CN113603769A - 一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其建立方法和应用 - Google Patents
一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其建立方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物免疫技术领域，具体涉及一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其建立方法和应用；通过在大肠杆菌中表达重组SARS‑COV‑2病毒N蛋白并进行纯化，采用纯化的重组核蛋白进行动物免疫，获得可稳定分泌抗SARS‑CoV‑2的单克隆抗体的杂交瘤细胞株nCoVN3G6，并利用nCoVN3G6单克隆抗体建立了新冠捕获法IgM ELISA、双抗体夹心法ELISA检测新冠病毒抗原、胶体金检测新冠病毒抗原的试剂盒、时间分辩荧光层析检测新冠病毒抗原试剂盒，为今后SARS‑COV‑2病毒感染的诊断、感染机制及疫苗开发的研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物免疫技术领域，具体涉及一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其建立方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。SARS-CoV-2属于冠状病毒科β冠状病毒属，是一种有包裹的正链单链RNA病毒，直径约80-120nm，病毒基因组含29844个碱基，编码的病毒结构蛋白主要有刺突(Spike，S)蛋白，膜(membrane,M)蛋白和核衣壳(Nucleocapsid, N)蛋白。新型冠状病毒感染引起的疾病称为2019冠状病毒病(COVID-19)，感染的症状可从轻度或极小的呼吸症状到急性呼吸窘迫综合征(ARDS)甚至死亡，目前对于COVID-19没有特异治疗方法。早期快速诊断是防治的关键，对控制院内感染，切断疾病传播等至关重要。
目前，RT-PCR已成为诊断COVID-19的金标准，但是研究表明此方法对操作人员和实验室条件有很高的要求，此外，无症状感染者出现，且部分患者在疾病发作后病毒载量较低，因此迫切需要一种基于COVID-19的病毒抗体的免疫学检测方法作为补充。
现有申请号为CN202010564744.1的专利文件公开了一种可分泌新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体，其是将SARS-CoV-2的N蛋白用生理盐水稀释后与Quick Anti-body-Mouse 3W佐剂混合后注射免疫Balb/c小鼠，取血清检测血清效价，将脾脏细胞和骨髓瘤细胞进行融合后培养，经克隆、冻存、纯化、透析、筛选后获得杂交瘤细胞株。
申请号为CN202010986023.X的专利文件公开了一种用于检测SARS-CoV-2病毒N蛋白的单克隆抗体及其应用，其虽然也是采用重组N蛋白通过动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞培养筛选得到杂交瘤细胞，但其采用的重组N蛋白是通过新冠病毒基因组序列中编码N蛋白的核苷酸序列合成完整的开放读码框区域，并克隆到质粒载体pUC57上，设计上游引物和下游引物，并引入EcoRI/XhoI双酶切位点，经细胞转染和培养，纯化后得到带有组氨酸标签的重组N蛋白。
单克隆抗体是由单个B淋巴细胞产生的针对单个抗原决定族的单一抗体，因来自于一个B淋巴细胞，具有高度特异性而得到广泛应用。多由具有产生抗体功能的B淋巴细胞与具有永生功能的骨髓瘤细胞融合而形成的杂交瘤细胞分泌产生。因此不同的杂交瘤细胞株因其B淋巴细胞来源不同，所分泌的单克隆抗体多只有单一的反应性，即只能用于一种检测方法，筛选出分泌具有多反应性单克隆抗体的杂交瘤细胞株是一项巨大挑战。同时杂交瘤细胞株在传代过程中以及冻存与复苏过程中，常常导致分泌单克隆抗体能力的下降甚至丢失，获得稳定分泌单克隆抗体的细胞株也是一项挑战。
发明内容
本发明为解决上述问题，提供了一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其建立方法和应用。
具体是通过以下技术方案来实现的：
一、一种分泌抗新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤 细胞株，命名为nCoVN3G6，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址为： 中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年12月01日，保藏编号为CCTCC NO:C2020255。
二、所述分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株建立方法，包括以下步骤：
1、重组核蛋白
根据公布的SARS-CoV-2基因组序列，人工合成编码SARS-CoV-2核衣壳蛋白的适于在大肠杆菌中表达的基因序列，并克隆到表达载体pET28a上。以重组表达载体转化感受态大肠杆菌BL-21，涂LB卡那霉素平板，37℃条件下静置培养过夜，次日分别挑取单菌落，接种于3ml LB培养液中，37℃条件下振荡培养 16h，提取质粒，进行基因测序。将测序正确的重组表达质粒转化BL-21菌，接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中管中，37℃条件下振荡培养过夜，再按1％的接种量分别接种于含50μg/ml卡那霉素200mlLB培养基三角瓶中扩大培养，在37℃条件下振荡培养至菌液A600值约为0.6时，加入终浓度为0.5M 的IPTG，37℃条件下振荡培养诱导4h。收集菌体超声破碎后离心，取上清，用用Ni2+亲和层析柱进行纯化，纯化表达产物经12％SDS-PAGE及Western blot 进行鉴定分析。
2、细胞融合
用纯化后的重组SARS-COV-2核蛋白免疫BALB/C小鼠，按每只每次小鼠100 微克的剂量免疫，首次免疫使用弗氏完全佐剂乳化，二次免疫和三次免疫使用不完全佐剂乳化，免疫间隔时间为两周，三次免疫7d后经小鼠尾部采血测血清抗体效价。融合前3d加强免疫一次，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0按照常规方法进行细胞融合，经HAT选择培养筛选杂交瘤细胞。
3、筛选
使用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，3次有限稀释法亚克隆后，获得1 株稳定分泌抗SARS-COV-2-N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为 nCoVN3G6。
4、杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体鉴定
将杂交瘤细胞株nCoVN3G6分泌的单克隆抗体分别与SARS-COV-2感染细胞、流感病毒感染细胞、EV71病毒感染细胞和柯萨基病毒感染细胞进行反应，利用间接免疫荧光法进行特异性鉴定。
将分泌抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔制备腹水，对腹水的ELISA及免疫荧光效价、单克隆抗体的特异性及所分泌单克隆抗体亚类鉴定。
5、杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体稳定性检测
将杂交瘤细胞株nCoVN3G6，在含10％胎牛血清的1640培养基中培养，根据细胞生长状况3-4天后1:4加入新鲜培养基后传代培养，连续传代30代后，取培养细胞上清液，进行免疫荧光、ELISA及Western-blot检测分泌抗体检测。
同时取传代的杂交瘤细胞，离心收集细胞后加入细胞冻存液，放-80℃冰箱及液氮罐冻存3月、6月、12月后，取冻存细胞，复苏后加入上述培养基培养并检测分泌单克隆抗体稳定性。
三、所述杂交瘤细胞株nCoVN3G6分泌的单抗的应用方法
1、使用nCoVN3G6单抗的捕获法新冠IgM抗体检测ELISA试剂盒
以1:500磷酸盐缓冲液(PBS pH7.2)稀释的羊抗人IgM抗体，每孔100μL 加入96孔ELISA反应板，4℃包被过夜，再每孔加入100μL 3％BSA室温封闭1 小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入100μL1:100稀释患者血清，37℃反应1小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入100μL(25ng)重组 SARS-CoV-2--N蛋白，37℃反应1小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的nCoVN3G6单克隆抗体，37℃反应1小时， PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入HRP底物(ABTS或TMB或OPD)，37℃显色反应30分钟后终止反应，用酶标仪测定各样本孔吸光度OD值，OD值高于阴性对照2倍以上判断为阳性。
2、使用nCoVN3G6单抗的双抗体夹心法检测SARS-CoV-2病毒抗原ELISA 试剂盒
以1:10000磷酸盐缓冲液(PBS pH7.2)稀释的nCoVN3G6单克隆抗体，每孔100μL加入96孔ELISA反应板，4℃包被过夜，再每孔加入100μL 3％BSA 室温封闭1小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入100μL患者鼻咽拭子样本保存液，37℃反应1小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入100μL 稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的nCoVN3G6单克隆抗体，37℃反应1小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入HRP底物(ABTS或TMB或OPD)， 37℃显色反应30分钟后终止反应，用酶标仪测定各样本孔吸光度OD值，OD 值高于阴性对照2倍以上判断为阳性。
3、使用nCoVN3G6单抗的胶体金检测新冠病毒抗原试剂盒
试剂盒为免疫胶体金试纸条，试纸条按照连接顺序依次包括：样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板。
所述硝酸纤维素膜与胶体金垫之间有搭接，硝酸纤维素膜与吸水纸之间有搭接，胶体金垫是由吸附有胶体金标记的抗新冠病毒的nCoVN3G6单克隆抗体的玻璃纤维素膜组成，硝酸纤维素膜上具有山羊抗鼠IgG多克隆抗体包被的质控线，以及nCoVN3G6单克隆抗体包被的检测线。
质控线是通过将山羊抗鼠IgG多克隆抗体以0.8mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上得到的；所述检测线是通过将nCoVN3G6单克隆抗体以0.5mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上得到的。
所述试剂盒用于SFTS病毒检测的检测方法为：在点样孔滴加测试样品 200μL，反应10-15min观察结果；质控线和检测线都出现红色条带，则为阳性；仅在质控线出现现一条红色条带，则为阴性；若质控线无条带出现，不论检测线是否出现红色条带结果均判定为无效。
4、使用nCoVN3G6单抗的时间分辩荧光层析检测新冠病毒抗原试剂盒
试剂盒为时间分辩荧光层析试纸条，试纸条按照连接顺序依次包括：样品垫，荧光球垫，硝酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板。
所述硝酸纤维素膜与荧光球垫之间有搭接，硝酸纤维素膜与吸水纸之间有搭接，荧光球垫是由吸附有时间分辩荧光球标记的抗新冠病毒的nCoVN3G6单克隆抗体的玻璃纤维素膜组成，硝酸纤维素膜上具有山羊抗鼠IgG多克隆抗体包被的质控线，以及nCoVN3G6单克隆抗体包被的检测线。
质控线是通过将山羊抗鼠IgG多克隆抗体以0.8mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上得到的；所述检测线是通过将nCoVN3G6单克隆抗体以0.5mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上得到的。
所述试剂盒用于SFTS病毒检测的检测方法为：在点样孔滴加测试样品200 μL，反应10-15min观察结果；质控线和检测线以干式荧光免疫分析仪检测都出现荧光信号，则为阳性；仅在质控线出现现荧光信号，则为阴性；若质控线无荧光信号，不论检测线是否出现荧光信号结果均判定为无效。
综上所述，本发明的有益效果在于：本发明通过在大肠杆菌中表达重组SARS-COV-2病毒N蛋白并进行纯化，采用纯化的重组核蛋白进行动物免疫，建立可稳定分泌抗SARS-CoV-2的单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株 nCoVN3G6，并利用nCoVN3G6单克隆抗体建立了新冠捕获法IgM ELISA、双抗体夹心法ELISA检测新冠病毒抗原、胶体金检测新冠病毒抗原的试剂盒、时间分辩荧光层析检测新冠病毒抗原试剂盒，为今后SARS-COV-2病毒感染的诊断、感染机制及疫苗开发的研究奠定了基础。
由于SARS-CoV-2的N蛋白是冠状病毒中含量最丰富的蛋白，位于病毒内部，具有高度保守性。N蛋白是一种具有高免疫原性的磷酸化蛋白，在病毒体组装过程中，N蛋白与病毒RNA结合形成螺旋核衣壳并且与病毒基因组复制和调节细胞信号通路有关。因此，利用SARS-CoV-2的N蛋白建立杂交瘤细胞株能稳定获得抗SARS-CoV-2的单克隆抗体，进一步，将抗SARS-CoV-2的单克隆抗体应用至检测试剂盒中，对无症状感染者也能及时诊断，现如今采用的咽拭子核酸检测对于部分无症状感染者需要检测多次才能检出阳性反应，并且咽拭子检查新冠核酸阳性率并非100％，如果是有流行病学史并且有发热症状的患者，要完善胸部CT、血常规检查，进行综合判断。利用病毒抗体的免疫学检测方法作为补充诊断方法，能在病毒潜伏早期快速高效的检测出来，有效控制感染，切断疾病传播。
在不同实验室获得的杂交瘤细胞株，是各自独立制备的细胞株，分泌的单克隆抗体特征、细胞稳定性及应用范围可能存在差异。以本发明方法制备的此杂交瘤细胞株，经液氮反复冻存及复苏传代，证明能稳定分泌抗新冠病毒N蛋白的单克隆抗体，所分泌的单克隆抗体可用于免疫荧光、ELISA、Western-blot、胶体金试纸条等多种方法检测新冠病毒抗原，具有广泛用途。
附图说明
图1为重组SARS-COV-2-N蛋白SDS-PAGE分析结果；其中，Lane M为标准分子量蛋白，lane 1为超声破碎大肠杆菌后上清；lane 2为超声破碎大肠杆菌后细菌沉渣；lane 3为纯化后的重组蛋白；lane4为纯化后的重组蛋白。
图2为纯化重组SARS-COV-2-N蛋白Western-blot分析结果；其中，Lane M 为标准分子量蛋白，lane 1为纯化后重组蛋白。
图3为nCoVN3G6单抗免疫荧光分析结果；其中，A图为未感染Vero细胞分析结果；B图为新冠病毒感染Vero细胞分析结果。
图4为nCoVN3G6单抗与重组SARS-CoV-2-N蛋白反应Western-blot分析结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
建立抗新冠病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株：
1、重组核蛋白
根据公布的SARS-CoV-2基因组序列，人工合成编码SARS-CoV-2核衣壳蛋白的适于在大肠杆菌中表达的基因序列，并克隆到表达载体pET28a上。以重组表达载体转化感受态大肠杆菌BL-21，涂LB卡那霉素平板，37℃条件下静置培养过夜，次日分别挑取单菌落，接种于3ml LB培养液中，37℃条件下振荡培养 16h，提取质粒，进行基因测序。将测序正确的重组表达质粒转化BL-21菌，接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中管中，37℃条件下振荡培养过夜，再按1％的接种量分别接种于含50μg/ml卡那霉素200mlLB培养基三角瓶中扩大培养，在37℃条件下振荡培养至菌液A600值约为0.6时，加入终浓度为0.5M 的IPTG，37℃条件下振荡培养诱导4h。收集菌体超声破碎后离心，取上清，用用Ni2+亲和层析柱进行纯化。
纯化表达产物经12％SDS-PAGE分析，可见相对分子量约50kD的特异蛋白条带，大小与预期相符，如图1所示。
纯化表达产物经Western blot进行分析显示，纯化重组蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，电泳转移至PADF纤维膜，与恢复期新冠病人血清反应，纯化表达重组蛋白与新冠患者血清发生特异性反应，证实表达蛋白为SARS-COV-2-N蛋白，如图2所示。
2、细胞融合
用纯化后的重组SARS-COV-2核蛋白免疫BALB/C小鼠，按每只每次小鼠 100微克的剂量免疫，首次免疫使用弗氏完全佐剂乳化，二次免疫和三次免疫使用不完全佐剂乳化，免疫间隔时间为两周，三次免疫7d后经小鼠尾部采血测血清抗体效价。融合前3d加强免疫一次，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0按照常规方法进行细胞融合，经HAT选择培养筛选杂交瘤细胞。
3、筛选
使用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，3次有限稀释法亚克隆后，获得1 株稳定分泌抗SARS-COV-2-N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为 nCoVN3G6。
4、杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体鉴定
(1)采用间接免疫荧光法进行检测：
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染绿猴肾(Vero)细胞片的制备及灭活在日本长崎大学热带医学研究所生物安全3级(P3)实验室进行。主要操作如下：
取新型冠状病日本分离株TY-WK-521/20202(Genebank号:LC522975)，接种Vero细胞，在含2％胎牛血清的Eagle基础培养基下37℃培养4天。病毒感染细胞经0.25％胰酶消化，磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2)洗涤2次，2000转 /分钟离心收集细胞，悬浮于少量PBS中。未感染Vero作同样处理。病毒感染及未感染Vero分别滴于8孔载玻片上(MP Bio-chemicals,CA,USA)，吹干细胞片，紫外线灭活后4℃预冷丙酮固定并进一步灭活处理。病毒感染及未感染Vero 细胞玻片经3％BSA室温1小时封闭，加nCoVN3G6杂交瘤细胞培养上清或稀释杂交瘤细胞腹水，37℃反应1小时，PBS缓冲液洗片，吹干玻片，加1:50稀释 FITC-标记羊抗鼠IgG抗体，37℃反应1小时，PBS缓冲液洗片，吹干玻片，后加荧光保护剂(VectorLaboratories,Inc.)，放上盖玻片后封片，荧光显微镜下 (Olympus，Japan)观察记录结果，如图3所示。
(2)对nCoVN3G6单抗进行western-blot分析：
分析结果显示，nCoVN3G6单抗可特异识别重组SARS-CoV-2-N蛋白，如图 4所示。提示nCoVN3G6单抗可用于新冠病毒的western-blot分析。
(3)ELISA及免疫荧光效价鉴定：
将杂交瘤细胞nCoVN3G6注入小鼠腹腔，制备腹水的单抗效价，以包被重组核蛋白的间接ELISA法进行测定，效价为1：100，000；间接免疫荧光法测定，腹水效价为1:100000；均明显高于免疫血清的效价。
(4)单抗亚类鉴定：
经鉴定，本株单抗重链为IgG2a，轻链为κ链。
5、杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体稳定性测定
将杂交瘤细胞株nCoVN3G6，在含10％胎牛血清的1640培养基中培养，根据细胞生长状况4天后1:4加入新鲜培养基后传代培养，连续传代30代后，取培养细胞上清液，进行免疫荧光、ELISA及Western-blot检测分泌抗体检测。
同时取传代的杂交瘤细胞，离心收集细胞后加入细胞冻存液，放-80℃冰箱及液氮罐冻存3月、6月、12月后，取冻存细胞，复苏后加入上述培养基培养并检测分泌单克隆抗体稳定性。
结果显示，杂交瘤细胞株nCoVN3G6经连续传代培养30代以上，以及经过不同时间段反复冻存、复苏后，能稳定分泌抗新冠病毒N蛋白的单克隆抗体，是一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
实施例2
使用nCoVN3G6单抗的捕获法新冠IgM抗体检测ELISA试剂盒
以1:500磷酸盐缓冲液(PBS pH7.2)稀释的羊抗人IgM抗体，每孔100μL 加入96孔ELISA反应板，4℃包被过夜，再每孔加入100μL 3％BSA室温封闭1 小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入100μL1:100稀释患者血清，37℃反应1小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入100μL(25ng)重组 SARS-CoV-2--N蛋白，37℃反应1小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的nCoVN3G6单克隆抗体，37℃反应1小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入HRP底物(ABTS或TMB或OPD)，37℃显色反应30分钟后终止反应，用酶标仪测定各样本孔吸光度OD值，OD值高于阴性对照2倍以上判断为阳性。
SARS-CoV-2-病毒特异性IgM抗体阳性可以诊断SARS-CoV-2病毒近期感染，是COVID-19的主要辅助诊断手段。
实施例3
使用nCoVN3G6单抗的双抗体夹心法检测SARS-CoV-2病毒抗原ELISA试剂盒
以1:10000磷酸盐缓冲液(PBS pH7.2)稀释的nCoVN3G6单克隆抗体，每孔100μL加入96孔ELISA反应板，4℃包被过夜，再每孔加入100μL 3％BSA 室温封闭1小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入100μL患者鼻咽拭子样本保存液，37℃反应1小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入100μL 稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的nCoVN3G6单克隆抗体，37℃反应1小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入HRP底物(ABTS或TMB或OPD)， 37℃显色反应30分钟后终止反应，用酶标仪测定各样本孔吸光度OD值，OD 值高于阴性对照2倍以上判断为阳性。
实施例4
使用nCoVN3G6单抗的胶体金检测新冠病毒抗原试剂盒
试剂盒为免疫胶体金试纸条，试纸条按照连接顺序依次包括：样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板。
所述硝酸纤维素膜与胶体金垫之间有搭接，硝酸纤维素膜与吸水纸之间有搭接，胶体金垫是由吸附有胶体金标记的抗新冠病毒的nCoVN3G6单克隆抗体的玻璃纤维素膜组成，硝酸纤维素膜上具有山羊抗鼠IgG多克隆抗体包被的质控线，以及nCoVN3G6单克隆抗体包被的检测线。
质控线是通过将山羊抗鼠IgG多克隆抗体以0.8mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上得到的；所述检测线是通过将nCoVN3G6单克隆抗体以0.5mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上得到的。
所述试剂盒用于SFTS病毒检测的检测方法为：在点样孔滴加测试样品200 μL，反应10-15min观察结果；质控线和检测线都出现红色条带，则为阳性；仅在质控线出现现一条红色条带，则为阴性；若质控线无条带出现，不论检测线是否出现红色条带结果均判定为无效。
采用本试纸条分别对新冠病毒、流感病毒H1N1、肠道病毒EV71、柯萨基病毒CA16进行测试，结果显示基于nCoVN3G6单抗的试纸条特异性与新冠病毒反应，与流感病毒H1N1、肠道病毒EV71、柯萨基病毒CA16无交叉反应。
实施例5
使用nCoVN3G6单抗的时间分辩荧光层析检测新冠病毒抗原试剂盒
试剂盒为时间分辩荧光层析试纸条，试纸条按照连接顺序依次包括：样品垫，荧光球垫，硝酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板。
所述硝酸纤维素膜与荧光球垫之间有搭接，硝酸纤维素膜与吸水纸之间有搭接，荧光球垫是由吸附有时间分辩荧光球标记的抗新冠病毒的nCoVN3G6单克隆抗体的玻璃纤维素膜组成，硝酸纤维素膜上具有山羊抗鼠IgG多克隆抗体包被的质控线，以及nCoVN3G6单克隆抗体包被的检测线。
质控线是通过将山羊抗鼠IgG多克隆抗体以0.8mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上得到的；所述检测线是通过将nCoVN3G6单克隆抗体以0.5mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上得到的。
所述试剂盒用于SFTS病毒检测的检测方法为：在点样孔滴加测试样品200 μL，反应10-15min观察结果；质控线和检测线以干式荧光免疫分析仪检测都出现荧光信号，则为阳性；仅在质控线出现现荧光信号，则为阴性；若质控线无荧光信号，不论检测线是否出现荧光信号结果均判定为无效。
采用本试纸条分别对新冠病毒、流感病毒H1N1、肠道病毒EV71、柯萨基病毒CA16进行测试，结果显示基于nCoVN3G6单抗的试纸条特异性与新冠病毒蛋白反应，与流感病毒H1N1、肠道病毒EV71、柯萨基病毒CA16无交叉反应。
Claims (10)
1.稳定分泌抗新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为nCoVN3G6，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年12月01日，保藏编号为CCTCC NO:C2020255。
2.如权利要求1所述的稳定分泌抗新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株nCoVN3G6，其特征在于，所述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体重链为IgG2a，轻链为κ链。
3.如权利要求1或2所述的分泌抗新型冠状病毒SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株nCoVN3G6，其特征在于，所述杂交瘤细胞株是通过在大肠杆菌中表达重组SARS-COV-2病毒N蛋白、纯化、动物免疫、细胞融合、筛选、鉴定过程获得。
4.一种稳定分泌抗新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株nCoVN3G6的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)重组核蛋白：在大肠杆菌中表达重组SARS-CoV-2病毒N蛋白，采用Ni2+亲和层析柱进行纯化；
(2)细胞融合：将纯化的重组核蛋白对小鼠进行免疫，将免疫鼠脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，培养得到杂交瘤细胞；
(3)筛选：采用间接ELISA和间接免疫荧光法检测杂交瘤细胞上清液，筛选出分泌抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株nCoVN3G6；
(4)鉴定：采用间接免疫荧光法特异性鉴定杂交瘤细胞株nCoVN3G6分泌的单克隆抗体与SARS-COV-2感染细胞、流感病毒感染细胞、EV71病毒感染细胞和柯萨基病毒感染细胞之间的反应。
5.如权利要求4所述的杂交瘤细胞株nCoVN3G6的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)重组核蛋白：根据公布的SARS-CoV-2基因组序列，人工合成编码SARS-CoV-2核衣壳蛋白的适于在大肠杆菌中表达的基因序列，并克隆到表达载体pET28a上，以重组表达载体转化感受态大肠杆菌BL-21进行培养，提取质粒进行基因测序，将测序正确的重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL-21，再进行培养至菌液A600值约为0.6时，加入终浓度为0.5M的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG，培养诱导4h后收集菌体，经超声破碎、离心后取上清，用用Ni2+亲和层析柱进行纯化，并对纯化表达产物进行鉴定分析；
(2)细胞融合：用纯化后的重组核蛋白按每只每次小鼠100微克的剂量免疫BALB/C小鼠，经三次免疫和一次加强免疫后取免疫鼠脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，培养得到杂交瘤细胞；
(3)筛选：采用间接ELISA和间接免疫荧光法筛选阳性杂交瘤细胞，经3次有限稀释法亚克隆后，获得1株稳定分泌抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株nCoVN3G6；
(4)鉴定：采用间接免疫荧光法特异性鉴定杂交瘤细胞株nCoVN3G6分泌的单克隆抗体与SARS-COV-2感染细胞、流感病毒感染细胞、EV71病毒感染细胞和柯萨基病毒感染细胞之间的反应；并采用分泌抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔制备腹水，对腹水的ELISA及免疫荧光效价、单克隆抗体的特异性及所分泌单克隆抗体的亚类进行鉴定。
6.如权利要求1-3任一项所述的杂交瘤细胞株nCoVN3G6或权利要求4-6任一项所述建立方法获得的杂交瘤细胞株nCoVN3G6在新型冠状病毒检测中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是：杂交瘤细胞株nCoVN3G6在使用nCoVN3G6单抗的捕获法，获得检测新型冠状病毒IgM抗体检测ELISA试剂盒中的应用。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是：杂交瘤细胞株nCoVN3G6在使用nCoVN3G6单抗的双抗体夹心法，获得检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原ELISA试剂盒中的应用。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是：杂交瘤细胞株nCoVN3G6在使用nCoVN3G6单抗的胶体金法，获得检测新型冠状病毒抗原试剂盒中的应用。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是：杂交瘤细胞株nCoVN3G6在使用nCoVN3G6单抗的时间分辩荧光层析法，获得检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原试剂盒中的应用。
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