CN102065885A

CN102065885A - 同种型特异性的胰岛素类似物

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Publication number: CN102065885A
Application number: CN2009801244782A
Authority: CN
Inventors: M·维斯; J·惠特克
Original assignee: Case Western Reserve University
Current assignee: Case Western Reserve University
Priority date: 2008-04-22
Filing date: 2009-04-22
Publication date: 2011-05-18
Also published as: WO2009132129A2; US20110195896A1; NZ588857A; MX2010011329A; CA2722168A1; KR20110021758A; EP2296692A4; JP2011521621A; RU2010147076A; BRPI0911571A2; EP2296692A2; WO2009132129A3; AU2009240636A1

Abstract

一种治疗哺乳动物的方法，该方法施用生理有效量的胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐，其中所述胰岛素类似物表现出对胰岛素受体同种型A(IR-A)的结合亲和力是胰岛素受体同种型B(IR-B)的两倍以上。所述胰岛素类似物可为单链胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐，包含胰岛素A链序列或其类似物以及胰岛素B链序列或其类似物，两者以4-13个氨基酸的多肽连接。相对于正常胰岛素，单链胰岛素类似物可表现出对IR-A的体外胰岛素受体结合较高但是对IR-B的结合较低，同时表现出对IGFR的结合相对于正常胰岛素较低或相同。

Description

同种型特异性的胰岛素类似物

本发明系在National Institutes of Health提供的合作协议下由政府资助完成，合同号NIH R01DK069764、R01-DK74176、以及R01-DK065890。美国政府可能对本发明拥有某些权益。

发明背景

施用胰岛素早已确定为糖尿病的治疗方法。胰岛素是单链前体胰岛素原的产物，其中连接区域(35个残基)连接B链的C端残基(残基B30)与A链的N端残基(图1A)。虽然胰岛素原的结构尚未确定，但是多种迹象表明其由类似胰岛素的核心与无序的连接肽组成(图1B)。三个特定二硫键(A6-A11，A7-B7，和A20-B19；图1B)的形成据信与粗面内质网(ER)中胰岛素原的氧化折叠相关。胰岛素原从ER输出到高尔基体后不久即组装以形成可溶的Zn²⁺协调的六聚体。内部蛋白水解消化以及转化为胰岛素发生于未成熟的分泌颗粒，然后是形态凝聚。通过电子显微术(EM)已观察到成熟存储颗粒中的锌胰岛素六聚体的结晶阵列。因此天然寡聚体的组装与分解是胰岛素生物合成、存储、分泌、以及功能路径所固有的。

已广泛研究了胰岛素A和/或B链中氨基酸置换对皮下注射后胰岛素功能的药代动力学的可能有利影响。本领域已知加速或减缓吸收时间过程的置换例子。此类置换(例如

中的Asp^B28和

中的[Lys^B28，Pro^B29])可以并经常与更快的纤维化和更差的物理稳定性相关。实际上，一系列10种人胰岛素类似物已试验了纤维化易感性，包括Asp^B28-胰岛素和Asp^B10-胰岛素。发现所有10种在pH 7.4和37℃比人胰岛素对更易于纤维化。所述10种置换位于胰岛素分子的不同位点，并可能与经典热力学稳定性的多种改变相关。这些结果提示在药学条件下保护胰岛素类似物免于纤维化的置换很少；对其设计没有明显的结构标准或规则。目前的蛋白纤维化理论认为纤维化机制通过部分折叠的中间状态进行，然后依次聚集形成淀粉样核。在该理论中，有可能稳定天然状态的氨基酸置换可能或不能稳定所述部分折叠的中间状态，并且可能或不能升高(或降低)天然状态与中间状态之间的自由能障碍。因此，现有理论指出胰岛素分子中某一给定氨基酸置换升高或降低纤维化风险的倾向是高度不可预测的。

已知蛋白质例如胰岛素的修饰增加对纤维化的抗性但是削弱生物学活性。例如，“微型胰岛素原”用于描述多种胰岛素原类似物，其包含缩短的连接区域，例如胰岛素A和B链之间的二肽连接物。也可存在其它置换，例如猪胰岛素中发现的Ala^B30代替人胰岛素中发现的Thr^B30。该类似物有时系指猪胰岛素前体，或称PIP。微型胰岛素原类似物通常抗纤维化但是削弱其活性。通常，长度＜4个残基的连接肽以生物学活性为代价阻断胰岛素纤维化；据报道对胰岛素受体的亲和力降低至少10,000倍。虽然此类类似物可用作重组胰岛素生产中的中间产物，但其本身不能用于糖尿病治疗。

胰岛素通过结合并激活称为胰岛素受体的细胞受体介导其生物学功能。胰岛素受体的细胞外部分结合胰岛素，而细胞内部分包含激素可激活的酪氨酸激酶结构域。选择性RNA剪接导致两种截然不同的胰岛素受体(IR)同种型，称为IR-A和IR-B。B同种型包含由胰岛素受体基因的外显子11编码的α亚基中的12个额外氨基酸。A同种型缺少所述12残基片段。本发明涉及优先结合胰岛素受体的一种同种型的胰岛素类似物设计。

对胰岛素受体亲和力过低或过高的胰岛素类似物可能在糖尿病治疗中具有不利的生物学性质。由于胰岛素从血流中的清除主要通过与目标组织胰岛素受体的相互作用调节，预计受体结合活性低于25％可表现出在血流中的存在时间延长。在快速作用的胰岛素类似物与食物摄取协调给予以严格控制糖血症中，所述延缓的清除是不利的。这种降低的亲和力也可降低胰岛素类似物的效力，需要注射更大量的蛋白溶液或使用更高浓度的蛋白溶液。本发明涉及优先结合胰岛素受体的一种同种型的胰岛素类似物设计。

相反，对胰岛素受体亲和力高于野生型胰岛素的胰岛素类似物可于改变的信号传导特性以及改变的激素-受体复合物的细胞加工相关。超活化胰岛素类似物与在目标细胞表面或细胞内囊泡表面的胰岛素受体之间的复合物延长的停留时间可导致增强的有丝***信号传导。如果氨基酸置换不仅增强该类似物对胰岛素受体的结合，而且增强对I型IGF受体的结合，则可产生增强的有丝***。由于这些原因，需要对胰岛素受体和IGF受体亲和力与野生型人胰岛素相似的类似物。

已描述一种胰岛素修饰(Asp置换His^B10)增强胰岛素的热力学稳定性，并增强其对胰岛素受体的亲和力2倍。由于该置换阻断锌的结合并阻止胰岛素二聚体组装成六聚体，对其作为候选快速作用类似物进行研究。但是，当发现Asp^B10-胰岛素表现出增强的有丝***、与胰岛素受体的增强交叉结合、以及对Sprague-Dawley大鼠长期施用后升高的乳腺肿瘤形成率时，停止了临床开发。由于Asp^B10-胰岛素的其它有利特性，并且可能其它胰岛素类似物也遭遇所述不利特性，因此可能需要一种设计方法以保留所述置换给予的有利特性，同时避免不利特性。一个具体的实施例可为重新设计胰岛素分子以保留与Asp置换His^B10相关的增强的热力学稳定性和受体结合特性，而不引起对I型IGF受体的增强交叉结合或增强的有丝***。

虽然胰岛素的主要功能是调节血液中葡萄糖的浓度，但是该激素还调节多种目标组织和生理反应。典型的目标组织为肌肉、脂肪和肝脏。胰岛素的非典型目标包括胰腺β细胞，涉及控制食欲、饱腹感和体重的中枢神经***神经元，外周神经***神经元，以及涉及炎症和宿主防御的白细胞。所述组织各表现出IR-A和IR-B表达的特定模式。证据表明通过IR-A和IR-B的信号传导能够激活不同的受体后路径，导致对胰岛素调节的葡萄糖摄取、胰岛素调节的基因表达、以及细胞生长和增殖的差异作用。

到目前为止，没有胰岛素类似物具有足够特异性区别IR-A和IR-B以达到选择性激活一种信号传导路径或另一种。野生型胰岛素对结合IR-A比对结合IR-B的亲和力略高(1到2倍的IR-A结合优先)。此类类似物似乎不能存在，因为两种受体同种型共享负责激素结合的主要结构域。因为IR-B中存在但IR-A中缺失的蛋白序列仅包含12个氨基酸残基，并且因为这些残基在激素结合共享位点之外，看起来可能增强或削弱一种胰岛素类似物与IR-A结合的氨基酸置换将同等调节该胰岛素类似物与IR-B的结合。我们的常规胰岛素类似物研究(参见下面)与这种预期相符。

出乎意料，我们已发现非常规类的胰岛素类似物，能够设计具有修饰的A和B链，包含A和B链之间缩短的连接肽的那些以优先结合IR-A。此类类似物的总体结构类似胰岛素原，胰腺β细胞中激素合成的生物合成路径中的胰岛素单链前体。人胰岛素原包含连接区域，其连接B链的C端残基(残基B30)与A链的N端残基(图1A和B)，并且本领域不知道缩短该连接结构域的任何同种型特异性作用。

与IR-A结合亲和力高于IR-B的胰岛素类似物的一个实施例为野生型人胰岛素原。虽然观察到4倍的受体结合选择性，但在每种情况下所述结合都被连接结构域显著削弱，阻止其作用。与IR-A结合亲和力高于IR-B的类胰岛素配体的另一个实施例为***II(IGF-II)。如同胰岛素原，选择性的程度在4倍到10倍之间。使用IGF-II作为胰岛素类似物用于实验室研究或治疗糖尿病人都不适宜，因为IGF-II以高活性结合并激活I型IGF受体(IGFR)，而IGF-II对每种IR同种型亲和力都低(相对于人胰岛素＜20％)。胰岛素类似物与IGFR的交叉结合已在Sprague-Dawley大鼠中与乳腺肿瘤发展相关。使用IGF-II作为糖尿病的潜在治疗也由于其结合特异性血清结合蛋白而复杂，该蛋白改变所述生长因子的效力和信号传导特性。

胰岛素原与IGF-II之间的显著序列差异使如何设计可能表现出下列特性组合的创新类似物难以明确：(a)高于这些天然存在的配体的同种型选择性，同时表现出(b)对目标同种型的亲和力等于或高于野生型胰岛素，以及(c)与IGFR交叉结合类似于或低于野生型胰岛素。实际上，IGF-II包含13个残基的连接结构域，其长度或序列与胰岛素原的连接结构域无关；IGF-II的A结构域与胰岛素原的A结构域在21个位点中有9个不同，B结构域在30个位点中有18个不同。胰岛素原、IGF-II或类胰岛素家族其它成员的序列比较未能为指导设计同种型特异性类似物提供任何线索。

不考虑理论，我们已发现人胰岛素的单链类似物可设计为优先结合IR-A，其亲和力等于或高于野生型胰岛素，但是不增强结合IGFR。此类类似物可用于增强通过IR-A的胰岛素信号传导。因为通过IR-B的信号传导据信介导胰岛素的降血糖作用，因此本发明允许刺激IR-A依赖的路径，可通过使用野生型人胰岛素、动物胰岛素、以及本领域已知的胰岛素类似物治疗达到较低的有害低血糖症风险。在II型糖尿病、新陈代谢综合征或糖耐量减低的临床环境中，此类IR-A依赖的路径可引发对β细胞功能和活力的有利作用，以及对通过下丘脑回路和中枢神经***其它方面控制食欲的有利作用。此类同种型特异性类似物还可用于哺乳动物细胞培养以及野生型和转基因动物的实验操作中。

发明内容

因此，本发明的一个方面为提供相对于IR-B而言优先结合IR-A的胰岛素类似物。

本发明的另一个方面为提供相对于IR-B而言优先结合并激活IR-A而不增强结合IGFR的单链胰岛素类似物。

总体而言，本发明提供了一种治疗哺乳动物的方法，其包含施用生理有效量的胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐，其中所述胰岛素类似物表现出对胰岛素受体同种型A(IR-A)的结合亲和力为对胰岛素受体同种型B(IR-B)的两倍以上，并且其中所述类似物与衍生所述类似物的野生型胰岛素比较，具有至少三分之一的对IR-B的相对结合亲和力。所述胰岛素类似物可表现出对IR-A的结合亲和力为对IR-B的至少4倍、6倍或更高。

所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐可为单链胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐，包含胰岛素A链序列或其类似物以及胰岛素B链序列或其类似物，两者以与胰岛素原连接物相比截短的多肽连接物连接。在一种实施例中，所述连接物长度可少于15个氨基酸。在其它实施例中，所述连接物长度可为4、5、6、7、8、9、10、11、12、或13个氨基酸。在一种具体实施例中，所述连接物为具有序列Gly-Gly-Gly-Pro-Arg-Arg(SEQ.ID.NO.19)的多肽。

在另一种具体实施例中，所述胰岛素类似物为具有如下序列的多肽：选自具有SEQ.ID.NO.26和36序列的多肽。在其它实施例中，所述胰岛素类似物可具有如下的序列：选自具有SEQ.ID.NO.17序列的多肽，其中Xaa_4-13为6个任意氨基酸，条件是Xaa_4-13的首两个氨基酸不是精氨酸。在其它实施例中，所述胰岛素类似物包含结构式I的单链多肽，

B-C-A (I)

其中B包含具有下列序列的多肽：

FVNQHLCGSX₂LVEALYLVCGERGFFYTX₃X₄T(SEQ.ID.NO.38)

其中X₂为D或H，X₃为P、D或K，X₄为K或P，

其中C为由序列GGGPRR(SEQ.ID.NO.19)组成的多肽，并且

其中A包含具有下列序列的多肽：

GIVEQCCX₁SICSLYQLENYCN(SEQ.ID.NO.37)

其中X₁为T或H。

在所述实施例中，所述胰岛素类似物可包含如下多肽：选自具有SEQ.ID.NO.26序列的多肽和具有SEQ.ID.NO.36序列的多肽。

本发明的单链胰岛素类似物还可包含其它修饰，例如在残基A4、A8和B1的组氨酸置换，更全面描述于共同待审的国际申请PCT/US07/00320和美国申请12/160,187，其公开通过引用结合到本文中。在一种实施例中，脊椎动物胰岛素类似物为哺乳动物胰岛素类似物，例如人、猪、牛、猫、狗或马胰岛素类似物。

本发明还提供一种药物组合物，其包含此类胰岛素类似物并可任选地包括锌。所述组合物中可包括的锌离子摩尔比水平为每个胰岛素类似物六聚体2.2到3。在所述制剂中，胰岛素类似物的浓度通常为约0.1到约3mM；高达3mM的浓度可用于胰岛素泵的储备。在另一种实施例中，包含单链胰岛素类似物的药物组合物在37℃表现出低于1％的纤维化，其锌摩尔比低于每个六聚体2、1.5、1或者除了作为杂质存在的含量以外甚至不含锌。

赋形剂可包括甘油、甘氨酸、其它缓冲液和盐、以及抗菌防腐剂，例如苯酚和间甲酚；后面的防腐剂已知用于增强胰岛素六聚体的稳定性。通过向病人施用生理上有效量的组合物，所述药物组合物可用于治疗患有糖尿病或其它医学疾病的病人。

本发明还提供一种核酸，其包含编码多肽的序列，编码单链胰岛素类似物，包含的序列编码A链、B链、以及A链与B链之间包含4-13个密码子的连接物。所述核酸还可编码野生型胰岛素的其它修饰，例如在残基A8的组氨酸、赖氨酸、精氨酸或其它碱基置换，如国际申请PCT/US09/40544所提供，其公开通过引用结合到本文中。除组氨酸以外的残基可在位点A8或B10置换以增强稳定性和活性。残基也可在位点B9、B28、和/或B29置换以改变该类似物的自缔合属性(以及药代动力学特性)。除酪氨酸以外的残基可在位点A14置换以调节该类似物的等电点；置换或者额外的残基也可***缩短的连接结构域以调节该蛋白的等电点。所述核酸序列可编码修饰的A链或B链序列，其在多肽或修饰的胰岛素原类似物的其它位置包含无关置换或延伸。所述核酸还可作为表达载体的一部分，该载体可***宿主细胞，例如原核宿主细胞如E.coli细胞系，或者真核细胞系例如Saccharomyces cerevisiae或Pischia pastoris菌株或细胞系。

附图说明

图1A为人胰岛素原序列的示意图，包括A链和B链以及连接区域，表示为侧面二碱基裂解位点(填充圆)和C肽(开放圆)。标记“缩短的连接肽”的直线表示微型胰岛素原中的连接区域，所述微型胰岛素原为在胰岛素A链和B链部分之间包含二肽(Ala-Lys)连接物的胰岛素原类似物。

图1B为胰岛素原的结构模型，由类胰岛素部分和无序的连接肽(虚线)组成。

图2表示受体结合试验结果，其中57聚体单链胰岛素类似物(虚线；三角形)的结合相对于天然人胰岛素(实线；正方形)进行评估。该试验通过未标记类似物或冷胰岛素测量受体结合的¹²⁵I标记胰岛素的替换。(A，上图)胰岛素或胰岛素类似物对IR-A的结合。(B，中图)胰岛素或胰岛素类似物对IR-B的结合。(C，下图)胰岛素或胰岛素类似物对IGFR的结合。

图3A为受体结合试验结果图，其中评估了人胰岛素和人胰岛素类似物对人胰岛素受体同种型A(HIRA)的结合。在一定范围内的未标记类似物/胰岛素浓度下提供了未标记类似物或胰岛素(B/Bo)对受体结合的¹²⁵I标记胰岛素的替换。

图3B为受体结合试验结果图，其中评估了人胰岛素和人胰岛素类似物对人胰岛素受体同种型B(HIRB)的结合。在一定范围内的未标记类似物/胰岛素浓度下提供了未标记类似物或胰岛素(B/Bo)对受体结合的¹²⁵I标记胰岛素的替换。

图3C为受体结合试验结果图，其中评估了人胰岛素和人胰岛素类似物对***受体(IGFR)的结合。在一定范围内的未标记类似物/胰岛素浓度下提供了未标记类似物或胰岛素(B/Bo)对受体结合的¹²⁵I标记胰岛素的替换。

图4为受体结合试验结果图，比较了在位点B10野生型(SEQ.ID.NO.26)的单链胰岛素(SCI)与***1(IGF-1)、野生型人胰岛素、以及在

(优泌乐)和

(来得时)商标下出售的胰岛素类似物的IGFR结合亲和力。

图5为糖尿病Lewis大鼠注射后随时间变化的血糖测量图，注射物为人胰岛素(SEQ.ID.NO.2和3)、SCI(His^A8，Asp^B10，Asp^B28，和Pro^B29)(SEQ.ID.NO.36)、或者该SCI的双链类似物(具有His^A8，Asp^B10，Asp^B28，和Pro^B29置换)(SEQ.ID.NO.34和35)。

发明详述

本发明致力于重组单链胰岛素类似物，其提供该类似物对胰岛素受体A同种型(IR-A)的同种型特异性结合，同时对B同种型(IR-B)的结合降低至少6倍。为此，本发明提供的胰岛素类似物包含变体胰岛素A链多肽和变体胰岛素B链多肽，两者以截短的连接物多肽连接。在一种实施例中，所述连接物多肽长度可少于15个氨基酸。在其它实施例中，所述连接物多肽长度可为4、5、6、7、8、9、10、11、12、或13个氨基酸。

本发明的单链胰岛素类似物还可包含其它修饰。当用于本说明书和权利要求时，胰岛素的多种置换类似物可根据惯例标记，标示置换的氨基酸，然后是该氨基酸的位点，任选地以上标标示。所述讨论中的氨基酸位点包括置换所在的胰岛素A链或B链。例如，本发明的单链胰岛素类似物还可包含B链氨基酸28(B28)的脯氨酸(Pro或P)置换为天冬氨酸(Asp或D)或赖氨酸(Lys或K)，或者B链氨基酸29(B29)的Lys置换为Pro，或者两者的组合。这些置换也可分别标记为Asp^B28、Lys^B28、和Pro^B29。除非另有说明或上下文中明显可见，本文提及的氨基酸应认为是L-氨基酸。

本发明的另一方面为避免对IGF I型受体显著增强的交叉结合。为此，使用不包含***I(IGF-1)C结构域中存在的序列Arg-Arg-Xaa或者酪氨酸与串联精氨酸的连接物可能是有利的，因为已鉴定出这些序列对IGF-1与IGFR的结合很重要。

Asp^B28置换存在于称为Aspart胰岛素的胰岛素类似物中并以出售，而Lys^B28和Pro^B29置换存在于称为Lispro胰岛素的胰岛素类似物中并在名称下出售。这些类似物描述于美国专利5,149,777和5,474,978，其公开通过引用结合到本文中。这两种类似物都认为是快速作用胰岛素。这些类似物都不表现出同种型特异性受体结合。

进一步预期本发明的单链胰岛素类似物还可使用多种变型中的任意变型，所述变型存在于现有胰岛素类似物、修饰胰岛素、或者多种药物制剂中，例如除人胰岛素之外的普通胰岛素、NPH胰岛素、慢胰岛素(lente insulin)或特慢胰岛素。本发明的单链胰岛素类似物还可包含人胰岛素类似物中存在的置换，虽然其未在临床使用但仍然用于实验，例如DKP胰岛素，其包含Asp^B10、Lys^B28和Pro^B29置换或者Asp^B9置换。然而，本发明并不限于人胰岛素及其类似物。还预期这些置换也可通过非限制性实施例的方式在动物胰岛素中进行，例如猪、牛、马、和狗胰岛素。此外，由于人胰岛素和动物胰岛素之间的相似性，以及以往动物胰岛素用于人糖尿病患者，还预期在胰岛素序列中可引入其它小修饰，尤其是被认为“保守”置换的置换。例如，额外的氨基酸置换可在具有相似侧链的氨基酸组内进行，而不背离本发明。这些包括中性疏水氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)和甲硫氨酸(Met或M)。同样，中性极性氨基酸可在其组中相互置换，包括甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Glu或Q)、和天冬酰胺(Asn或N)。认为碱性氨基酸包括赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和组氨酸(His或H)。酸性氨基酸为天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)。在一种实施例中，本发明的胰岛素类似物除本发明的修饰连接物之外包含3个或更少的保守置换。

为比较目的，人胰岛素原的氨基酸序列提供为SEQ.ID.NO.1。人胰岛素A链的氨基酸序列提供为SEQ.ID.NO.2。为比较目的，人胰岛素B链的氨基酸序列提供为SEQ.ID.NO.3。

SEQ.ID.NO.1(胰岛素原)

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-

Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-

Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-GIn-Pro-Leu-Ala-

Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-

Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

SEQ.ID.NO.2(A链)

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-

Cys-Asn

SEQ.ID.NO.3(B链)

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-

Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr

本发明的单链人胰岛素的氨基酸序列提供为SEQ.ID.NO.4，其中Xaa表示任意氨基酸。

SEQ.ID.NO.4

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-

Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Xaa_4-13-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-

Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

在多个实施例中，Xaa表示的连接物长度可为4、5、6、7、8、9、10、11、12、或13个氨基酸。在一种实施例中，所述连接物包含直接侧接A和B链的天然存在的氨基酸。SEQ.ID.NO.5-14提供的序列中所述连接物包含位于其在胰岛素原中天然存在的位点的氨基酸。换言之，胰岛素原的天然连接物截短不同数量，剩下胰岛素原中紧邻A和B链的天然发现的氨基酸。在SEQ.ID.NO.5中，存在直接侧接A和B链的Arg残基。在SEQ.ID.NO.6中，存在通常发现邻近B链的两个Arg残基，以及通常发现邻近A链的Arg和Lys残基。在SEQ.ID.NO.7和8中，存在通常发现邻近B链的Arg-Arg-Glu序列，以及通常发现邻近A链的Gln-Lys-Arg序列。在SEQ.ID.NO.7中，可能任选地存在额外的1-4个氨基酸。

SEQ.ID.NO.5

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-

Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Xaa_2-8-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-

Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

SEQ.ID.NO.6

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Le u-Val-Cys-

Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Xaa_0-6-Lys-Arg-Gly-Ile-

Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

SEQ.ID.NO.7

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-

Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Xaa_0-4-Gln-Lys-Arg-

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-

Cys-Asn

SEQ.ID.NO.8

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-

Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-

Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

SEQ.ID.NO.9-14提供了不同长度的连接物，由胰岛素原序列中天然发现的多种序列组成。

也可使用在胰岛素中未天然发现序列的其它截短连接物。例如，SEQ.ID.NO.19提供了具有序列Gly-Gly-Gly-Pro-Arg-Arg的连接物，SEQ.ID.NO.20提供了具有序列Gly-Gly-Pro-Arg-Arg的连接物，SEQ.ID.NO.21提供了具有序列Gly-Ser-Glu-Gln-Arg-Arg的连接物，SEQ.ID.NO.22提供了具有序列Arg-Arg-Glu-Gln-Lys-Arg的连接物，SEQ.ID.NO.23提供了具有序列Arg-Arg-Glu-Ala-Leu-Gln-Lys-Arg的连接物，SEQ.ID.NO.24提供了具有序列Gly-Ala-Gly-Pro-Arg-Arg的连接物，以及SEQ.ID.NO.25提供了具有序列Gly-Pro-Arg-Arg的连接物。预期任一所述截短连接物可单独或与本文提及的胰岛素多肽序列中的其它置换或其它变型共同用于本发明的单链胰岛素类似物。

多种置换，包括现有技术已知的胰岛素类似物的置换，也可存在于本发明的单链胰岛素类似物。例如，同样携带置换对应于lispro胰岛素的Lys^B28Pro^B29置换的单链胰岛素类似物的氨基酸序列提供为SEQ.ID.NO.15。类似地，同样携带置换对应于aspart胰岛素的Asp^B28置换的单链胰岛素类似物的氨基酸序列提供为SEQ.ID.NO.16。另外，同样携带置换对应于Asp^B10置换的单链胰岛素类似物的实施例氨基酸序列提供为SEQ.ID.NO.17和18。

SEQ.ID.NO.15

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-

Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr-Xaa_4-10-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-

Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

SEQ.ID.NO.16

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-

Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Asp-Thr-Xaa_4-10-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-

Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

SEQ.ID.NO.17

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-

Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Xaa_4-10-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-

Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

SEQ.ID.NO.18

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-

Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Xaa_0-4-Gln-Lys-Arg-

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-

Cys-Asn

胰岛素或胰岛素类似物的活性可通过本文下面详述的受体结合试验确定。相对活性可通过比较调节激素-受体结合反应的解离常数(K_eq)确定。相对活性还可通过比较ED₅₀值估计，所述ED₅₀值为未标记胰岛素或胰岛素类似物替换50％特异性结合的标记人胰岛素所需的浓度，例如替换放射性标记的人胰岛素(例如¹²⁵I标记的胰岛素)或放射性标记的高亲和力胰岛素类似物。备选地，活性可简单表示为正常胰岛素的活性百分比。对***受体(IGFR)的亲和力也可以同样方式确定，其替换所测量IGFR中的放射性标记的IGF-I(例如¹²⁵I标记的IGF-I)。具体而言，需要一种同种型选择性单链胰岛素类似物，其对一种胰岛素受体同种型的活性等于或高于100％胰岛素，例如110％、120％、130％、140％、150％、或200％正常胰岛素或更高，而对另一种胰岛素受体同种型的活性相对于目标同种型降低至少6倍。还需要所述单链胰岛素类似物对IGFR的交叉结合低于或等于100％正常胰岛素，例如90％、80％、70％、60％、或50％正常胰岛素或更低。需要如本文所述在体外确定胰岛素活性，而不是在体内。已经注意到，在体内胰岛素从血流中的清除取决于受体结合。这样，由于从血流中清除较慢，胰岛素类似物在体内可在数小时时间内表现出高活性，甚至接近约100％活性，尽管其在细胞水平活性较低。但是，由于清除较慢以及易于施用高剂量，胰岛素类似物仍可用于糖尿病治疗，即使其体外受体结合活性低至20％。

3种多肽片段使用硫羟酸酯介导的天然片段连接并通过全化学合成生产了一种单链胰岛素类似物。所述多肽片段包含残基1-18(片段I)、19-42(片段II)、以及43-57(片段III)。每种多肽片段通过固相方法合成。片段I和片段II通过N-α-叔丁氧基羰基(Boc)化学在OCH₂-Pam树脂(Applied Biosystems)上制备；片段III通过N-α-(9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)化学在具有标准侧链保护基团的聚乙二醇-聚苯乙烯(PEG-PS)树脂上制备。片段I合成为硫代酸酯(β-巯基亮氨酸，βMp-Leu)。合成始于Boc-Leu-OCH₂-Pam树脂，肽链逐步向N端残基延伸。片段II也合成为硫代酸酯，在βMp残基C端连接Arg-Arg-Gly肽以增强片段的溶解性。片段II的N端氨基酸半胱氨酸保护为噻唑烷(Thz)，并在连接之后使用MeONH₂.HCl转化为半胱氨酸。天然连接之后，全长多肽链允许在100mM还原型谷胱甘肽(GSH)和10mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)的混合物中在pH 8.6下折叠并使用C4柱(1.0x25cm)进行HPLC纯化，以15％到35％(A/B)梯度洗脱40分钟，流速为4ml/min。对应SCI(1)的纯馏分集中并冻干。预测的分子量通过质谱证实。

制备了一种具有SEQ.ID.NO.26多肽序列的单链胰岛素类似物。

SEQ.ID.NO.26

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-

Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr-Gly-Gly-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-

Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

合成所述57-聚体单链类似物并测试活性。所述类似物包含修饰的A链序列(包含置换His^A8)和修饰的B链序列(包含置换Asp^B28和Pro^B29)以及序列为GGGPRR的6残基连接物。为比较目的，同样制备了一种58-聚体单链胰岛素类似物，其包含Lee和同事先前描述的序列(Nature，Vol.408，pp 483-488，2000)。后一个类似物包含野生型A链和B链序列以及序列为GGGPGKR(SEQ.ID.NO.33，“现有技术SCI”)的7残基连接物。但是应注意，描述该类似物的文章中描述的结果最近已被原始文章的至少部分作者收回(Nature，Vol.458，p.660，2009)，对原始Nature文章中给出的结果的有效性存疑。尽管如此，本文给出了根据本发明的单链胰岛素与现有技术单链胰岛素之间的比较。

合成了人工基因以指导相同多肽在巴斯德毕赤酵母和其它微生物中的表达。所述DNA的序列为下列中的一种：

(a)人密码子优先

TTC/GTC/AAC/CAG/CAC/CTC/TGC/GGC/AGC/CAC/CTC/GTC/GAA/GCA/CTC/

TAC/CTC/GTC/TGC/GGA/GAA/CGA/GGA/TTC/TTC/TAC/ACA/GAC/CCA/ACA

/GGA/GGA/GGA/CCA/CGA/CGA/GGA/ATA/GTA/GAA/CAA/TGC/TGC/CAC/A

GC/ATA/TGT/AGC/CTC/TAC/CAA/CTA/GAA/AAC/TAC/TGC/AAC

(SEQ.ID.NO.28)

(b)毕赤酵母密码子优先

TTT/GTT/AAC/CAA/CAT/TTG/TGT/GGT/TCT/GAT/TTG/GTT/GAA/GCT/TTG/T

AC/TTG/GTT/TGT/GGT/GAA/AGA/GGT/TTT/TTT/TAC/ACT/GAT/CCA/ACT/G

GT/GGT/CGT/CCA/AGA/AGA/GGT/ATT/GTT/GAA/CAA/TGT/TGT/CAT/TCT/A

TT/TGT/TCT/TTG/TAC/CAA/TTG/GAA/AAC/TAC/TGT/AAC

(SEQ.ID.NO.29)

编码相同多肽序列的所述序列的其它变体可能以遗传密码的同义密码子表示。制备了其它人工基因以指导合成所述多肽的类似物，其在位点A4、A8、B28和B29包含变体氨基酸置换；另外，所述变体DNA序列中编码连接肽的长度连续变化。

受体结合试验。相对活性定义为类似物与野生型人胰岛素的解离常数比率，其使用¹²⁵I-人胰岛素作为示踪剂通过竞争性结合试验确定。该试验使用纯化的表位标记的受体(IR-A、IR-B、或IGFR)使用本领域已知的微量滴定板抗体捕获试验。所述表位标记由FLAG表位的3个串联重复组成。微量滴定条板(Nunc Maxisorb)与抗FLAG IgG(磷酸缓冲盐溶液中40mg/ml，100μl/孔)在4℃孵育过夜。通过单位点异种竞争结合模型分析结合数据。使用表位标记的IGF I型受体的对应微量滴定板抗体试验用于评估类似物对此同源受体的交叉结合。在所有试验中无竞争配体时示踪剂结合百分比低于15％以避免配体耗尽假象。

在表I中提供了对IR-A和IR-B的相对亲和力；数值标准化至100％，以野生型人胰岛素对IR-A的结合亲和力定义。在试验条件下人胰岛素的亲和力为0.04nM。在第4列中给出了对应的对IGFR的亲和力；在试验条件下人胰岛素对IGFR的亲和力为9.7nM。

表I

如所预料，相对于IR-B，野生型胰岛素对IR-A表现出微弱优先(表I第1行)。在

和

(第5和第6行)的研究中观察到相似的对IR-A的微弱优先。A链中部的置换(Trp置换Leu^A13或Tyr^A14；分别在第7和第8行)同样产生对IR-A低于2倍的选择性。虽然单链配体胰岛素原、IGF-I、和IGF-II各自微弱结合胰岛素受体的每种同种型，但这些配体表现出对IR-A高于2倍的优先(表I第2-4行)。

相对于人胰岛素，所述57聚体单链胰岛素类似物(SEQ.ID.NO.26)的IR-A受体结合活性为200％，如表I所示(底行)；其对IR-B的亲和力低于30％，且其对IGFR的亲和力低于人胰岛素的1/3。这些结合特性在图2中通过一组受体结合试验说明，其中所述57聚体单链胰岛素类似物的结合(虚线；三角形)相对于天然人胰岛素(实线；正方形)进行评估：(A)结合IR-A，(B)结合IR-B，以及(C)结合IGFR。这些试验测量在一定范围内的未标记类似物/胰岛素浓度下未标记类似物或胰岛素(B/Bo)对受体结合的¹²⁵I标记胰岛素的替换。

本领域已知的单链胰岛素(现有技术-SCI；表I中倒数第二行)的对照研究显示其以低亲和力结合胰岛素受体的每种同种型，相对于人胰岛素在同种型选择性方面没有显著变化。

相对于野生型人胰岛素(SEQ.ID.NO.2和3)，评估了所述包含His^A8、Asp^B28、和Pro^B29置换的57聚体SCI(SEQ.ID.NO.26)在糖尿病大鼠的体内效力。为此，使用链脲菌素使雄性Lewis大鼠(～250g体重)患糖尿病。使用HPLC纯化人胰岛素和所述SCI，干燥成粉末，并溶于胰岛素稀释液(Eli LillyCorp)。大鼠在时间＝0时皮下注射100μl稀释液中的0-1.5U/kg体重的范围的胰岛素剂量(通常每只大鼠0-30微克蛋白)；对应的SCI等分量基于蛋白摩尔数制备。在时间0以及每10分钟直至90分钟从尾尖采血。使用HypoguardAdvance Micro-Draw仪器测量血糖。在胰岛素浓度次大值，需要高出3倍的SCI摩尔浓度以达到与野生型胰岛素相同的血糖降低速率和程度。摩尔基础上需要更高剂量的SCI与其对胰岛素受体B同种型的低于1/3的结合亲和力一致，因为据信是B同种型调节激素依赖的葡萄糖摄入至目标组织。对于野生型人胰岛素，0.5U/kg剂量(次大剂量)后血糖的平均变化(6只大鼠)约为每小时-115.6mg/dL。对于蛋白摩尔数相同剂量的SCI，血糖的平均变化为每小时-31.4mg/dL，几乎低于1/4。当注射的SCI量增加到重量等于1.5U/kg时，观察到血糖平均下降为每小时-98.7mg/dL。这表明所述类似物对血糖控制的全部效力可通过增加注射的摩尔量达到。在如此剂量下，病人可控制他或她的血糖但是获得增加的A同种型信号传导路径激活。所述差异的信号传导可选择性影响β细胞和/或大脑。

使用稳定转染以表达胰岛素受体同种型A或胰岛素受体同种型B之一的IGFR^-/-鼠成纤维细胞，相对于野生型胰岛素评估SCI的同种型选择性活性。所述细胞系表现出可忽略的背景鼠胰岛素受体表达，但是包含胰岛素受体底物1(IRS-1)。细胞生长至～80％覆盖度，血清饥饿过夜，并使用10nM野生型人胰岛素(Sigma)或SCI处理5分钟。胰岛素受体免疫沉淀之后，使用抗磷酸酪氨酸抗血清(PY20)通过蛋白质印迹检测配体依赖的受体自动磷酸化。剥离印迹点并使用抗受体抗体重新检测以校正同种型特异性受体表达的程度。SCI激活的受体同种型A至少与野生型胰岛素效力相同。明显对比之下，SCI依赖的受体同种型B的自动磷酸化比胰岛素依赖的受体同种型B自动磷酸化效力低47±11％。这些数据显示SCI的体外同种型特异性受体结合特性对应于细胞环境中的同种型特异性受体激活。检测配体依赖的IRS-1磷酸化程度的类似蛋白质印迹同样显示相当的SCI同种型特异性信号传导。

根据本发明的另一种类似物的受体结合活性也与SEQ.ID.NO.33(“现有技术SCI”)类似物比较。比较了本发明的单链胰岛素类似物(SCI)，其包含His^A8、Asp^B28、和Pro^B29置换，包含(SEQ.ID.NO.36)或不包含Asp^B10置换(SEQ.ID.NO.26)。在表II中，提供了野生型人胰岛素(HI)和多种胰岛素类似物对A同种型特异性人胰岛素受体(HIRA)、B同种型特异性人胰岛素受体(HIRB)、以及***受体(IGFR)的结合亲和力。与人胰岛素相比，所述现有技术SCI大大降低了对胰岛素受体的亲和力。标示为“A8-His，B-10Asp，B 28-Asp，B 29-Pro ins”的胰岛素类似物具有SEQ.ID.NO.34和35的序列。

胰岛素类似物对HIRA、HIRB和IGFR的亲和力以解离常数(Kd)和相对于未修饰人胰岛素的绝对值提供。所述现有技术SCI对HIRA和HIRB的亲和力分别为人胰岛素的5％和4％。所述现有技术SCI对IGFR的亲和力相对于人胰岛素较高，但仍只有人胰岛素的13％。包含置换Asp^B10的SCI(SEQ.ID.NO.36)对A同种型胰岛素受体的亲和力为人胰岛素的亲和力约7倍，对B同种型胰岛素受体的亲和力约为人胰岛素的一半。同时，该SCI对IGFR的亲和力与人胰岛素的大致相同。作为对比，不包含Asp^B10置换的SCI(SEQ.ID.NO.26)对IGFR的亲和力降低(相对于人胰岛素为0.35)，但与包含Asp^B10置换的SCI比较对HIRA和HIRB的亲和力也较低(分别为2.0和0.36)。对应的两个链的类似物，即包含置换Asp^B10、His^A8、Asp^B28和Pro^B29的两个链的类似物(SEQ.ID.NO.34和35)，对IGFR的亲和力相对于人胰岛素升高(3.54)，同样对HIRA和HIRB的亲和力升高(分别为4.25和4.7)。因此，本发明提供了一种包含Asp^B10置换的胰岛素类似物，其保持至少一半的人胰岛素对HIRB的亲和力，且其对HIRA的亲和力高于人胰岛素，同时保持对IGFR的亲和力与未修饰的人胰岛素在大致相同的水平。

表II

这通过图3A-3C所示的受体结合试验结果证实。胰岛素和胰岛素类似物数据如下表示：未修饰人胰岛素(■)，包含His^A8、Asp^B10、Asp^B28、Pro^B29置换的单链胰岛素(SCI)类似物(▲)，包含His^A8、Asp^B28、Pro^B29置换的SCI类似物(●)，现有技术SCI

在图3A中，受体结合试验使用HIRA。在图3B中，受体结合试验使用HIRB，在图3C中，受体结合试验使用IGFR。这些试验测量在一定范围内的未标记类似物/胰岛素浓度下未标记类似物或胰岛素(B/Bo)对受体结合的¹²⁵I标记胰岛素的替换。

表III提供了***1(IGF-1)、野生型人胰岛素(HI)、具有SEQ.ID.NO.26氨基酸序列(His^A8，Asp^B28，Pro^B29)的单链胰岛素(SCI)、以及胰岛素类似物(Lys^B28，Pro^B29)和Lantus(具有额外的2个精氨酸残基连接到B链羧基末端)的结合亲和力。这些配体对IGFR的亲和力以解离常数(Kd)和相对于IGF-1的绝对值提供。虽然本发明的SCI显示对IGFR的亲和力低于野生型胰岛素，但类似物

和

的亲和力约为未修饰的人胰岛素的2-3倍。

表III

这也反映在图4中，该图显示在一定范围内的未标记肽浓度下未标记配体(B/Bo)对受体结合的¹²⁵I标记IGF-1的替换。

虽然不希望受限于理论，申请人相信所述现有技术SCI结合活性降低是由于连接物中存在赖氨酸和精氨酸导致等电点改变而在A链或B链中没有抵消的置换来保持。但是单链胰岛素类似物SEQ.ID.NO.36的等电点与人胰岛素相似，因为连接物中引入的残基提供的正电荷抵消了至少部分由Asp^B10、Asp^B28和Pro^B29置换引起的电荷改变。A链或B链中额外或交替的置换也可用于影响所得胰岛素类似物的等电点。例如，组氨酸可保持在B10以保持锌结合以及胰岛素六聚体形成。

含有His^A8、Asp^B10、Asp^B28、和Pro^B29置换的57聚体SCI(SEQ.ID.NO.36)在糖尿病大鼠的体内效力与野生型人胰岛素相等。使用链脲菌素使雄性Lewis大鼠(～250g体重)患糖尿病。人胰岛素和胰岛素类似物(SCI(SEQ.ID.NO.36)和缺少6残基连接物的SCI双链类似物(SEQ.ID.NO.34和35))使用HPLC纯化，干燥成粉末，并溶于胰岛素稀释液(Eli Lilly Corp)。大鼠在时间＝0时以100μl稀释液中的1.5U/kg体重皮下注射。在时间0时以及每10分钟直至90分钟从尾尖采血。使用Hypoguard Advance Micro-Draw仪器测量血糖。对于人胰岛素、SCI、以及双链对照类似物，观察到血糖浓度分别以每小时64.2±16.9、62.0±16.3、以及53.2±11.7mg/dL的速率下降。这些数值在变化中难以区分(图5)。在图5中，显示了人胰岛素(○)、SCI(His^A8、Asp^B10、Asp^B28、和Pro^B29)(■)、双链类似物(His^A8、Asp^B10、Asp^B28、和Pro^B29)(▲)随时间变化的相对血糖水平。在全剂量-反应曲线中，SCI(His^A8、Asp^B10、Asp^B28、和Pro^B29)在其降血糖功能方面同样与野生型人胰岛素难以区分。

以往在临床使用的胰岛素类似物制剂中避免使用Asp^B10，因为其影响对IGFR的交叉结合及相关的有丝***。在Sprague-Dawley大鼠中试验Asp^B10胰岛素导致乳腺肿瘤发生率上升。IGF-I在同源位点(Glu9)含有负电荷；据信Asp^B10模仿该电荷显著增强Asp^B10胰岛素类似物对IGFR的结合。出乎意料地，我们已发现SCI(His^A8、Asp^B10、Asp^B28、和Pro^B29)对IGFR的亲和力与人胰岛素相似；任何潜在的升高都＜2倍。由于Humalog中Lys^B28-Pro^B29置换产生对IGFR交叉结合的2倍增加，而在患者中没有可检测的癌症风险升高，SCI(His^A8、Asp^B10、Asp^B28、和Pro^B29)(SEQ.ID.NO 36)的IGFR结合特性未必有重要意义。

基于上述公开，现在应明确本文提供的单链胰岛素类似物可提供相对于天然胰岛素增强的同种型特异性受体结合，其对IR-A优先结合但没有增强对IGFR的结合。因此，应了解任何变型明显应列入所要求的发明的范围，因此可确定选择具体成分元素而不背离本文公开和描述的本发明的精神。

Claims

1.一种治疗哺乳动物的方法，其包含施用生理学上有效量的胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐，其中所述胰岛素类似物表现出对胰岛素受体同种型A(IR-A)的结合亲和力为对胰岛素受体同种型B(IR-B)的结合亲和力的两倍以上，并且其中所述类似物与衍生所述类似物的野生型胰岛素比较，具有至少三分之一的对IR-B的相对结合亲和力。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐表现出对IR-A的结合亲和力为对IR-B的结合亲和力的至少4倍。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐为单链胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐，其包含胰岛素A链序列或其类似物以及胰岛素B链序列或其类似物，两者以4-13个氨基酸的多肽连接。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述4-13个氨基酸的多肽具有序列Gly-Gly-Gly-Pro-Arg-Arg(SEQ.ID.NO.19)。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐为哺乳动物胰岛素的类似物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐为人胰岛素的类似物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐为以下的多肽：其具有选自具有SEQ.ID.NO.26和36序列的多肽的序列。

8.一种包含单链多肽的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物表现出对胰岛素受体同种型A(IR-A)的结合亲和力为对胰岛素受体同种型B(IR-B)的结合亲和力的两倍以上，且其中所述胰岛素类似物对***受体的亲和力不高于体外测量的天然胰岛素。

9.根据权利要求8所述的胰岛素类似物，其中所述类似物表现出对胰岛素受体A同种型的选择性结合为对胰岛素受体B同种型的结合的至少4倍。

10.根据权利要求9所述的胰岛素类似物，包含以下多肽：其具有选自具有SEQ.ID.NO.17序列的多肽的序列，其中Xaa_4-13为6个任意氨基酸，条件是Xaa_4-13的首两个氨基酸不是精氨酸。

11.根据权利要求9所述的胰岛素类似物，包含结构式I的单链多肽，

B-C-A (I)

其中B包含具有下列序列的多肽：

FVNQHLCGSX₂LVEALYLVCGERGFFYTX₃X₄T(SEQ.ID.NO.38)

其中X₂为D或H，X₃为P、D或K，X₄为K或P，

其中C为由序列GGGPRR(SEQ.ID.NO.19)组成的多肽，并且

其中A包含具有下列序列的多肽：

GIVEQCCX₁SICSLYQLENYCN(SEQ.ID.NO.37)

其中X₁为T或H。

12.根据权利要求11所述的胰岛素类似物，包含以下多肽：其选自具有SEQ.ID.NO.26序列的多肽和具有SEQ.ID.NO.36序列的多肽。

13.根据权利要求12所述的胰岛素类似物，包含具有SEQ.ID.NO.26序列的多肽。

14.根据权利要求12所述的胰岛素类似物，包含具有SEQ.ID.NO.36序列的多肽。

15.核酸，其编码根据权利要求10-12中任一权利要求所述的单链胰岛素类似物。

16.表达载体，其包含根据权利要求15所述的核酸序列。

17.宿主细胞，其以权利要求16所述的表达载体转化。