EA045778B1 - Новые аналоги инсулина и их применение - Google Patents
Новые аналоги инсулина и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA045778B1 EA045778B1 EA202291308 EA045778B1 EA 045778 B1 EA045778 B1 EA 045778B1 EA 202291308 EA202291308 EA 202291308 EA 045778 B1 EA045778 B1 EA 045778B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- insulin
- seq
- chain
- leu
- cys
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 307
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims description 109
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 85
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 84
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 71
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 43
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 39
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 36
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 35
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 34
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 34
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 33
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 23
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 23
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 20
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 19
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 16
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 15
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 15
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 15
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 14
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 13
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 12
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 6
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 claims description 6
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 53
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 45
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 45
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 41
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 35
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 34
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 27
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 22
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 22
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 18
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 15
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 14
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 14
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- -1 derivatives Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 5
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N Arg-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N Arg-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- KOHBWQDSVCARMI-BWBBJGPYSA-N Cys-Cys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KOHBWQDSVCARMI-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 4
- GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N Cys-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N Cys-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- JVSBYEDSSRZQGV-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JVSBYEDSSRZQGV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N Glu-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N Gly-Ala-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC([O-])=O UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Pro zwitterion Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 4
- MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- LJUIEESLIAZSFR-SRVKXCTJSA-N His-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N LJUIEESLIAZSFR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 4
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 4
- YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N Leu-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NEEOBPIXKWSBRF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- GAOJCVKPIGHTGO-UWVGGRQHSA-N Lys-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O GAOJCVKPIGHTGO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 4
- TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N Lys-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- XBWKCYFGRXKWGO-SRVKXCTJSA-N Tyr-Cys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XBWKCYFGRXKWGO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 4
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 108010073093 leucyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 description 3
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 3
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 2
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-LZFNBGRKSA-N Potassium-45 Chemical compound [45K] ZLMJMSJWJFRBEC-LZFNBGRKSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N Tyr-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)O AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 3 Isobutyl 1 methylxanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(CC(C)C)C2=C1N=CN2 APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 235000006491 Acacia senegal Nutrition 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N Ala-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100321817 Human parvovirus B19 (strain HV) 7.5K gene Proteins 0.000 description 1
- 206010052341 Impaired insulin secretion Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- HUKLXYYPZWPXCC-KZVJFYERSA-N Met-Ala-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HUKLXYYPZWPXCC-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010033372 Pain and discomfort Diseases 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- RVMNUBQWPVOUKH-HEIBUPTGSA-N Thr-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RVMNUBQWPVOUKH-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N Tyr-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PDSLRCZINIDLMU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 101150023479 hsdS gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008095 long lasting therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000845 maltitol Substances 0.000 description 1
- VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N maltitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N 0.000 description 1
- 235000010449 maltitol Nutrition 0.000 description 1
- 229940035436 maltitol Drugs 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000013365 molecular weight analysis method Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011537 solubilization buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к новому аналогу инсулина и, конкретнее, к аналогу инсулина с улучшенным in vitro-эффектом по сравнению с нативным инсулином, и к их применению.
Предшествующий уровень техники
Инсулин представляет собой гормон, контролирующий уровень глюкозы в крови, секретируемый поджелудочной железой и приводящий к перемещению избыточной глюкозы из крови в клетки, посредством чего он обеспечивает их источником энергии и поддерживает нормальный уровень глюкозы. Тем не менее, пациенты с диабетом не могут поддерживать нормальные инсулиновые функции из-за дефицита инсулина, инсулинорезистентности и утраты функции бета-клеток. В результате, пациенты с диабетом не могут использовать глюкозу крови в качестве источника энергии, но демонстрируют симптомы гипергликемии с высоким уровнем глюкозы и выводят глюкозу с мочой, что приводит к различным осложнениям. Соответственно, пациентам с диабетом и нарушениями секреции инсулина (тип I) или инсулинорезистентностью (тип II) в высшей степени необходимо введение инсулина, позволяющее им поддерживать нормальные уровни глюкозы в крови.
Человеческий инсулин состоит из двух полипептидных цепей, то есть А-цепи и В-цепи, содержащими 21 и 30 аминокислот, соответственно, соединенных друг с другом двумя дисульфидными связями. Поскольку инсулин имеет очень короткий период полувыведения in vivo, как и другие белковые и пептидные гормоны, он не способен оказывать продолжительный терапевтический эффект, и поэтому существует проблема, состоящая в необходимости его постоянного и частого введения для того, чтобы он оказывал свой эффект. Частое введение инсулина доставляет пациентам сильную боль и дискомфорт, и поэтому существует потребность в улучшении введения с точки зрения приверженности пациентов к лечению, их безопасности и удобства.
Соответственно, исследования были сосредоточены на разработке различных белковых композиций, химических конъюгатов и так далее для улучшения терапевтических эффектов, а также качества жизни пациентов, благодаря снижению частоты введения за счет увеличения периода полувыведения этих белковых лекарственных средств, таких как инсулин, in vivo.
Известно, что инсулин удаляет глюкозу из крови, связываясь с рецепторами инсулина, и что эффект инсулина можно контролировать, изменяя последовательность нативного инсулина. In vivo-эффект инсулина можно контролировать заменой аминокислоты (аминокислот) инсулина другой аминокислотой (аминокислотами) или делецией определенной аминокислоты (аминокислот) инсулина. Поскольку производные инсулина с высокой активностью могут оказывать эффекты, эквивалентные эффектам нативного инсулина или превосходящие их, даже в небольшом количестве, они могут, таким образом, быть крайне желательны с терапевтической точки зрения. В частности, аминокислотные замены в А-цепи и/или В-цепи инсулина были широко изучены с точки зрения фармакокинетического эффекта действия инсулина после подкожной инъекции.
В этих условиях авторы настоящего изобретения провели всесторонние исследования для улучшения эффекта действия инсулина и, в результате, они обнаружили, что аналоги инсулина с модификацией (модификациями) определенного аминокислотного остатка (остатков) А-цепи и/или В-цепи инсулина демонстрируют существенно улучшенный in vitro-эффект, по сравнению с нативным инсулином, и что они могут поэтому быть эффективно использованы для лечения диабета, завершив посредством этого настоящее изобретение.
Описание изобретения
Техническая проблема.
Задачей настоящего изобретения является обеспечение нового аналога инсулина и, конкретно, аналога инсулина с улучшенным in vitro-эффектом по сравнению с нативным инсулином.
Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции для лечения диабета, содержащей аналог инсулина в качестве активного ингредиента.
Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение способа лечения диабета, включающего введение аналога инсулина или фармацевтической композиции, содержащей аналог инсулина в качестве активного ингредиента, субъекту, нуждающемуся в этом.
Техническое решение.
Для решения указанных выше задач в одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен аналог инсулина, содержащий А-цепь SEQ ID NO: 3, представленную следующей общей формулой 1, и В-цепь SEQ ID NO: 4, представленную следующей общей формулой 2.
Общая формула 1.
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa2-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa3-Leu-Xaa4-Gln-Xaa5-Glu-Asn-Xaa6-Cys-Xaa7 (SEQ ID NO: 3)
В приведенной выше общей формуле 1:
Xaa1 представляет собой аланин, глицин, глутамин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин;
Хаа2 представляет собой аланин, глутаминовую кислоту, глутамин, гистидин или аспарагин;
Хаа3 представляет собой аланин, серин, глутамин, глутаминовую кислоту, гистидин или аспарагин;
- 1 045778
Хаа4 представляет собой аланин, тирозин, глутаминовую кислоту, гистидин, лизин, аспарагиновую кислоту или аспарагин;
Хаа5 представляет собой аланин, лейцин, тирозин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин;
Хаа6 представляет собой аланин, тирозин, серин, глутаминовую кислоту, гистидин или аспарагин;
и
Хаа7 представляет собой аспарагин, глицин, гистидин или аланин.
Общая формула 2.
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa8-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-GlyPhe-Xaa9-Tyr-Xaa10-Xaa11-Lys-Thr (SEQ ID NO: 4)
В приведенной выше общей формуле 2:
Хаа8 представляет собой тирозин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту или отсутствует;
Хаа9 представляет собой фенилаланин или отсутствует;
Xaa10 представляет собой треонин или отсутствует; и
Xaa11 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту или отсутствует (при условии, что пептид, содержащий А-цепь SEQ ID NO: 1 и В-цепь SEQ ID NO: 2, исключен).
В более конкретном типичном воплощении аналог инсулина характеризуется тем, что он содержит А-цепь общей формулы 1 и В-цепь, где в В-цепи SEQ ID NO: 4 Хаа8 представляет собой тирозин, Хаа9 отсутствует и Хаа10 представляет собой треонин.
Аналог инсулина характеризуется тем, что он содержит А-цепь общей формулы 1 и В-цепь, где в Вцепи SEQ ID NO: 4 Хаа8 представляет собой тирозин, Хаа9 представляет собой фенилаланин и Хаа10 отсутствует.
В другом типичном воплощении аналог инсулина характеризуется тем, что в А-цепи SEQ ID NO: 3 Xaa1 представляет собой глицин, Хаа2 представляет собой глутамин, Хаа3 представляет собой серин, Хаа4 представляет собой глутаминовую кислоту, Хаа5 представляет собой лейцин, Хаа6 представляет собой тирозин и Хаа7 представляет собой аспарагин, и в В-цепи SEQ ID NO: 4 Хаа8 представляет собой тирозин, Хаа9 представляет собой фенилаланин, Хаа10 представляет собой треонин и Xaa11 представляет собой пролин.
В еще одном типичном воплощении аналог инсулина характеризуется тем, что в А-цепи SEQ ID NO: 3 Xaa1 представляет собой глицин, Хаа2 представляет собой глутамин, Хаа3 представляет собой серин, Хаа4 представляет собой аспарагин, Хаа5 представляет собой лейцин, Хаа6 представляет собой тирозин и Хаа7 представляет собой аспарагин, и в В-цепи SEQ ID NO: 4 Хаа8 представляет собой тирозин, Хаа9 представляет собой фенилаланин, Хаа10 представляет собой треонин и Xaa11 представляет собой пролин.
В еще одном типичном воплощении аналог инсулина характеризуется тем, что в А-цепи SEQ ID NO: 3 Xaa1 представляет собой глицин, Хаа2 представляет собой глутамин, Хаа3 представляет собой серин, Хаа4 представляет собой глутаминовую кислоту, Хаа5 представляет собой лейцин, Хаа6 представляет собой тирозин и Хаа7 представляет собой аспарагин, и в В-цепи SEQ ID NO: 4 Хаа8 представляет собой тирозин, Хаа9 отсутствует, Хаа10 представляет собой треонин и Xaa11 представляет собой пролин.
В еще одном типичном воплощении аналог инсулина характеризуется тем, что в А-цепи SEQ ID NO: 3 Xaa1 представляет собой глицин, Хаа2 представляет собой глутамин, Хаа3 представляет собой серин, Хаа4 представляет собой аланин, Хаа5 представляет собой лейцин, Хаа6 представляет собой тирозин и Хаа7 представляет собой аспарагин, и в В-цепи SEQ ID NO: 4 Хаа8 представляет собой глутаминовую кислоту, Хаа9 отсутствует, Хаа10 представляет собой треонин и Xaa11 представляет собой пролин.
В еще одном типичном воплощении аналог инсулина по настоящему изобретению характеризуется тем, что:
в А-цепи SEQ ID NO: 3 Хаа4 представляет собой глутаминовую кислоту, и в В-цепи SEQ ID NO: 4 Хаа9 представляет собой фенилаланин; или в А-цепи SEQ ID NO: 3 Хаа4 представляет собой аспарагин, и в В-цепи SEQ ID NO: 4 Хаа9 представляет собой фенилаланин; или в А-цепи SEQ ID NO: 3 Хаа4 представляет собой глутаминовую кислоту, и в В-цепи SEQ ID NO: 4 Хаа9 отсутствует; или в А-цепи SEQ ID NO: 3 Хаа4 представляет собой аланин, и в В-цепи SEQ ID NO: 4 Хаа8 представляет собой глутаминовую кислоту и Хаа9 отсутствует;
без ограничения указанными вариантами.
В еще одном типичном воплощении аналог инсулина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, 18, 20 или 22.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена нуклеиновая кислота, кодирующая аналог инсулина.
В типичном воплощении нуклеиновая кислота по настоящему изобретению содержит нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 17, 19 и 21.
- 2 045778
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий указанную нуклеиновую кислоту.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен трансформант, трансформированный рекомбинантным вектором экспрессии.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ получения аналога инсулина, включающий:
а) получение рекомбинантного вектора экспрессии, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид-аналог инсулина;
б) трансформацию клетки-хозяина рекомбинантным вектором экспрессии и получение трансформанта из указанной клетки-хозяина;
в) культивирование трансформанта и экспрессию пептида-аналога инсулина; и
г) выделение и очистку экспрессированного пептида-аналога инсулина.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция для лечения диабета, содержащая аналог инсулина в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель.
Полезные эффекты.
Аналоги инсулина по настоящему изобретению демонстрируют значительно улучшенный in vitroэффект по сравнению с нативным инсулином, и поэтому ожидают, что введение указанных аналогов инсулина даже в небольшом количестве будет достаточным для лечения и, таким образом, их можно будет эффективно использовать для лечения диабета.
Описание графических материалов
На фиг. 1 показан результат анализа чистоты аналогов инсулина по настоящему изобретению посредством белкового электрофореза и, в качестве примера, результат для аналога инсулина 1 (дорожка 1 - маркер размера; и дорожка 2 - аналог инсулина 1).
На фиг. 2 показан результат анализа чистоты аналогов инсулина по настоящему изобретению посредством хроматографии с обращенной фазой и эксклюзионной хроматографии и, в качестве примера, результат для аналога инсулина 1.
На фиг. 3 показан результат пептидного картирования аналогов по настоящему изобретению и, в качестве примера, результат для аналога инсулина 1, где USP-инсулин соответствует нативному инсулину, использованному в качестве контроля.
Наилучший вариант осуществления изобретения
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
В то же время, каждое из объяснений и типичных воплощений, раскрытых здесь, применимо к другим объяснениям и типичным воплощениям. То есть объем настоящего изобретения включает все возможные комбинации различных элементов, раскрытых здесь. Кроме того, объем настоящего изобретения не следует ограничивать конкретными описаниями, приведенными ниже.
Настоящее изобретение относится к новому инсулину и, конкретно, к аналогу инсулина с улучшенным in vitro-эффектом по сравнению с нативным инсулином.
При использовании здесь термин аналог инсулина относится к модифицированному аналогу нативного инсулина, полученному модификациией части аминокислоты (аминокислот) нативного инсулина в форме вставки, делеции или замены, и, в частности, он включает различные аналоги нативного инсулина с улучшенным in vitro-эффектом по сравнению с нативным инсулином.
Нативный инсулин представляет собой гормон, секретируемый поджелудочной железой, и обычно функционирует, стимулируя абсорбцию глюкозы клетками и ингибируя распад жиров, контролируя, посредством этого, уровни глюкозы в крови in vivo. Инсулин образуется при процессинге его предшественника, проинсулина, не обладающего функцией контроля уровней глюкозы в крови. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей, то есть А-цепи и В-цепи, содержащих 21 и 30 аминокислот, соответственно, соединенных друг с другом дисульфидными связями. Каждая из А-цепи и В-цепи может содержать аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, показанные ниже.
А-цепь.
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 1)
В-цепь.
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-GlyPhe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO: 2)
Инсулин по настоящему изобретению относится к аналогам инсулина, полученным с применением технологии генетической рекомбинации, но инсулин не ограничен указанными аналогами и включает любой инсулин с улучшенным in vitro-эффектом по сравнению с нативным инсулином. Предпочтительно, инсулин по настоящему изобретению включает инвертированный инсулин, варианты инсулина, фрагменты инсулина и так далее. Инсулин может быть получен не только рекомбинантным методом, но также твердофазным синтезом, и способ получения не ограничен указанными методами.
- 3 045778
Эти аналоги инсулина, представляющие собой пептиды, обладающие способностью контролировать уровни глюкозы в крови in vivo, эквивалентной или соответствующей нативному инсулину, включают любые агонисты инсулина, производные инсулина, фрагменты инсулина, варианты инсулина и так далее.
При использовании здесь термин агонист инсулина относится к веществу, которое может связываться с рецептором инсулина in vivo независимо от структуры инсулина и, посредством этого, демонстрирует биологическую активность, эквивалентную биологической активности инсулина.
При использовании здесь термин производное инсулина может относиться к пептиду, гомологичному каждой из аминокислотных последовательностей А-цепи и В-цепи нативного инсулина, в форме, обладающей способностью контролировать уровни глюкозы в крови in vivo, где часть групп в аминокислотном остатке модифицирована химическим замещением (например, альфа-метилированием, альфагидроксилированием), удалением (например, дезаминированием) или модификацией (например, Nметилированием).
Кроме того, при использовании здесь термин производное инсулина может относиться к пептидному мимику и низко- или высокомолекулярному соединению, которое может контролировать уровни глюкозы в крови in vivo, связываясь с рецептором инсулина, несмотря на отсутствие гомологии аминокислотной последовательности нативного инсулина.
При использовании здесь термин фрагмент инсулина относится к форме инсулина, где по меньшей мере одна аминокислота добавлена или удалена, и добавленная аминокислота может представлять собой аминокислоту, не присутствующую в природе (например, аминокислоту D-типа), и фрагмент инсулина обладает способностью контролировать уровни глюкозы в крови in vivo.
При использовании здесь термин вариант инсулина относится к пептиду, отличающемуся от инсулина по меньшей мере одной аминокислотной последовательностью и также обладающему способностью контролировать уровни глюкозы в крови in vivo.
Способы, применяемые в получении агонистов, производных, фрагментов и вариантов инсулина могут быть применены по отдельности или в комбинации. Например, в объем настоящего изобретения могут быть включены пептиды, обладающие способностью контролировать уровни глюкозы в крови in vivo, отличающиеся по меньшей мере одной аминокислотной последовательностью, в которых аминокислотный остаток на N-конце дезаминирован.
Аналог инсулина по настоящему изобретению исключительным образом включает любой пептид, in vitro-эффект которого улучшен по сравнению с нативным инсулином посредством введения замены, вставки или делеции аминокислоты (аминокислот) или посттрансляционной модификации (например, метилирования, ацилирования, убиквитинирования и межмолекулярного ковалентного связывания) аминокислотных последовательностей (SEQ ID NO: 1 и 2) А-цепи и В-цепи нативного инсулина. Для замены или вставки аминокислоты (аминокислот) могут быть использованы не только 20 аминокислот, обычно наблюдаемые в человеческих белках, но также атипичные или искусственные аминокислоты. Атипичные аминокислоты могут быть приобретены у Sigma-Aldrich, ChemPep, Genzymepharmaceuticals и так далее. Пептиды, содержащие эти аминокислоты, и обычные пептидные последовательности могут быть синтезированы или приобретены у коммерческих компаний, синтезирующих пептиды, таких как American Peptide Company, Bachem (США) и Anygen (Корея).
Конкретно, аналоги инсулина по настоящему изобретению могут представлять собой аналоги инсулина, содержащие модификацию или удаление определенного аминокислотного остатка (остатков) Ацепи и В-цепи нативного инсулина, и, предпочтительно, могут представлять собой аналоги инсулина, где определенный аминокислотный остаток (остатки) А-цепи нативного инсулина модифицирован (модифицированы) и определенный аминокислотный остаток (остатки) В-цепи нативного инсулина модифицирован (модифицированы) и/или удален (удалены).
Предпочтительно, аналоги инсулина по настоящему изобретению могут представлять собой аналог, где 14-й аминокислотный остаток, тирозин, аминокислотной последовательности А-цепи, представленной SEQ ID NO: 1, заменен на глутаминовую кислоту, аспарагин или аланин, или аналог, где 16-й аминокислотный остаток, тирозин, заменен на глутаминовую кислоту и/или 25-й аминокислотный остаток, фенилаланин, аминокислотной последовательности В-цепи, представленной SEQ ID NO: 2, удален, или могут включать все эти аналоги.
Более предпочтительно, аналоги инсулина по настоящему изобретению могут представлять собой аналоги инсулина, содержащие А-цепь SEQ ID NO: 3, представленную следующей общей формулой 1, и В-цепь SEQ ID NO: 4, представленную следующей общей формулой 2.
Общая формула 1.
Xaal-Ile-Val-Glu-Xaa2-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa3-Leu-Xaa4-Gln-Xaa5-Glu-Asn-Xaa6-Cys-Xaa7 (SEQ ID NO: 3)
В приведенной выше общей формуле 1:
Xaa1 представляет собой аланин, глицин, глутамин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин;
Хаа2 представляет собой аланин, глутаминовую кислоту, глутамин, гистидин или аспарагин;
- 4 045778
Хаа3 представляет собой аланин, серин, глутамин, глутаминовую кислоту, гистидин или аспарагин;
Хаа4 представляет собой аланин, тирозин, глутаминовую кислоту, гистидин, лизин, аспарагиновую кислоту или аспарагин;
Хаа5 представляет собой аланин, лейцин, тирозин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин;
Хаа6 представляет собой аланин, тирозин, серии, глутаминовую кислоту, гистидин или аспарагин; и
Хаа7 представляет собой аспарагин, глицин, гистидин или аланин.
Общая формула 2.
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa8-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-GlyPhe-Xaa9-Tyr-Xaa10-Xaall-Lys-Thr (SEQ ID NO: 4)
В приведенной выше общей формуле 2:
Хаа8 представляет собой тирозин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту или отсутствует;
Хаа9 представляет собой фенилаланин или отсутствует;
Хаа10 представляет собой треонин или отсутствует; и
Xaa11 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту или отсутствует (где пептиды, содержащие А-цепь SEQ ID NO: 1 и В-цепь SEQ ID NO: 2, могут быть исключены).
В более конкретном типичном воплощении аналог инсулина может представлять собой аналог инсулина, где:
в общей формуле 1
Xaa1 представляет собой глицин,
Хаа2 представляет собой глутамин,
Хаа3 представляет собой серин,
Хаа4 представляет собой аланин, глутаминовую кислоту или аспарагин,
Хаа5 представляет собой лейцин,
Хаа6 представляет собой тирозин и
Хаа7 представляет собой аспарагин; и в общей формуле 2
Хаа8 представляет собой тирозин или глутаминовую кислоту,
Хаа9 представляет собой фенилаланин или отсутствует,
Хаа10 представляет собой треонин и
Xaa11 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту или отсутствует;
без ограничения указанными вариантами.
В другом конкретном типичном воплощении аналог инсулина может представлять собой аналог инсулина, где:
в общей формуле 1
Xaa1 представляет собой глицин,
Хаа2 представляет собой глутамин,
Хаа3 представляет собой серин,
Хаа4 представляет собой глутаминовую кислоту или аспарагин,
Хаа5 представляет собой лейцин,
Хаа6 представляет собой тирозин и
Хаа7 представляет собой аспарагин; и в общей формуле 2
Хаа8 представляет собой тирозин,
Хаа9 представляет собой фенилаланин или отсутствует,
Хаа10 представляет собой треонин и
Xaa11 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту или отсутствует;
без ограничения указанными вариантами.
В еще одном конкретном типичном воплощении аналог инсулина может содержать А-цепь общей формулы 1 и В-цепь, где в В-цепи SEQ ID NO: 4 Хаа8 представляет собой тирозин, Хаа9 отсутствует, Хаа10 представляет собой треонин и Xaa11 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту или отсутствует, без ограничения указанными вариантами.
Аналог инсулина может содержать А-цепь общей формулы 1 и В-цепь, где в В-цепи SEQ ID NO: 4 Хаа8 представляет собой тирозин, Хаа9 представляет собой фенилаланин, Хаа10 отсутствует и Xaa11 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту или отсутствует, без ограничения указанными вариантами.
Аналог инсулина может характеризоваться тем, что в А-цепи SEQ ID NO: 3 Xaa1 представляет собой глицин, Хаа2 представляет собой глутамин, Хаа3 представляет собой серин, Хаа4 представляет собой глутаминовую кислоту, Хаа5 представляет собой лейцин, Хаа6 представляет собой тирозин и Хаа7
- 5 045778 представляет собой аспарагин, и в В-цепи SEQ ID NO: 4 Хаа8 представляет собой тирозин, Хаа9 представляет собой фенилаланин, Xaa10 представляет собой треонин и Xaa11 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту или отсутствует, без ограничения указанными вариантами.
Аналог инсулина может характеризоваться тем, что в А-цепи SEQ ID NO: 3 Xaa1 представляет собой глицин, Хаа2 представляет собой глутамин, Хаа3 представляет собой серин, Хаа4 представляет собой аспарагин, Хаа5 представляет собой лейцин, Хаа6 представляет собой тирозин и Хаа7 представляет собой аспарагин, и в В-цепи SEQ ID NO: 4 Хаа8 представляет собой тирозин, Хаа9 представляет собой фенилаланин, Xaa10 представляет собой треонин и Xaa11 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту или отсутствует, без ограничения указанными вариантами.
В еще одном конкретном типичном воплощении аналог инсулина может характеризоваться тем, что в А-цепи SEQ ID NO: 3 Xaa1 представляет собой глицин, Хаа2 представляет собой глутамин, Хаа3 представляет собой серин, Хаа4 представляет собой глутаминовую кислоту, Хаа5 представляет собой лейцин, Хаа6 представляет собой тирозин и Хаа7 представляет собой аспарагин, и в В-цепи SEQ ID NO: 4 Хаа8 представляет собой тирозин, Хаа9 отсутствует, Xaa10 представляет собой треонин и Xaa11 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту или отсутствует, без ограничения указанными вариантами.
В еще одном конкретном типичном воплощении аналог инсулина может характеризоваться тем, что в А-цепи SEQ ID NO: 3 Xaa1 представляет собой глицин, Хаа2 представляет собой глутамин, Хаа3 представляет собой серин, Хаа4 представляет собой аланин, Хаа5 представляет собой лейцин, Хаа6 представляет собой тирозин и Хаа7 представляет собой аспарагин, и в В-цепи SEQ ID NO: 4 Хаа8 представляет собой глутаминовую кислоту, Хаа9 отсутствует, Xaa10 представляет собой треонин и Xaa11 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту или отсутствует, без ограничения указанными вариантами.
В типичном воплощении аналоги инсулина по настоящему изобретению могут включать следующие аналоги:
1) аналог инсулина 1: пептид, где 14-й аминокислотный остаток аминокислотной последовательности А-цепи, представленной SEQ ID NO: 3, представляет собой глутаминовую кислоту и 25-й аминокислотный остаток аминокислотной последовательности В-цепи, представленной SEQ ID NO: 4, представляет собой фенилаланин, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 16, кодируемый нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15;
2) аналог инсулина 2: пептид, где 14-й аминокислотный остаток аминокислотной последовательности А-цепи, представленной SEQ ID NO: 3, представляет собой аспарагин и 25-й аминокислотный остаток аминокислотной последовательности В-цепи, представленной SEQ ID NO: 4, представляет собой фенилаланин, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 18, кодируемый нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17;
3) аналог инсулина 3: пептид, где 14-й аминокислотный остаток аминокислотной последовательности А-цепи, представленной SEQ ID NO: 3, представляет собой глутаминовую кислоту и 25-й аминокислотный остаток аминокислотной последовательности В-цепи, представленной SEQ ID NO: 4, удален, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20, кодируемый нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19;
4) аналог инсулина 4: пептид, где 14-й аминокислотный остаток аминокислотной последовательности А-цепи, представленной SEQ ID NO: 3, представляет собой аланин, 16-й аминокислотный остаток аминокислотной последовательности В-цепи, представленной SEQ ID NO: 4, представляет собой глутаминовую кислоту и 25-й аминокислотный остаток отсутствует, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22, кодируемый нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21.
При использовании здесь термин in vitro-эффект относится к поглощению глюкозы под действием аналога инсулина, и его показателем является результат измерения EC50 относительно поглощения глюкозы клетками мышиного происхождения 3T3-L1 с адипоцитарной дифференцировкой.
В типичном воплощении при измерении in vitro-эффекта аналогов инсулина 1-3 аналог инсулина 1 продемонстрировал повышение поглощения глюкозы на 238,4%, аналог инсулина 2 продемонстрировал повышение на 241,7% и аналог инсулина 3 продемонстрировал повышение на 705% по сравнению с нативным инсулином, соответственно, подтвердив посредством этого, что аналоги инсулина по настоящему изобретению демонстрируют выдающийся in vitro-эффект, в 2-7 раз превосходящий эффект нативного инсулина (табл. 1).
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные выше аналоги инсулина.
При использовании здесь термин нуклеиновая кислота относится к дезоксирибонуклеотиду (ДНК) или рибонуклеотиду (РНК), включая геномную ДНК, кДНК и РНК, образующуюся при их транс- 6 045778 крипции, и нуклеотид как основная структурная единица включает не только естественные нуклеотиды, но также аналоги с модификациями сахара или основания (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584, 1990). Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть выделена и получена с применением стандартных молекулярнобиологических технологий. Например, нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть получена ПЦР-амплификацией с использованием подходящих праймерных последовательностей, основанных на последовательности гена нативного инсулина (NM_000207.2, NCBI), и может быть получена технологией стандартного синтеза с использованием автоматического ДНК-синтезатора.
Предпочтительно, нуклеиновая кислота по настоящему изобретению включает нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO: 15, 17, 19 и 21. Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению включает не только нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO: 15, 17, 19 и 21, но также все последовательности, по меньшей мере на 70% гомологичные указанным выше последовательностям, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 98%, и пептид, кодируемый указанной выше нуклеиновой кислотой, может связываться с рецепторами инсулина in vivo, демонстрируя посредством этого по существу такую же биологическую активность, как инсулин.
При использовании здесь термин гомология относится к степени сходства с заданной аминокислотной последовательностью нативного белка дикого типа или кодирующей его полинуклеотидной последовательностью и включает последовательности, на описанный выше или больший процент идентичные аминокислотным последовательностям или полинуклеотидным последовательностям по настоящему изобретению. Гомология может быть определена сравнением двух заданных последовательностей невооруженным глазом или может быть определена с применением биоинформационного алгоритма, позволяющего анализировать гомологию выравниванием рассматриваемых последовательностей для сравнения. Гомология двух заданных аминокислотных последовательностей может быть указана как процент. Полезный автоматизированный алгоритм доступен для применения в модулях GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Мэдисон, штат Висконсин, США). Алгоритм выравнивания, автоматизированный в указанных выше модулях, включает алгоритмы выравнивания последовательностей Нидлмана-Вунша (Needleman & Wunsch), Пирсона-Липмана (Pearson & Lipman) и Смита-Уотермана (Smith & Waterman). Другие полезные алгоритмы выравнивания последовательностей и определения гомологии автоматизированы в программном обеспечении, включающем FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST и CLUSTAL W.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аналог инсулина. Рекомбинантный вектор по настоящему изобретению может быть сконструирован как вектор для обычного клонирования или экспрессии и может быть сконструирован как вектор для использования прокариотической клетки или эукариотической клетки в качестве клетки-хозяина.
При использовании здесь термин вектор относится к рекомбинантному вектору, способному экспрессировать целевой белок в подходящей клетке-хозяине, представляющей собой генную конструкцию, содержащую необходимые функционально связанные регуляторные факторы, обеспечивающие экспрессию введенной нуклеиновой кислоты. Настоящее изобретение позволяет получить рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аналог инсулина, и аналог инсулина по настоящему изобретению может быть получен трансформацией или трансфекцией клетки-хозяина указанным рекомбинантным вектором.
В настоящем изобретении нуклеиновая кислота, кодирующая аналог инсулина, функционально связана с промотором. При использовании здесь термин функционально связанный относится к функциональной связи регуляторной последовательности, регулирующей экспрессию нуклеиновой кислоты (например, промотора, сигнальной последовательности, сайта связывания рибосом, последовательности терминации транскрипции и так далее) с другой нуклеотидной последовательностью, посредством чего регуляторная последовательность может регулировать транскрипцию и/или трансляцию другой нуклеотидной последовательности.
При использовании здесь термин промотор относится к нетранслируемой последовательности нуклеиновой кислоты, расположенной выше кодирующей области, содержащей сайт связывания полимеразы и обладающей активностью инициации транскрипции гена, расположенного ниже промотора, с образованием мРНК, то есть, домену ДНК, с которым связывается полимераза, инициируя транскрипцию гена, и он расположен в 5'-домене инициации транскрипции с образованием мРНК.
Например, когда вектор по настоящему изобретению представляет собой рекомбинантный вектор и в качестве клетки-хозяина используют прокариотическую клетку, обычно следует включать сильный промотор (например, промотор tac, промотор lac, промотор lacUV5, промотор lpp, промотор pLλ, промотор pRλ, промотор rac5, промотор amp, промотор recA, промотор SP6, промотор trp, промотор Т7 и так далее), способный проводить транскрипцию, сайт связывания рибосом для инициации трансляции и по
- 7 045778 следовательности терминации транскрипции/трансляции.
Кроме того, вектор для использования в настоящем изобретении, может быть получен манипуляцией с плазмидами (например, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, серия pGEX, серия рЕТ, серия pPICZa, pUC19 и так далее), фагами (например, λgt4 λB, λ-Charon, λΔz1, M13 и так далее) или вирусами (например, SV40 и так далее), обычно используемыми в данной области.
В то же время, когда вектор по настоящему изобретению представляет собой рекомбинантный вектор и в качестве клетки-хозяина используют эукариотическую клетку, могут быть использованы промоторы, имеющие происхождение от геномов клеток млекопитающих (например, металлотионеиновый промотор), или промоторы, имеющие происхождение от вирусов млекопитающих (например, поздний аденовирусный промотор, 7.5К-промотор папилломавируса, промотор SV40, цитомегаловирусный промотор и tk-промотор HSV), и обычно вектор содержит полиаденилированную последовательность (например, терминатор бычьего гормона роста и полиаденилированную последовательность, имеющую происхождение от SV40) в качестве последовательности терминации транскрипции.
Кроме того, рекомбинантный вектор по настоящему изобретению содержит ген антибиотикорезистентности, обычно используемый в данной области в качестве селектируемого маркера, и может содержать, например, гены резистентности к ампициллину, гентамицину, карбенициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, канамицину, генетицину, неомицину и тетрациклину.
Рекомбинантный вектор по настоящему изобретению может дополнительно содержать другую последовательность, облегчающую очистку получаемых целевых белков, то есть одноцепочечного аналога инсулина, проинсулина или его аналогов. Включенная дополнительно последовательность может представлять собой маркерную последовательность для очистки белка, например, глутатион-S-трансферазу (Pharmacia, США), мальтозосвязывающий белок (NEB, США), FLAG (IBI, США), 6-гистидин и так далее, но типы последовательностей, необходимых для очистки целевых белков, не ограничены указанными вариантами.
Слитые белки, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора, содержащего указанную выше маркерную последовательность, могут быть очищены аффинной хроматографией. Например, при присоединении глутатион-S-трансферазы может быть использован глутатион, являющийся субстратом этого фермента, и при использовании 6-гистидиновой метки желаемый целевой белок может быть легко получен с использованием Ni-NTA-колонки.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен трансформант, трансформированный рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую аналог инсулина.
При использовании здесь термин трансформация относится к процессу введения ДНК в клеткухозяина и обеспечения возможности репликации указанной ДНК в клетке-хозяине в форме хромосомного фактора или в результате интеграции в хромосому, представляющему собой феномен искусственного генетического изменения посредством введения экзогенной ДНК в клетку.
Метод трансформации, применяемый в настоящем изобретении, может представлять собой любой метод трансформации, и она может быть легко проведена обычным методом, применяемым в данной области. Примеры обычно применяемых методов трансформации могут включать метод осаждения с CaCl2, метод Ханахана (Hanahan) с улучшенной эффективностью и использованием диметилсульфоксида (DMSO) в качестве восстанавливающего агента в методе осаждения с CaCl2, электропорацию, метод осаждения с CaPO4, метод слияния протопластов, метод перемешивания с использованием волокон карбида кремния, трансформацию, опосредованную агробактериями, трансформацию с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ), трансформацию, опосредованную декстрансульфатом, липофектамином и сушкой/супрессией, и так далее.
Метод трансформации рекомбинантным вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую аналог инсулина по настоящему изобретению, может не быть ограничен этими методами, и может быть применен любой, без ограничения, метод трансформации или трансфекции, обычно применяемый в данной области.
Трансформант по настоящему изобретению может быть получен введением рекомбинантного вектора, содержащего целевую нуклеиновую кислоту, кодирующую аналог инсулина, в клетку-хозяина. Относительно подходящего хозяина, используемого в настоящем изобретении, может не быть существенных ограничений, при условии, что он может экспрессировать нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Примеры подходящих хозяев могут включать бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, такие как Е. coli, бактерии, принадлежащие к роду Bacillus, такие как Bacillus subtilis, бактерии, принадлежащие к роду Pseudomonas, такие как Pseudomonas putida, дрожжи, такие как Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe, клетки насекомых, таких как Spodoptera frugiperda (SF9), и клетки животных, такие как СНО, COS и BSC. Предпочтительно, в качестве клетки-хозяина инспользуют Е. coli.
В типичном воплощении соответствующую нуклеотидную последовательность, кодирующую аналоги инсулина 1-3 по настоящему изобретению, амплифицировали посредством ПЦР и амплифициро
- 8 045778 ванные генные фрагменты клонировали в вектор pET22b (Novagen). Для экспрессии аналогов инсулина в форме внутриклеточных включений вектор рЕТ22Ь обрабатывали рестриктазами NdeI и BamHI, удаляя из него сигнальную последовательность, ПЦР-амплифицированные продукты аналогов инсулина обрабатывали теми же рестриктазами NdeI и BamHI и соответствующую выделенную ДНК вводили в вектор для клонирования рЕТ22Ь с использованием ДНК-лигазы Т4. Полученные таким образом векторы экспрессии были названы рЕТ22b-аналог инсулина 1-4, соответственно.
Векторы экспрессии рЕТ22b-аналог инсулина 1-4 кодируют аминокислотные последовательности представленные SEQ ID NO: 16, 18, 20 и 22, соответственно, под контролем промотора Т7, и каждый из аналогов инсулина экспрессировали в форме включений в клетке-хозяине, соответственно.
Е. coli трансформировали рекомбинантными векторами рЕТ22b-аналог инсулина 1-4, содержащими нуклеиновые кислоты, кодирующие каждый из аналогов инсулина SEQ ID NO: 16, 18, 20, и 22, соответственно, и посредством этого получали трансформантов, экспрессировавших их в форме включений.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ получения аналога инсулина с использованием указанных трансформантов.
Предпочтительно, согласно настоящему изобретению предложен способ получения аналога инсулина, включающий:
а) получение рекомбинантного вектора экспрессии, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую аналог инсулина;
б) трансформацию клетки-хозяина рекомбинантным вектором экспрессии и получение трансформанта из указанной клетки-хозяина;
в) культивирование трансформанта и экспрессию аналога инсулина; и
г) выделение и очистку экспрессированного пептида-аналога инсулина.
Среда, используемая для культивирования трансформантов по настоящему изобретению, должна соответствовать требованиям надлежащего культивирования клетки-хозяина. Источники углерода для включения в среду для выращивания клетки-хозяина могут быть надлежащим образом выбраны по решению специалиста в данной области в соответствии с трансформантами, получаемыми из указанной клетки-хозяина, и могут быть выбраны подходящие условия культивирования для контроля продолжительности культивирования и количества культивированных клеток.
Примеры используемых источников сахара могут включать сахара и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти вещества могут быть использованы по отдельности или в комбинации.
Примеры используемых источников азота могут включать пептон, дрожжевой экстракт, мясной бульон, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевую муку, мочевину или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Источники азота могут быть использованы по отдельности или в комбинации.
Примеры используемых источников фосфора могут включать дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия или соответствующую натрийсодержащую соль. В дополнение, культуральная среда может содержать соль металла, такую как сульфат магния или сульфат железа, необходимую для роста трансформанта. Кроме того, могут быть использованы вещества, необходимые для роста, такие как аминокислоты и витамины. Более того, в культуральных средах могут быть использованы подходящие предшественники. Указанные выше источники могут быть подходящим образом добавлены в культуру во время культивирования методом периодической культуры или непрерывной культуры. рН культуры можно подходящим образом корректировать с использованием основного соединения, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия и аммиак, или кислого соединения, такого как фосфорная кислота и/или серная кислота. В дополнение, может быть добавлен пеногаситель, такой как полигликолевый эфир жирной кислоты, для предотвращения пенообразования. Кроме того, для поддержания аэробного состояния культуры в нее может быть добавлен кислород или кислородсодержащий газ (например, воздух). Трансформанта по настоящему изобретению можно культивировать при 20-45°С и предпочтительно при 25-40°С. Кроме того, культивирование продолжают до получения максимального количества желаемых аналогов инсулина, и, в связи с этим, продолжительность культивирования может обычно составлять от 10 до 160 ч.
Как описано выше, трансформант по настоящему изобретению может продуцировать аналоги инсулина при обеспечении условий культивирования, подходящих для клеток-хозяев, и пептид-Nгликозидаза, образуемая ими в соответствии с составом вектора и характеристиками клеток-хозяев, может поступать в цитоплазму или периплазматическое пространство клеток-хозяев или во внеклеточную среду.
Экспрессированные белки, расположенные внутри или вне клетки-хозяина, могут быть очищены обычным методом.
Примеры методов очистки могут включать высаливание (например, осаждение сульфатом аммония, осаждение фосфатом аммония и так далее), осаждение растворителем (например, осаждение белковой
- 9 045778 фракции с использованием ацетона или этанола и так далее), диализ, гель-фильтрацию, ионный обмен или хроматографию, такую как колоночная хроматография с обращенной фазой, ультрафильтрация и так далее, и эти методы могут быть применены по отдельности или в комбинации.
Трансформант по настоящему изобретению характеризуется экспрессией аналогов инсулина 1-3 с рекомбинантного вектора рЕТ22b-аналог инсулина 1-3 в форме включений под контролем промотора Т7. Соответственно, предпочтительно преобразование аналогов инсулина 1-3, экспрессированных в форме включений, в растворимую форму с их последующим выделением и очисткой.
В типичном воплощении настоящее изобретение может дополнительно включать следующие стадии выделения и очистки аналогов инсулина, экспрессированных в форме включений, из трансформанта:
d-1) получение клеток трансформанта из культуры и их измельчение;
d-2) выделение экспрессированного пептида-аналога инсулина из лизата измельченных клеток с его последующим рефолдингом;
d-3) очистку пептида-аналога инсулина, прошедшего рефолдинг, посредством катионообменной хроматографии;
d-4) обработку очищенного пептида-аналога инсулина трипсином и карбоксипептидазой В; и d-5) последовательную очистку обработанного пептида-аналога инсулина катионообменной хроматографией и анионообменной хроматографией.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция для лечения диабета, содержащая указанные выше аналоги инсулина.
Фармацевтическая композиция, содержащая аналоги инсулина по настоящему изобретению, может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Примеры фармацевтически приемлемого носителя для перорального введения могут включать связывающий агент, скользящий агент, разрыхлитель, эксципиент, солюбилизирующий агент, диспергирующий агент, стабилизирующий агент, суспендирующий агент, краситель, корригент и так далее; для инъекционных композиций могут быть смешаны для применения буферный агент, консервант, анальгетик, изотонический агент, стабилизирующий агент и так далее; и в композициях для местного применения могут быть использованы основа, эксципиент, смазывающий агент, консервант и так далее. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть изготовлена сочетанием с различными фармацевтически приемлемыми носителями, описанными выше. Например, для перорального введения фармацевтическая композиция может быть изготовлена в форме таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, вафель и так далее. Для инъекций фармацевтическая композиция может быть изготовлена в форме однодозовых ампул или многодозовых контейнеров. Кроме того, фармацевтическая композиция может также быть изготовлена в форме растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул и композиций с длительным высвобождением.
В то же время, примеры подходящих носителей, эксципиентов и разбавителей могут включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, вода, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и так далее. Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать наполнитель, антикоагулянт, смазывающий агент, увлажнитель, корригент, эмульгатор, консервант и так далее.
В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ лечения диабета, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей аналоги инсулина по настоящему изобретению, субъекту, нуждающемуся в этом.
Аналоги инсулина по настоящему изобретению демонстрируют значительно улучшенный in vitroэффект по сравнению с нативным инсулином, и поэтому ожидают, что введение фармацевтической композиции, содержащей указанные выше аналоги инсулина, может быть эффективным для лечения диабета.
При использовании здесь термин введение относится к введению определенного вещества пациенту подходящим способом, и конъюгат по настоящему изобретению может быть введен любым известным способом введения, при условии, что лекарственное средство сможет проникнуть в целевую ткань. Например, может быть проведено внутрибрюшинное, внутривенное, внутримышечное, подкожное, внутрикожное, пероральное, местное, интраназальное, внутрилегочное и ректальное введение, но путь введения не ограничен указанными вариантами. Тем не менее, из-за расщепления пептидов при пероральном введении активные ингредиенты композиции для перорального введения должны быть заключены в оболочку или включены в композицию для защиты от расщепления в желудке. Предпочтительно, настоящая композиция может быть введена в форме для инъекций. Кроме того, фармацевтическая композиция может быть введена с использованием определенного устройства, обеспечивающего транспорт активных ингредиентов в целевую клетку.
Кроме того, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению могут определять тип лекарственного средства, используемого в качестве активного компонента, а также ряд соответствующих факторов, включая типы заболеваний, подлежащих лечению, пути введения, возраст, пол и массу тела
- 10 045778 пациента и тяжесть заболевания. Поскольку фармацевтическая композиция по настоящему изобретению имеет отличные продолжительность сохранения и титр in vivo, это позволяет существенно снизить частоту введения и дозу фармацевтических лекарственных средств по настоящему изобретению.
Вариант осуществления изобретения.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие примеры. Тем не менее, эти примеры приведены лишь в целях наглядности, и изобретение не следует ограничивать этими примерами.
Пример 1. Конструирование и экспрессия вектора для аналогов инсулина.
Для конструирования аналогов инсулина с модификацией аминокислоты (аминокислот) А-цепи и/или В-цепи нативного инсулина синтезировали пары праймеров, состоящие из прямого праймера и обратного праймера, для амплификации аналогов инсулина с введением соответствующей модификации и затем проводили ПЦР с использованием кДНК проинсулина в качестве матрицы. В частности, использовали матрицу, где кДНК проинсулина (SC128255, OriGene) (см. последовательности ВС005255.1 и ААН05255) была клонирована в вектор рЕТ22Ь (Novagen) и для оптимальной рекомбинантной экспрессии инсулина нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 23 (ATG GCA АСА АСА ТСА АСА GCA ACT ACG CGT), кодирующая аминокислотную последовательность Met Ala Thr Thr Ser Thr Ala Thr Thr Arg (SEQ ID NO: 24), была введена в клонированную кДНК проинсулина в качестве N-концевого партнера по слиянию.
Конкретно, в настоящем изобретении были синтезированы следующие аналоги инсулина, содержащие аминокислотные модификации, показанные в табл. 1.
Таблица 1
Аминокислотные модификации | |
Аналог инсулина 1 | А14 Туг Glu |
Аналог инсулина 2 | А14 Туг —► Asn |
Аналог инсулина 3 | А14 Туг —► Glu + делеция В25 |
Аналог инсулина 4 | А14 Туг —► Ala + В16 Туг —► Glu, делеция В25 |
В табл. 1 выше аналог инсулина 1 представляет собой аналог с заменой 14-й аминокислоты аминокислотной последовательности А-цепи нативного инсулина, представленной SEQ ID NO: 1, то есть тирозина, на глутаминовую кислоту;
аналог инсулина 2 представляет собой аналог с заменой 14-й аминокислоты аминокислотной последовательности А-цепи нативного инсулина, представленной SEQ ID NO: 1, то есть тирозина, на аспарагин;
аналог инсулина 3 представляет собой аналог с заменой 14-й аминокислоты аминокислотной последовательности А-цепи нативного инсулина, представленной SEQ ID NO: 1, то есть тирозина, на глутаминовую кислоту и делецией 25-й аминокислоты аминокислотной последовательности В-цепи нативного инсулина, представленной SEQ ID NO: 2, то есть фенилаланина; и аналог инсулина 4 представляет собой аналог с заменой 14-й аминокислоты аминокислотной последовательности А-цепи нативного инсулина, представленной SEQ ID NO: 1, то есть тирозина, на аланин, заменой 16-й аминокислоты аминокислотной последовательности В-цепи нативного инсулина, представленной SEQ ID NO: 2, то есть тирозина, на глутаминовую кислоту и делецией 25-й аминокислоты аминокислотной последовательности В-цепи нативного инсулина, представленной SEQ ID NO: 2, то есть фенилаланина.
Соответствующие пары прямых праймеров и обратных праймеров, разработанные для амплификации аналогов инсулина 1-3, показаны в табл. 2 ниже.
Таблица 2
Последовательность | SEQ Ш NO: | |
Аналог инсулина 1 | 5'-ccagcatctgctccctcgaacagctggagaactactg-3' | 5 |
- 11 045778
5'-cagtagttctccagctgttcgagggagcagatgctgg-3' | 6 | |
Аналог инсулина 2 | 5'-cagcatctgctccctcaaccagctggagaactac-3' | 7 |
5 '-gtagttctccagctggttgagggagcagatgctg-3' | 8 | |
Аналог инсулина 3 | 5'-ccagcatctgctccctcgaacagctggagaactactg-3' | 5 |
5'-cagtagttctccagctgttcgagggagcagatgctgg-3' | 6 | |
5'-gcggggaacgaggcttctacacacccaagacccg-3' | 9 | |
5 '-cgggtcttgggtgtgtagaagcctcgttccccgc-3' | 10 | |
Аналог инсулина 4 | 5'-cagcatctgctccctcgcccagctggagaactac-3' | 11 |
5'-gtagttctccagctgggcgagggagcagatgctg-3' | 12 | |
5'-ctggtggaagctctcgagctagtgtgcggggaac-3' | 13 | |
5'-gttccccgcacactagctcgagagcttccaccag-3' | 14 | |
5'-gcggggaacgaggcttctacacacccaagacccg-3' | 9 | |
5 '-cgggtcttgggtgtgtagaagcctcgttccccgc-3' | 10 |
В табл. 2 выше пара праймеров, состоящая из SEQ ID NO: 5 и 6, была разработана для замены 14-й аминокислоты аминокислотной последовательности А-цепи нативного инсулина, то есть тирозина, на глутаминовую кислоту; пара праймеров, состоящая из SEQ ID NO: 7 и 8, была разработана для замены 14-й аминокислоты аминокислотной последовательности А-цепи нативного инсулина, то есть тирозина, на аспарагин; пара праймеров, состоящая из SEQ ID NO: 9 и 10, была разработана для делеции 25-й аминокислоты аминокислотной последовательности В-цепи нативного инсулина, то есть фенилаланина; пара праймеров, состоящая из SEQ ID NO: 11 и 12, была разработана для замены 14-й аминокислоты аминокислотной последовательности А-цепи нативного инсулина, то есть тирозина, на аланин; и пара праймеров, состоящая из SEQ ID NO: 13 и 14, была разработана для замены 16-й аминокислоты аминокислотной последовательности В-цепи нативного инсулина, то есть тирозина, на глутаминовую кислоту.
Для проведения ПЦР для амплификации аналогов инсулина с соответствующими модификациями готовили реакционный раствор, смешивая 150 нг ДНК-матрицы, 1 мл каждого 100 пМ праймера, 5 мл 2,5 мМ dNTP, 10 единиц pfx-полимеразы (Invitrogen, США) и 10Х буферный раствор. Реакционный раствор подвергали начальной денатурации при 95°С в течение 30 с с последующим повторением 18 циклов отжига при 95°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 68°С в течение 6 мин и, в завершение, оставляли при 68°С на 5 мин. Полученные таким образом ПЦР-амплифицированные продукты выделяли с использованием набора для выделения из геля (Qiagen, Германия) и обрабатывали рестриктазами NdeI и BaтHI, получая фрагменты для введения. Вектор рЕТ22Ь (Novagen, США) затем расщепляли теми же рестриктазами и полученные фрагменты выделяли с использованием того же набора для выделения из геля. Указанные выше фрагменты для введения лигировали с подготовленным таким образом вектором, используя лигазу Т4, с получением векторов экспрессии pET22b-аналог инсулина 1-4. Указанные векторы экспрессии содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие аминокислотные последовательности аналогов инсулина 1-4, под контролем промотора Т7, и эти векторы позволяют экспрессировать белки-аналоги инсулина в форме включений в клетке-хозяине.
Полученный таким образом вектор экспрессии pET22b-аналог инсулина 1 по настоящему изобретению содержит нуклеиновую кислоту, имеющую нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, кодирующую аналог инсулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 16; полученный таким образом вектор экспрессии pET22b-аналог инсулина 2 по настоящему изобретению содержит нуклеиновую кислоту, имеющую нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, кодирующую аналог инсулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 18; полученный таким образом вектор экспрессии pET22b-анαлог инсулина 3 по настоящему изобретению содержит нуклеиновую кислоту, имеющую нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19, кодирующую аналог инсулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20; и полученный таким образом вектор экспрессии pEt22b-аналог инсулина 4 по настоящему изобретению содержит нуклеиновую кислоту, имеющую нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21, кодирующую аналог инсулина, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22.
Последовательности ДНК и последовательности белков каждого из аналогов инсулина 1-4 показаны в табл. 3 ниже.
- 12 045778
Таблица 3
Последовательность | SEQ ID NO: | ||
Аналог инсулина 1 | ДНК | ТТС GTT ААС САА САС TTG TGT GGC ТСА САС CTG GTG GAA GCT СТС ТАС СТА GTG TGC GGG GAA CGA GGC ТТС ТТС ТАС АСА ССС AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA С AA TGC TGT ACC AGC АТС TGC ТСС CTC GAA CAG CTG GAG ААС TAC TGC AAC TGA | 15 |
Белок | Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Glu Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn | 16 | |
Аналог инсулина 2 | ДНК | TTC GTT ААС САА CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT СТС ТАС СТА GTG TGC GGG GAA CGA GGC ТТС ТТС ТАС АСА CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA С AA TGC TGT ACC AGC АТС TGC TCC CTC AAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TGA | 17 |
Белок | Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai | 18 |
- 13 045778
Glu Ala Leu Туг Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Asn Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn | |||
Аналог инсулина 3 | ДНК | TTC GTT AAC САА CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT СТС ТАС СТА GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC ТАС АСА CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG C AG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG AAG CGT GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC AGC АТС TGC ТСС CTC GAA CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TGA | 19 |
Белок | Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly He Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Glu Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn | 20 | |
Аналог инсулина 4 | ДНК | TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGC TCA CAC CTG GTG GAA GCT CTC GAG СТА GTG TGC GGG GAA CGA GGC TTC ТАС АСА CCC AAG ACC CGC CGG GAG GCA GAG GAC CTG CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT GGT GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCC CTG GAG GGG TCC CTG CAG | 21 |
- 14 045778
AAG CGT GGC ATT GTG GAA САА TGC TGT АСС AGC АТС TGC ТСС СТС GCC CAG CTG GAG ААС ТАС TGC AAC TGA | |||
Белок | Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Glu Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Vai Gly Gin Vai Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly He Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Ala Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn | 22 |
Пример 2. Экспрессия рекомбинантных аналогов инсулина.
Рекомбинантную экспрессию аналогов инсулина по настоящему изобретению под контролем промотра Т7 проводили следующим образом. Е. coli BL21-DE3 (Е. coli В F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal λDE3) (Novagen, США) трансформировали каждым из векторов экспрессии аналогов инсулина, полученных в примере 1. Трансформацию проводили с применением метода, рекомендованного Novagen, изготовителем Е. coli BL21-DE3. Каждую отдельную колонию, трансформированную векторами экспрессии аналогов инсулина, собирали, засевали в 2Х жидкую среду Лурия (Luria Broth, LB), содержащую 50 мкг/мл ампициллина, и культивировали при 37°С в течение 15 ч. Культуру рекомбинантных Е. coli и 2Х среду LB, содержащую 30% глицерина, смешивали в соотношении 1:1 (об./об.), аликвоты смеси по 1 мл помещали в каждую криопробирку, соответственно, и хранили при -140°С. Полученные клетки использовали как исходные для получения рекомбинантных аналогов инсулина.
Для экспрессии рекомбинантных аналогов инсулина по одной пробирке каждых исходных клеток разводили в 500 мл 2Х LB и инкубировали на водяной бане с шейкером при 37°С в течение 14-16 ч. Инкубацию прекращали при достижении значения OD 5,0 или выше, и полученную культуру использовали в качестве посевной культуры. Посевную культуру засевали в 17 л ферментационной среды с использованием ферментера объемом 50 л (MSJ-U2, В.Е. MARUBISHI, Япония) и начинали первую периодическую ферментацию. Культивирование проводили при 37°С и скорости перемешивания 500 об/мин с подачей воздуха 20 л/мин (1 об./об./мин) и поддержанием рН 6,70 30%-ой аммиачной водой. По мере ферментации при уменьшении количества питательных веществ в культуральной среде ферментацию проводили в подпитываемой культуре, добавляя подпитывающий раствор. Мониторинг роста бактерий проводили по значениям OD, и при достижении значения OD 100 или более вносили IPTG в конечной концентрации 500 мкМ. После внесения культивирование продолжали еще приблизительно 23-25 ч. По завершении культивирования рекомбинантные бактерии выделяли центрифугированием и хранили при 80°С до использования.
Пример 3. Выделение и очистка рекомбинантных аналогов инсулина.
Для выделения и очистки рекомбинантных аналогов инсулина, экспрессированных в примере 2, из трансформантов клетки лизировали, как показано ниже, с последующим рефолдингом для преобразования аналогов инсулина, экспрессированных в форме нерастворимых в воде включений, в водорастворимую форму.
< 3-1> Выделение и рефолдинг рекомбинантных аналогов инсулина.
Конкретно, каждый клеточный осадок ресуспендировали в 1 л солюбилизирующего буферного раствора (50 мМ трис-HCl (рН 9,0), 1 мМ EDTA (рН 8,0), 0,2 М NaCl и 0,5% Triton X-100) и клетки лизировали с использованием микрофлюидайзера М-110ЕН (AC Technology Corp. Model M1475C) при давлении 15000 psi (103,4 МПа). Клеточные лизаты центрифугировали при 7000 об/мин и 4°С в течение 20 мин и супернатант удаляли. Полученный осадок ресуспендировали в 3 л промывочного буфера (0,5% Triton X100, 50 мМ трис (рН 8,0), 0,2 М NaCl и 1 мМ EDTA). Проводили центрифугирование при 7000 об/мин и 4°С в течение 20 мин и полученный осадок ресуспендировали в дистиллированной воде с последующим центрифугированием таким же образом. Каждый из полученных осадков ресуспендировали в 400 мл буферного раствора (1 М глицина, 3,78 г цистеина-HCl, рН 10,6) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Для выделения ресуспендированных рекомбинантных аналогов инсулина к ним добавляли 400 мл 8 М мочевины и перемешивали при 40°С в течение 1 ч. Для рефолдинга солюбилизированных рекомбинантных аналогов инсулина полученную смесь центрифугировали при 7000 об/мин и 4°С в течение 20 мин и отбирали супернатант. Супернатант перемешивали при 4°С в течение 16 ч с добавлением 7,2 л дистиллированной воды с использованием перистальтического насоса при скорости потока 1000 мл/ч.
- 15 045778 < 3-2> Очистка катионообменной хроматографией.
Образцы, в которых был проведен рефолдинг в примере <3-1>, соответствующим образом наносили на катионообменную колонку (Source S, GE Healthcare), уравновешенную буферным раствором с 20 мМ цитрата натрия (рН 2,0), содержащим 45%-й этанол для конъюгации. Белки-аналоги инсулина затем элюировали из колонки с линейным градиентом концентрации от 0% до 100% в 10 объемах колонки с использованием буферного раствора с 20 мМ цитрата натрия (рН 2,0), содержащего 0,5 М хлорида калия и 45%-й этанол.
< 3-3> Обработка трипсином и карбоксипептидазой В.
Из образцов, элюированных в примере <3-2>, с использованием обессоливающей колонки удаляли соли с последующей их заменой буферным раствором (10 мМ трис-HCl, рН 8,0). Образцы обрабатывали трипсином в соответствии с молярным отношением 1000 по количеству белка в образце и карбоксипептидазой В в соответствии с молярным отношением 2000 по количеству белка в образце и перемешивали при 16°С в течение 16 ч. Реакцию останавливали, снижая рН до 3,5 с использованием 1 М цитрата натрия (рН 2,0).
< 3-4> Очистка катионообменной хроматографией.
Образцы, в которых была завершена реакция в примере <3-3>, соответствующим образом повторно наносили на катионообменную колонку (Source S, GE Healthcare), уравновешенную буферным раствором с 20 мМ цитрата натрия (рН 2,0), содержащим 45%-й этанол для конъюгации. Белки-аналоги инсулина затем элюировали из колонки с линейным градиентом концентрации от 0% до 100% в 10 объемах колонки с использованием буферного раствора с 20 мМ цитрата натрия (рН 2,0), содержащего 0,5 М хлорида калия и 45%-й этанол < 3-5> Очистка анионообменной хроматографией.
Из образцов, элюированных в примере <3-4>, удаляли соли с использованием обессоливающей колонки с последующей их заменой буферным раствором (10 мМ трис-HCl, рН 7,5). Для выделения чистых аналогов инсулина из полученных таким образом образцов полученные образцы соответствующим образом наносили на анионообменную колонку (Source Q, GE Healthcare), уравновешенную буферным раствором с 10 мМ трис (рН 7,5) для конъюгации. Белки-аналоги инсулина затем элюировали из колонки с линейным градиентом концентрации от 0% до 100% в 10 объемах колонки с использованием буферного раствора с 10 мМ трис (рН 7,5), содержащего 0,5 М хлорида натрия.
Чистоту очищенных аналогов инсулина анализировали белковым электрофорезом (SDS-PAGE) и хроматографией с обращенной фазой и эксклюзионной хроматографией, и результаты показаны на фиг. 1 и 2, соответственно. Кроме того, модификации аминокислот подтверждали пептидным картированием и анализом молекулярной массы каждого пика, и результаты показаны на фиг. 3.
В результате, желаемые целевые модификации аминокислотной последовательности каждого из аналогов инсулина были подтверждены.
П ример 4. Сравнение in vitro-эффекта нативного инсулина и аналогов инсулина.
Для оценки in vitro-эффекта аналогов инсулина, выделенных и очищенных в примере 3, проводили эксперимент способности к абсорбции глюкозы (способности к поглощению глюкозы или синтезу липидов) с использованием клеточной линии мышиного происхождения 3T3-L1 с адипоцитарной дифференцировкой. Клеточную линию 3T3-L1 (АТСС, CL-173) субкультивировали с использованием модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM, Gibco, номер по каталогу 12430), содержащей 10% сыворотки новорожденных телят (bovine newborn calf serum, NBCS) два-три раза в неделю. Клеточную линию 3T3-L1 суспендировали в дифференцировочной среде (DMEM, содержащая 10% FBS), высевали в 48-луночный планшет в концентрации 5х104 клеток на лунку и культивировали при 37°С в течение 48 ч. Для дифференцировки клеточной линии 3T3-L1 с образованием адипоцитов в дифференцировочную среду добавляли 1 мкг/мл человеческого инсулина (Sigma, номер по каталогу I9278), 0,5 мМ IBMX (3-изобутил-1-метилксантин, Sigma, номер по каталогу I5879) и 1 мкМ дексаметазон (Sigma, номер по каталогу D4902), старую среду удаляли и в каждую лунку вносили по аликвоте полученной смеси в количестве 250 мкл на лунку. Через сорок восемь часов среду заменяли дифференцировочной средой с добавлением только 1 мкг/мл человеческого инсулина. Индукцию дифференцировки клеточной линии 3T3-L1 с образованием адипоцитов затем подтверждали на протяжении периода продолжительностью от 7 до 9 суток, заменяя среду дифференцировочной средой, содержащей 1 мкг/мл человеческого инсулина, с 48-часовыми интервалами.
Для эксперимента способности к абсорбции глюкозы клетки, завершившие свою дифференцировку с образованием адипоцитов, промывали один раз свободной от сыворотки средой DMEM и затем обрабатывали с использованием 250 мкл свободной от сыворотки среды DMEM в течение 4 ч для удаления из них сыворотки.
Человеческий инсулин и аналоги инсулина, соответственно, подвергали 10-кратному серийному разведению от 5 мкМ до 0,005 нМ свободной от сыворотки средой DMEM для дальнейшего использования в качестве образцов. Полученные таким образом образцы инсулина вносили в соответствующие лунки в количестве 250 мкл и проводили культивирование при 37°С в течение 24 ч в инкубаторе с 5% CO2. Для оценки количества глюкозы, оставшейся в среде по завершении культивирования, из каждой куль-
Claims (8)
- туры получали образец объемом 200 мкл, разводили его в 5 раз с использованием D-PBS и подвергалиGOPOD-анализу (GOPOD Assay Kit, Megazyme, номер по каталогу K-GLUC). Концентрацию оставшейся глюкозы рассчитывали, исходя из оптической плотности стандартного раствора глюкозы, вычисляли соответствующие значения EC50 относительно способности к поглощению глюкозы под действием аналогов инсулина, и результаты показаны в табл. 4 ниже.Таблица 4Способность к поглощению глюкозы (по сравнению с нативным инсулином) (%)Нативный человеческий инсулин 100Аналог инсулина 1 238,4Аналог инсулина 2 241,7Аналог инсулина 3 705Как показано в табл. 4, аналог инсулина 1 продемонстрировал повышение способности к поглощению глюкозы на 238,4%, аналог инсулина 2 продемонстрировал повышение на 241,7% и аналог инсулина 3 продемонстрировал повышение на 705% по сравнению с нативным инсулином, соответственно.На основании представленных выше результатов было подтверждено, что аналоги инсулина по настоящему изобретению демонстрируют выдающийся in vitro-эффект, в 2-7 раз превосходящий эффект нативного инсулина, и эти результаты демонстрируют, что указанные аналоги инсулина могут иметь существенно увеличенный период полувыведения из сыворотки in vivo и могут, таким образом, быть представлены в форме стабильных инсулиновых композиций и эффективно использованы в качестве терапевтических агентов для лечения диабета.Специалистам в данной области будет ясно, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без выхода за рамки его сущности или основных признаков. Описанные воплощения следует рассматривать во всех отношениях только как наглядные и не ограничивающие. Таким образом, объем настоящего изобретения определен приложенной формулой изобретения, но не предшествующим описанием. Все изменения в рамках значения и диапазона эквивалентности формулы изобретения следует рассматривать как включенные в объем настоящего изобретения.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Пептид проинсулин, содержащий А-цепь с SEQ ID NO: 3, указанную в следующей общей формуле 1, и В-цепь с SEQ ID NO: 4, указанную в следующей общей формуле 2, где аналог инсулина, содержащий А-цепь и В-цепь, может образовываться при процессинге указанного пептида проинсулина:(общая формула 1)Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa2-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa3-Leu-Xaa4-Gln-Xaa5-Glu-Asn-Xaa6-Cys-Xaa7 (SEQ ID NO: 3), (общая формула 2)Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa8-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-GlyPhe-Xaa9-Tyr-Xaa10-Xaa11-Lys-Thr (SEQ ID NO: 4), где:(а) в А-цепи с SEQ ID NO: 3 Xaa1 представляет собой глицин, Хаа2 представляет собой глутамин, Хаа3 представляет собой серин, Хаа4 представляет собой аспарагиновую кислоту, Хаа5 представляет собой лейцин, Хаа6 представляет собой тирозин и Хаа7 представляет собой аспарагин; и в В-цепи с SEQ ID NO: 4 Хаа8 представляет собой тирозин, Хаа9 представляет собой фенилаланин, Xaa10 представляет собой треонин и Xaa11 представляет собой пролин.
- 2. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид проинсулин по п.1.
- 3. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.2.
- 4. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантный вектор экспрессии по п.3.
- 5. Клетка-хозяин по п.4, представляющая собой Е. coli.
- 6. Способ получения аналога инсулина, включающий:а) получение рекомбинантного вектора экспрессии, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид проинсулин по п.1;б) трансформирование клетки-хозяина рекомбинантным вектором экспрессии и получение её трансформанта;в) культивирование трансформанта и экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид проинсулин; иг) выделение и очистку экспрессированного пептида проинсулина, и затем его процессинг с получением аналога инсулина.
- 7. Способ по п.6, где трансформант представляет собой Е. coli.
- 8. Способ по п.6, где стадия (г) включает:-
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2015-0121819 | 2015-08-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA045778B1 true EA045778B1 (ru) | 2023-12-26 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10647753B2 (en) | Insulin analogs and use thereof | |
RU2764197C1 (ru) | Аналоги инсулина с пониженной аффинностью к рецептору инсулина и их применение | |
KR102406654B1 (ko) | 지속형 인슐린 및 그 용도 | |
JP2018508504A (ja) | 持続型インスリンまたはインスリンアナログ結合体 | |
KR20190036956A (ko) | 지속형 단쇄 인슐린 아날로그 및 이의 결합체 | |
KR20160007295A (ko) | 인슐린 아날로그 | |
KR20160001391A (ko) | 신규한 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 이의 용도 | |
EA045778B1 (ru) | Новые аналоги инсулина и их применение | |
EA041658B1 (ru) | Новые аналоги инсулина и их применение | |
RU2337964C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pAS-2, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ПРОИНСУЛИНА Aspart ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BAS2 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ПРОИНСУЛИНА Aspart | |
JP4512222B2 (ja) | ベータセルリン改変体 | |
RU2515115C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHIG05, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК С ПРОИНСУЛИНОМ Glargine ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHIG05, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHIG05-ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА С ПРОИНСУЛИНОМ Glargine ЧЕЛОВЕКА | |
RU2514578C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHIASP03, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК С ПРОИНСУЛИНОМ Aspart ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHIAsp03, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHIAsp03-ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА С ПРОИНСУЛИНОМ Aspart ЧЕЛОВЕКА |