16个氨基酸的取代(即，酪氨酸取代为谷氨酸)。
为了进行PCR，以便扩增包含相应修饰的胰岛素类似物，通过混合150ng的模板DNA、1mL的各种100pM引物、5mL的2.5mM dNTP、10单位的pfx聚合酶(Invitrogen,USA)和10X缓冲溶液制备反应溶液。将反应溶液在95℃进行30秒初始变性，接着重复在95℃30秒、55℃30秒、68℃6分钟的退火的18个循环，最后，在68℃保持5分钟。使用凝胶提取试剂盒(Qiagen，德国)提取如此获得的PCR扩增产物，并且用限制酶NdeI和BamHI处理以制备***片段。然后用相同的限制酶切割pET22b载体(Novagen,USA)，并使用相同的凝胶提取试剂盒提取片段。使用T4连接酶将上述***片段连接到如此制备的载体中，以制备表达载体pET22b-胰岛素类似物1至4。所述表达载体包含编码在T7启动子控制下的胰岛素类似物1至4的氨基酸序列的核酸，并且所述载体能够在宿主细胞中以包涵体形式表达胰岛素类似物蛋白。
根据本发明的如此获得的表达载体pET22b-胰岛素类似物1包含具有SEQ ID NO:15所示核苷酸序列的核酸，所述核酸编码具有SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的胰岛素类似物；根据本发明的如此获得的表达载体pET22b-胰岛素类似物2包含具有SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的核酸，所述核酸编码具有SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的胰岛素类似物；根据本发明的如此获得的表达载体pET22b-胰岛素类似物3包含具有SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的核酸，所述核酸编码具有SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的胰岛素类似物；并且根据本发明的如此获得的表达载体pET22b-胰岛素类似物4包含具有SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的核酸，所述核酸编码具有SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的胰岛素类似物。
下表3中显示了每种胰岛素类似物1至4的DNA序列和蛋白质序列。
【表3】
Figure BDA0003144448910000201
Figure BDA0003144448910000211
Figure BDA0003144448910000221
实施例2：重组胰岛素类似物的表达
如下进行根据本发明的胰岛素类似物在T7启动子控制下的重组表达。用实施例1中制备的每种胰岛素类似物表达载体转化大肠杆菌BL21-DE3(大肠杆菌B F-dcm ompThsdS(rB-mB-)galλDE3)(Novagen,USA)。使用Novagen(大肠杆菌BL21-DE3的制造商)推荐的方法进行转化。收集用胰岛素类似物表达载体转化的每个单菌落，接种到含有50μg/mL氨苄青霉素的2XLuria肉汤(LB)培养基中，在37℃下培养15小时。将重组大肠杆菌培养物和含有30％甘油的2X LB培养基以1:1(v/v)比混合，分别将1mL混合物分装到每个冻存管中，并在-140℃下储存。所得产物用作生产重组胰岛素类似物的细胞储备物。
为了表达重组胰岛素类似物，将一小瓶的每种细胞储备物溶解在500mL的2X LB中，并维持在37℃下在振荡水浴中温育14小时至16小时。当OD值达到5.0或更高时停止温育，将培养物用作种子培养物。使用50L发酵罐(MSJ-U2,B.E.MARUBISHI，日本)将种子培养物接种到17L发酵培养基中并开始初始分批发酵。在37℃在500rpm的搅拌速度下以20L/分钟(1vvm)的空气供应进行培养，同时用30％的氨水将pH保持在6.70。关于发酵的进程，当培养基中的营养素有限时，通过添加补料溶液在补料分批培养中进行发酵。基于OD值监测细菌的生长，并且当OD值达到100或更高时，在其中引入终浓度为500μM的IPTG。引入之后继续进一步培养约23小时至25小时。终止培养后，通过离心回收重组细菌并保存在-80℃下直至使用。
实施例3：重组胰岛素类似物的分离和纯化
为了从转化体中分离和纯化实施例2中表达的重组胰岛素类似物，如下所示破碎细胞，然后使其再折叠，以将以水不溶性包涵体形式表达的胰岛素类似物改变为水溶性形式。
<3-1>重组胰岛素类似物的回收和再折叠
具体地说，将各细胞沉淀重悬于1L增溶缓冲溶液(50mM Tris-HCl(pH9.0)、1mMEDTA(pH8.0)、0.2M NaCl和0.5％Triton X-100)中，使用微射流均质机M-110EH(ACTechnology Corp.型号M1475C)在15,000psi的压力下使细胞破碎。将破碎的细胞裂解物在7,000rpm和4℃下离心20分钟，弃去上清液。将所得产物重悬于3L洗涤缓冲液(0.5％TritonX-100、50mM Tris(pH 8.0)、0.2M NaCl和1mM EDTA)中。在7,000rpm和4℃下离心20分钟，将所得沉淀重悬于蒸馏水中，随后以相同的方式进行离心。将所得沉淀各自重悬于400mL的缓冲溶液(1M甘氨酸、3.78g半胱氨酸-HCl，pH 10.6))中并在室温下搅拌1小时。为了回收重悬的重组胰岛素类似物，向其中加入400mL 8M尿素并在40℃下搅拌1小时。为了使溶解的重组胰岛素类似物再折叠，将所得产物在7,000rpm和4℃下离心20分钟，并回收上清液。将上清液在4℃下搅拌16小时，同时使用蠕动泵以1000mL/小时的流率加入7.2L蒸馏水。
<3-2>阳离子交换色谱纯化
将实施例<3-1>中完成再折叠的样品分别上样到用含有45％乙醇的20mM柠檬酸钠缓冲溶液(pH 2.0)平衡的阳离子交换柱(Source S,GE Healthcare)中与其结合。然后使用线性浓度梯度从0％至100％的含有0.5M氯化钾和45％乙醇的20mM柠檬酸钠缓冲溶液(pH2.0)以10个柱体积从柱中洗脱胰岛素类似物蛋白。
<3-3>用胰蛋白酶和羧肽酶B处理
使用脱盐柱将实施例<3-2>中洗脱的样品除盐，然后更换缓冲溶液(10mM Tris-HCl,pH 8.0)。用对应于相对于样品蛋白质量的1000摩尔比的胰蛋白酶和对应于相对于样品的蛋白质量的2000摩尔比的羧肽酶B处理样品，并在16℃下搅拌16小时。通过使用1M柠檬酸钠(pH 2.0)将pH降低至3.5来停止反应。
<3-4>阳离子交换色谱纯化
将实施例<3-3>中完成反应的样品分别重新上样到用含有45％乙醇的20mM柠檬酸钠缓冲溶液(pH 2.0)平衡的阳离子交换柱(Source S,GE Healthcare)中与其结合。然后使用线性浓度梯度从0％至100％的含有0.5M氯化钾和45％乙醇的20mM柠檬酸钠缓冲溶液(pH2.0)以10个柱体积从柱中洗脱胰岛素类似物蛋白。
<3-5>阴离子交换色谱纯化
使用脱盐柱将实施例<3-4>中洗脱的样品除盐，然后更换缓冲溶液(10mM Tris-HCl,pH 7.5)。为了从如此获得的样品中分离纯的胰岛素类似物，分别将所得产物上样用10mM Tris缓冲溶液(pH 7.5)平衡的阴离子交换柱(Source Q,GE Healthcare)中以进行结合。然后使用线性浓度梯度从0％至100％的含有0.5M氯化钠的10mM Tris缓冲液(pH 7.5)以10个柱体积从柱中洗脱胰岛素类似物蛋白。
通过蛋白质电泳(SDS-PAGE)和反相和大小排阻色谱分析纯化的胰岛素类似物的纯度，结果分别示于图1和图2中。另外，通过肽图谱和每个峰的分子量分析证实了氨基酸中的修饰，结果示于图3中。
结果证实，根据其预期目的，在每种胰岛素类似物的氨基酸序列中都存在修饰。
实施例4：在天然胰岛素和胰岛素类似物之间的体外作用的比较
为了测量实施例3中分离和纯化的胰岛素类似物的体外作用，使用小鼠衍生的3T3-L1细胞系进行关于葡萄糖吸收能力(葡萄糖摄取或脂质合成能力)的实验，所述细胞系分化成脂肪细胞。使用含有10％牛新生牛血清(NBCS)的Dulbecco's Modified Eagle's培养基(DMEM，Gibco，目录号12430)传代培养3T3-L1细胞系(ATCC,CL-173)，每周两到三次。将3T3-L1细胞系悬浮于分化培养基(含有10％FBS的DMEM)中，以5X104个细胞/孔的浓度接种到48孔板中，并在37℃下培养48小时。为了将3T3-L1细胞系分化成脂肪细胞，用1μg/mL的人胰岛素(Sigma，目录号I9278)、0.5mM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，Sigma，目录号I5879)和1μM***(Sigma，目录号D4902)处理分化培养基，移除现有培养基并将混合物以250μL/孔的量等分到每个孔中。此后四十八小时，将培养基替换为仅添加1μg/mL人胰岛素的分化培养基。然后持续7至9天的时间证实3T3-L1细胞系向脂肪细胞分化的诱导，同时以48小时的间隔用含有1μg/mL人胰岛素的分化培养基置换培养基。
为了葡萄糖吸收能力的实验，将完成了向脂肪细胞分化的细胞用无血清DMEM培养基洗涤一次，然后用250μL无血清DMEM培养基处理4小时以诱导其中的血清耗竭。
使用不含血清的DMEM培养基将人胰岛素和胰岛素类似物分别进行从5μM至0.005nM的10倍系列稀释，以备用作样品。将如此制备的胰岛素样品分别以250μL的量添加至细胞，并在37℃下在5％CO2培养箱中培养24小时。为了测量完成培养的培养基中的剩余葡萄糖量，将各培养样品以200μL的量收集，使用D-PBS稀释5倍，进行GOPOD分析(GOPODAssay Kit,Megazyme，目录号K-GLUC)。基于葡萄糖标准溶液的吸光度计算剩余葡萄糖的浓度，分别计算胰岛素类似物的葡萄糖摄取能力的EC50值，结果示于下表4中。
【表4】
Figure BDA0003144448910000261
如表4所示，分别与天然胰岛素相比，胰岛素类似物1显示葡萄糖摄取能力增加238.4％，胰岛素类似物2显示增加241.7％，并且胰岛素类似物3显示增加705％。
从以上结果证实，与天然胰岛素相比，根据本发明的胰岛素类似物展现出2-7倍增加的显著体外作用，并且这些结果表明胰岛素类似物能够显著增加它们的体内血清半衰期，并且因此可以作为稳定的胰岛素制剂提供，因而有效地用作治疗糖尿病的治疗剂。
本领域的普通技术人员将认识到，可以在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下以其他具体形式来实施本发明。所描述的实施方案在所有方面仅当认为是说明性的而非限制性的。因此，本发明的范围是由所附权利要求书而不是由前述说明书指示。在权利要求书的等效物的含义和范围内的所有变化都被包括在本发明的范围之内。
综上所述，本申请包括但不限于以下各项：
1.一种胰岛素类似物肽，其包含以下通式1指示的SEQ ID NO:3的A链和以下通式2指示的SEQ ID NO:4的B链：
(通式1)
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa2-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa3-Leu-Xaa4-Gln-Xaa5-Glu-Asn-Xaa6-Cys-Xaa7(SEQ ID NO:3)
其中
Xaa1是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺；
Xaa2是丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸或天冬酰胺；
Xaa3是丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸或天冬酰胺；
Xaa4是丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺；
Xaa5是丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸或天冬酰胺；
Xaa6是丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸或天冬酰胺；并且
Xaa7是天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸或丙氨酸；和
(通式2)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa8-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa9-Tyr-Xaa10-Xaa11-Lys-Thr(SEQ ID NO:4)
其中
Xaa8是酪氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，或不存在；
Xaa9是苯丙氨酸，或不存在；
Xaa10是苏氨酸，或不存在；并且
Xaa11是脯氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，或不存在；
(条件是排除包含SEQ ID NO:1的A链和SEQ ID NO:2的B链的肽)。
2.项1的胰岛素类似物肽，其中，在SEQ ID NO:4的B链中，Xaa8是酪氨酸，Xaa9不存在，并且Xaa10是苏氨酸。
3.项1的胰岛素类似物肽，其中在SEQ ID NO:4的B链中，Xaa8是酪氨酸，Xaa9是苯丙氨酸，并且Xaa10不存在。
4.项1的胰岛素类似物肽，
其中在SEQ ID NO:3的A链中，Xaa1是甘氨酸，Xaa2是谷氨酰胺，Xaa3是丝氨酸，Xaa4是谷氨酸，Xaa5是亮氨酸，Xaa6是酪氨酸，并且Xaa7是天冬酰胺，以及
在SEQ ID NO:4的B链中，Xaa8是酪氨酸，Xaa9是苯丙氨酸，Xaa10是苏氨酸，并且Xaa11是脯氨酸。
5.项4的胰岛素类似物肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
6.项1的胰岛素类似物肽，
其中在SEQ ID NO:3的A链中，Xaa1是甘氨酸，Xaa2是谷氨酰胺，Xaa3是丝氨酸，Xaa4是天冬酰胺，Xaa5是亮氨酸，Xaa6是酪氨酸，并且Xaa7是天冬酰胺，以及
在SEQ ID NO:4非B链中，Xaa8是酪氨酸，Xaa9是苯丙氨酸，Xaa10是苏氨酸，并且Xaa11是脯氨酸。
7.项6的胰岛素类似物肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
8.项1的胰岛素类似物肽，
其中在SEQ ID NO:3的A链中，Xaa1是甘氨酸，Xaa2是谷氨酰胺，Xaa3是丝氨酸，Xaa4是谷氨酸，Xaa5是亮氨酸，Xaa6是酪氨酸，并且Xaa7是天冬酰胺，以及
在SEQ ID NO:4的B链中，Xaa8是酪氨酸，Xaa9不存在，Xaa10是苏氨酸，并且Xaa11是脯氨酸。
9.项8的胰岛素类似物肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
10.项1的胰岛素类似物肽，其中，在SEQ ID NO:3的A链中，Xaa1是甘氨酸，Xaa2是谷氨酰胺，Xaa3是丝氨酸，Xaa4是丙氨酸，Xaa5是亮氨酸，Xaa6是酪氨酸，并且Xaa7是天冬酰胺，以及
在SEQ ID NO:4的B链中，Xaa8是谷氨酸，Xaa9不存在，Xaa10是苏氨酸，并且Xaa11是脯氨酸。
11.项10的胰岛素类似物肽，其中所述肽包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
12.编码根据项1-11中任一项的胰岛素类似物肽的核酸。
13.项12的核酸，其中所述核酸包含选自SEQ ID No:15、17、19、和21的核苷酸序列。
14.一种重组表达载体，其包含根据项12的核酸。
15.一种用根据项14的重组表达载体转化的转化体。
16.项15的转化体，其中所述转化体是大肠杆菌。
17.一种制备根据项1的胰岛素类似物肽的方法，其包括：
a)制备包含编码根据项1的胰岛素类似物肽的核酸的重组表达载体；
b)将所述重组表达载体转化到宿主细胞中并自其获得转化体；
c)培养所述转化体并表达胰岛素类似物肽；和
d)分离和纯化表达的胰岛素类似物肽。
18.项17的方法，其中所述核酸包含选自SEQ ID No:15、17、19和21的核苷酸序列。
19.项17的方法，其中所述转化体是大肠杆菌。
20.项17所述的方法，其中所述分离和纯化包括：
d-1)从培养物中获得转化体细胞并将其粉碎；
d-2)从粉碎的细胞裂解物中回收表达的胰岛素类似物肽，随后使其再折叠；
d-3)通过阳离子交换色谱纯化所述再折叠的胰岛素类似物肽；
d-4)用胰蛋白酶和羧肽酶B处理经纯化的胰岛素类似物肽；和
d-5)依次通过阳离子交换色谱和阴离子交换色谱纯化经处理的胰岛素类似物肽。
21.一种用于治疗糖尿病的药物组合物，其包含根据项1至11中任一项的胰岛素类似物肽和药学可接受的载体。。
<110> 韩美药品股份有限公司
<120> 新型胰岛素类似物及其用途
<130> OPA16196-PCT
<150> KR 10-2015-0121819
<151> 2015-08-28
<160> 24
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Homo sapiens
<400> 2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素A-链
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa为丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、谷氨酸或
天冬酰胺
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)
<223> Xaa为丙氨酸, 谷氨酸, 谷氨酰胺, 组氨酸, 或
天冬酰胺
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)
<223> Xaa为丙氨酸, 丝氨酸, 谷氨酰胺, 谷氨酸, 组氨酸, 或
天冬酰胺
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)
<223> Xaa为丙氨酸, 酪氨酸, 谷氨酸, 组氨酸, 赖氨酸,
天冬氨酸, 或天冬酰胺
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)
<223> Xaa为丙氨酸, 亮氨酸, 酪氨酸, 组氨酸, 谷氨酸, 或
天冬酰胺
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)
<223> Xaa为丙氨酸, 酪氨酸, 丝氨酸, 谷氨酸, 组氨酸, 或
天冬酰胺
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)
<223> Xaa为天冬酰胺, 甘氨酸, 组氨酸, 或丙氨酸
<400> 3
Xaa Ile Val Glu Xaa Cys Cys Thr Ser Ile Cys Xaa Leu Xaa Gln Xaa
1 5 10 15
Glu Asn Xaa Cys Xaa
20
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素B-链
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)
<223> Xaa为酪氨酸, 谷氨酸, 或 天冬氨酸, 或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)
<223> Xaa为苯丙氨酸, 或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)
<223> Xaa为苏氨酸, 或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)
<223> Xaa为脯氨酸, 谷氨酸, 或天冬氨酸, 或不存在
<400> 4
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Lys Thr
20 25 30
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
ccagcatctg ctccctcgaa cagctggaga actactg 37
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
cagtagttct ccagctgttc gagggagcag atgctgg 37
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
cagcatctgc tccctcaacc agctggagaa ctac 34
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
gtagttctcc agctggttga gggagcagat gctg 34
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
gcggggaacg aggcttctac acacccaaga cccg 34
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
cgggtcttgg gtgtgtagaa gcctcgttcc ccgc 34
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
cagcatctgc tccctcgccc agctggagaa ctac 34
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
gtagttctcc agctgggcga gggagcagat gctg 34
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
ctggtggaag ctctcgagct agtgtgcggg gaac 34
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
gttccccgca cactagctcg agagcttcca ccag 34
<210> 15
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物1
<400> 15
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcgaacag 240
ctggagaact actgcaactg a 261
<210> 16
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物1
<400> 16
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 17
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物2
<400> 17
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctcaaccag 240
ctggagaact actgcaactg a 261
<210> 18
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物2
<400> 18
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Asn Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 19
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物3
<400> 19
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tctacacacc caagacccgc cgggaggcag aggacctgca ggtggggcag 120
gtggagctgg gcgggggccc tggtgcaggc agcctgcagc ccttggccct ggaggggtcc 180
ctgcagaagc gtggcattgt ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct cgaacagctg 240
gagaactact gcaactga 258
<210> 20
<211> 85
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物3
<400> 20
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu
20 25 30
Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly
35 40 45
Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg
50 55 60
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
65 70 75 80
Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 21
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物4
<400> 21
ttcgttaacc aacacttgtg tggctcacac ctggtggaag ctctcgagct agtgtgcggg 60
gaacgaggct tctacacacc caagacccgc cgggaggcag aggacctgca ggtggggcag 120
gtggagctgg gcgggggccc tggtgcaggc agcctgcagc ccttggccct ggaggggtcc 180
ctgcagaagc gtggcattgt ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct cgcccagctg 240
gagaactact gcaactga 258
<210> 22
<211> 85
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物4
<400> 22
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu
20 25 30
Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly
35 40 45
Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg
50 55 60
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Ala Gln Leu
65 70 75 80
Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端融合伙伴
<400> 23
atggcaacaa catcaacagc aactacgcgt 30
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端融合伙伴
<400> 24
Met Ala Thr Thr Ser Thr Ala Thr Thr Arg
1 5 10

Claims (9)

1.一种胰岛素类似物肽，其包含以下通式1指示的SEQ ID NO:3的A链和以下通式2指示的SEQ ID NO:4的B链：
(通式1)
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa2-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa3-Leu-Xaa4-Gln-Xaa5-Glu-Asn-Xaa6-Cys-Xaa7(SEQ ID NO:3)
其中
Xaa1是甘氨酸；
Xaa2是谷氨酰胺；
Xaa3是丝氨酸；
Xaa4是天冬氨酸；
Xaa5是亮氨酸；
Xaa6是酪氨酸；并且
Xaa7是天冬酰胺；和
(通式2)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa8-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa9-Tyr-Xaa10-Xaa11-Lys-Thr(SEQ ID NO:4)
其中
Xaa8是酪氨酸；
Xaa9是苯丙氨酸；
Xaa10是苏氨酸；并且
Xaa11是脯氨酸。
2.编码根据权利要求1的胰岛素类似物肽的核酸。
3.一种重组表达载体，其包含根据权利要求2的核酸。
4.一种用根据权利要求3的重组表达载体转化的转化体。
5.权利要求4的转化体，其中所述转化体是大肠杆菌。
6.一种制备根据权利要求1的胰岛素类似物肽的方法，其包括：
a)制备包含编码根据权利要求1的胰岛素类似物肽的核酸的重组表达载体；
b)将所述重组表达载体转化到宿主细胞中并自其获得转化体；
c)培养所述转化体并表达胰岛素类似物肽；和
d)分离和纯化表达的胰岛素类似物肽。
7.权利要求6的方法，其中所述转化体是大肠杆菌。
8.权利要求6所述的方法，其中所述分离和纯化包括：
d-1)从培养物中获得转化体细胞并将其粉碎；
d-2)从粉碎的细胞裂解物中回收表达的胰岛素类似物肽，随后使其再折叠；
d-3)通过阳离子交换色谱纯化所述再折叠的胰岛素类似物肽；
d-4)用胰蛋白酶和羧肽酶B处理经纯化的胰岛素类似物肽；和
d-5)依次通过阳离子交换色谱和阴离子交换色谱纯化经处理的胰岛素类似物肽。
9.一种用于治疗糖尿病的药物组合物，其包含根据权利要求1的胰岛素类似物肽和药学可接受的载体。
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