CN111999497A - 检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用 - Google Patents

检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111999497A
CN111999497A CN202010854943.6A CN202010854943A CN111999497A CN 111999497 A CN111999497 A CN 111999497A CN 202010854943 A CN202010854943 A CN 202010854943A CN 111999497 A CN111999497 A CN 111999497A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
seq
enzyme
acid sequence
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010854943.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111999497B (zh
Inventor
董春娜
张蕾
宋芳
肖进
齐鹏
李静
李鹏宇
刘新月
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Original Assignee
China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Animal Husbandry Industry Co Ltd filed Critical China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Priority to CN202010854943.6A priority Critical patent/CN111999497B/zh
Publication of CN111999497A publication Critical patent/CN111999497A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111999497B publication Critical patent/CN111999497B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56994—Herpetoviridae, e.g. cytomegalovirus, Epstein-Barr virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/145—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus, Duvenhage virus, Mokola virus or vesicular stomatitis virus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种特异性定量检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用。该试剂盒包括作为捕获抗体包被的酶联反应板和酶标抗体的单克隆抗体。所述单克隆抗体重链可变区：CDR1如序列1的第31～36位氨基酸所示；CDR2如序列1的第51～66位氨基酸所示；CDR3如序列1的第99～105位氨基酸所示；轻链可变区：CDR1如序列2的第24～40位氨基酸所示；CDR2如序列2的第56～62位氨基酸所示；CDR3如序列2的第95～103位氨基酸所示。采用狂犬病毒的特异性单克隆抗体制成的酶联免疫定量检测试剂盒，灵敏度高、特异性强，可以有效地区分并检测样品中狂犬病毒糖蛋白抗原的含量。

Description

检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种特异性定量检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫检测试剂盒，适用于狂犬病毒糖蛋白抗原的特异、快速、准确检测。
背景技术
狂犬病毒是弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)的成员。根据对狂犬病毒N蛋白单克隆抗体以及G蛋白系列的分析和鉴定，全球各地的狂犬病毒主要分成4个血清型。其中血清1型即为人们所熟知的地理分布最广、对世界人民健康威胁最大的狂犬病毒，包括野病毒和固定毒实验室株(如SAD)。随着现代分子生物学的研究进展，参照狂犬病毒核蛋白(N protein)基因N端500个核苷酸的相似率，狂犬病毒属被分成7种基因型，基因型2～6只在欧洲和非洲发现。
狂犬病毒为不分节段的单股负链RNA病毒，其基因组总长度约1,2000nt，主要编码五种已知的结构蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA多聚酶(L)。在狂犬病毒感染过程中，人和动物机体既可以产生细胞免疫应答又可以产生体液免疫应答。主要侵害神经细胞、T淋巴细胞为主的淋巴细胞，但对B淋巴细胞影响较小。在此过程中，病毒免疫除了与G蛋白有关外，现在逐步发现与N蛋白和P蛋白也与病毒免疫相关。N基因长度为1350-1353nt，编码N蛋白(Nucleoprotien)，主要负责包装病毒基因组RNA。由于N基因的含量丰富，并且其编码的N蛋白易于被荧光抗体方法检测，所以N基因和N蛋白在抗原诊断及进化分析中应用最广泛的。
目前测定狂犬病毒糖蛋白抗原的方法主要免疫荧光法、RT-PCR核酸检测法、病毒分离的方法主要包括细胞培养分离和乳鼠接种法分离，由于以上检测方法都必须在P2或P3实验室中完成，并且上述方法也必须专业的实验人员和设备才能够完成，且耗时较长，根本无法满足大范围的快速诊断需求，因而，需要开发一种操作便捷，特异，灵敏、准确、可靠的狂犬病毒糖蛋白抗原检测方法。
目前，酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA)是市场上主流的免疫测定技术，已广泛应用于临床检测，快速便捷且灵敏度高，且不需要特殊的仪器设备。伴随着单克隆抗体技术的发展，各种病原的抗原检测方法得到了前所未有的发展，由于单克隆抗体是针对抗原上单一表位筛选制备的抗体，因此能够敏感特异地识别狂犬病毒糖蛋白抗原，为基于单克隆抗体技术的狂犬病毒糖蛋白抗原检测方法奠定了基础，目前还未检索到有关狂犬病抗原定量检测的酶联免疫吸附试验的检测方法，因此本发明具有独创性和新颖性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于特异性定量检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒，该试剂盒利用一株可以与狂犬病毒糖蛋白抗原特异性结合的单克隆抗体RV1作为捕获抗体及检测抗体，建立了一种特异性、敏感性和重复性好的狂犬病毒糖蛋白抗原检测方法，用于检测疫苗生产过程中的培养液、灭活液、纯化液、浓缩液和破乳后的成品疫苗等中的狂犬病毒糖蛋白抗原含量。
基于上述目的，本发明的特异性定量检测狂犬病毒糖蛋白抗原酶联免疫试剂盒，包括以捕获抗体包被的酶联反应板和酶标检测抗体。所述酶标检测抗体优选为经辣根化物酶标记抗体，所述辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在检测抗体上。捕获抗体和检测抗体均为与狂犬病毒糖蛋白抗原特异性结合的单克隆抗体RV1。
所述捕获抗体和检测抗体(与狂犬病毒糖蛋白抗原特异性结合的单克隆抗体RV1)均为含有重链可变区RV1-VH和轻链可变区RV1-VL；所述RV1-VH和RV1-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述RV1-VH和所述RV1-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述RV1-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第31～36位氨基酸所示；所述RV1-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第51～66位氨基酸所示；所述RV1-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第99～105位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24～40位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第56～62位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第95～103位氨基酸所示；
优选的，所述RV1-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～116位所示；其RV1-VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1～113位所示；
所述酶联反应板的最佳包被制备方法及条件是将所述狂犬病毒的一株特异性单克隆抗体RV1用pH 9.6的碳酸盐溶液稀释成0.5～10μg/ml(优选0.5-4ug/ml，更优选1-4ug/ml，最后选1ug/ml)的包被工作液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，100μl/孔，2～8℃下放置8～12小时，使特异性单克隆抗体RV1与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后2～8℃密封保存。
优选的，所述试剂盒还包括抗原标准品，所述抗原标准品为狂犬病毒糖蛋白抗原，纯度不低于80％，抗原含量为4IU，使用时用样品稀释液稀释至(6.2mIU～200mIU)，所测OD450nm值用于绘制标准曲线。
本发明试剂盒是采用狂犬病毒特异性单克隆抗体制成的双抗体夹心法酶联免疫定量检测试剂盒，通过检测酶催化底物产生的信号变化来定量检测样品中狂犬病毒的抗原含量。
更进一步的，所述试剂盒还包括样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液。所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板。所述样品稀释液为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。所述20倍浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
本发明还要求保护单克隆抗体，其可与狂犬病毒糖蛋白抗原特异性结合，是下述单克隆抗体：
1)含有重链可变区RV1-VH和轻链可变区RV1-VL；所述RV1-VH和RV1-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述RV1-VH和所述RV1-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述RV1-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第31～36位氨基酸所示；所述RV1-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第51～66位氨基酸所示；所述RV1-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第99～105位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQID No.2的第24～40位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第56～62位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第95～103位氨基酸所示；
2)含有重链可变区RV1-VH和轻链可变区RV1-VL；所述RV1-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～116位所示；其RV1-VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1～113位所示；上述酶联免疫试剂盒在特异性定量检测狂犬病毒糖蛋白抗原中的应用也属于本发明的保护范围。
上述可以与狂犬病毒糖蛋白抗原特异性结合的单克隆抗体在制备检测狂犬病毒的试剂盒中的应用也是本发明的保护范围。特别是在制备检测狂犬病毒的试剂盒中的应用。
上述的可以与狂犬病毒糖蛋白抗原特异性结合的单克隆抗体的获得方法如下：按照本领域已知的常规方法筛选本发明狂犬病毒特异性单克隆细胞株。具体来讲，本发明狂犬病毒的特异性单克隆抗体，可包括下述步骤：
1)利用中空纤维纯化方法获得灭活的狂犬病毒糖蛋白抗原，纯度不低于80％，作为免疫原使用；
2)用狂犬病毒灭活抗原作为免疫原免疫动物，连续免疫4次，每次间隔14天，前3次采用多点皮下免疫方式，第4次采取腹腔注射的免疫方式，每次1mg/只动物；
3)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞进行融合，用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞上清用间接ELISA方法进行筛选特异性阳性克隆；当被免疫动物的血清抗体水平用间接ELISA进行检测效价超过1:50000时，可分离动物的脾细胞并制备成单细胞悬液，并在适当的融合剂(如聚乙二醇)的诱导下与骨髓瘤细胞(优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合以形成杂交瘤，然后在HAT培养基中培养以筛选融合的杂交瘤细胞，并进一步可使用间接ELISA等方法鉴定所需的特异性单克隆抗体细胞株，经配对试验，优选分泌RV1的单克隆细胞株作为用于检测狂犬病毒糖蛋白抗原的单克隆细胞株。
7)特异性单克隆抗体的表达与纯化：从杂交瘤细胞株RV1的培养液或接种动物的腹水中分离并纯化的狂犬病毒特异性单克隆抗体RV1。
8)上述用于制备单克隆抗体的免疫动物可为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪等哺乳动物，优选地为小鼠。
本发明试剂盒的检测程序为：
1)平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。
2)配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
3)样品稀释：抗原标准品用样品稀释液进行1:20～1:1280倍系列稀释，对应抗原浓度分别为200mIU、100mIU、50mIU、25mIU、12.5mIU、6.2mIU，待测样品同样用样品稀释液进行4～8个梯度稀释。
4)加样：取出所需板条，剩余板条装入铝箔袋中封好，置于2～8℃保存备用。将稀释好的待检样品、系列稀释的抗原标准品加入到包被板中，100μl/孔，设1孔作为阴性质控，仅加入样品稀释液。加样过程时间跨度应尽量短。如图1所示加样：S1～S6：1:20～1:640倍比稀释抗原标准品，N：表示阴性质控孔，仅加入样品稀释液；T1：表示加各待检样品。
5)温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。
6)洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。
7)加酶：各孔加100μl酶标抗体。
8)温育：置37℃温箱，反应30min。
9)洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。
10)显色每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。
11)每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。
12)测定每孔的OD450nm值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值)。
13)结果分析：抗原标准品(200mIU)孔OD450nm值应≥1.5，否则无效；阴性质控孔OD450nm值应≤0.15，否则无效；浓度计算：根据抗原标准品各孔OD450nm值绘制标准曲线，计算各待测样品中狂犬病毒含量。
在上述检测方法中，待测样品的选择可以是多样的，可为疫苗生产过程中的培养液、灭活液、纯化液、浓缩液和破乳后的成品疫苗等。
步骤13)中的结果分析方法可为：以抗原标准品检测孔各稀释度OD450nm值和阴性质控孔OD450nm值作为X轴，以蛋白浓度为Y轴，采用EXCEL程序，→“***”→“散点图”，选择“带平滑线和数据标记的散点图”→“趋势线”→选中“多项式”→“显示公式”和“显示R平方值”。通常R2值≥0.98表明标准曲线可信(其中应舍弃OD过高或者过低的点)。每一块96孔板应设一组标准并绘制相应标准曲线。根据多项式公式，样品孔OD450nm值带入计算获得样品中抗原浓度。
本发明的积极效果在于：本发明提供了对狂犬病毒的定量检测的酶联免疫检测试剂盒，敏感性高、特异性好、且操作便捷，能够稳定地检测狂犬病毒糖蛋白抗原含量。该试剂盒是采用狂犬病毒的一株特异性单克隆抗体RV1制成的双抗体夹心法酶联免疫定量检测试剂盒，可通过检测酶催化底物产生的信号变化来定量检测样品中狂犬病毒糖蛋白抗原的含量。
综上所述，本试剂盒采用狂犬病毒的特异性单克隆抗体制成的双抗体夹心法酶联免疫定量检测试剂盒，灵敏度高、特异性强，可以有效地区分并检测样品中狂犬病毒糖蛋白抗原的含量。同时该操作方法可在1.5小时内完成最多检测除抗原标准品和阴性质控孔外的88份样品的检测，大大缩短了检测周期，且不需要昂贵的超速离心机，为疫苗生产中的质量控制提供了更为便捷有效的方法，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
附图说明
图1为本发明试剂盒酶联免疫板加样示意图。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和伦理道德可获取的生物材料都可按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、狂犬病毒单克隆抗体的特异性杂交瘤细胞株的筛选
包括以下步骤：
1)利用中空纤维法获得狂犬病毒灭活抗原(由中牧实业股份有限公司江西生物药厂提供)，纯度≥80％，作为免疫原使用；
2)免疫动物为BALB/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，连续免疫4次，每次间隔14天，前3次采用多点皮下免疫方式，第4次采取腹腔注射的免疫方式，每只小鼠注射1mg抗原；
3)末次免疫后7天，取小鼠尾血分离血清后，用间接ELISA进行检测，效价＞1:50000后，分离免疫动物的脾细胞，将其与生长状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，用HAT选择性培养基筛选获得杂交瘤细胞；
4)对杂交瘤细胞上清用间接ELISA方法进行筛选特异性阳性克隆，最终获得3个特异性阳性克隆；具体操作步骤：用狂犬病毒灭活抗原溶于pH 9.6的碳酸盐溶液稀释浓度至2μg/ml，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔100μl，2～8℃下放置8～12小时，使特异性单克隆抗体与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后用铝箔纸进行封袋，置2～8℃保存备用。
取细胞培养上清加入包被有病毒抗原的酶标板中，37℃反应30分钟，用洗涤液(含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，使用时用双蒸水稀释20倍。)洗板4次，拍干后，向每孔加入1:5000稀释的兔抗鼠IgG-HRP标记物(购自美国Sigma公司)，37℃反应30分钟，用洗涤液4次，拍干后，向每孔加入底物液A(为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液)和底物液B(为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液)各50μl底物工作液，37℃避光反应15分钟。向每孔加入50μl终止液(2mol/L的硫酸溶液)，振荡混匀终止反应。15分钟内测定每孔的OD450nm值。以吸光度值＞阴性对照(即洗板培养液)×2.1倍为阳性判定标准，测定细胞培养上清中特异性单克隆抗体效价，同时测定单克隆抗体洗板株是否与其他病毒存在交叉反应，最后获得2株特异性细胞克隆，他们只与狂犬病毒有强烈信号反应，而与阴性对照不反应，将这2株分别编号为RV1、RV2。
实施例2、狂犬病毒单克隆纯化抗体的配对试验
1)用狂犬病毒的特异性单克隆抗体制备包被板
将纯化后的特异性单克隆抗体用pH 9.6的碳酸盐溶液稀释成0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml的包被工作液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，100μl/孔，2～8℃下放置8～12小时，使特异性单克隆抗体与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后2～8℃密封保存。
2)制备辣根过氧化物酶标记的狂犬病毒特异性单克隆抗体
将狂犬病毒的特异性单克隆抗体用戊二醛氧化法与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，用pH7.4的PBS缓冲液充分透析，加等量的优质丙三醇，-20℃以下保存。具体步骤如下：
①将5mg HRP溶于0.2ml含有1.25％戊二醛的0.1mol/L pH值6.8的PBS缓冲液中，置室温偶联18个小时，充分透析出去多余戊二醛；
②加生理盐水至1ml，然后加入2.5mg纯化的狂犬病毒的特异性单克隆抗体及0.1mlpH值9.6的1mol/L碳酸盐缓冲液，置于2～8℃放置24小时；
③加入0.1ml 0.3mol/L的赖氨酸溶液，室温放置2小时；
④用pH7.4的PBS缓冲液充分透析，通过离心除去沉淀，上清即为酶结合物。用酶标记物稀释液按一定比例稀释后(1:1000、1:2000和1:4000倍稀释)即为酶标记物的工作液。
3)2个特异性抗体之间的配对试验采用棋盘滴定法来确定。
①加入抗原：将抗原用样品稀释液进行稀释，一份浓度为100mIU，一份浓度为10mIU，100μl/孔，37℃反应30分钟；
②加酶标单抗：连续洗板4次后，加入酶标单抗(RV1、RV2)，37℃反应30分钟；
③显色：连续洗板4次后，加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min；
④读数：每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。测定每孔的OD450nm值。用100mIU样品的OD450nm值(A)除以10mIU样品的OD450nm值(B)，A/B值越大，表明该配对单抗的检测灵敏度越高，结果如表1-表3所示，因此优选RV1同时作为捕获抗体和检测抗体进行检测，RV1作为捕获抗体可选择1μg/ml，RV1作为检测抗体可选择1:2000稀释。
表1以RV1作为捕获抗体的配对试验结果(A/B值)
Figure BDA0002646099300000091
表2以RV2作为捕获抗体的配对试验结果(A/B值)
Figure BDA0002646099300000092
实施例3、狂犬病毒单克隆抗体的传代培养与保存
杂交瘤细胞的传代培养包括以下步骤：
1)将上述筛选到的杂交瘤细胞RV1在含有10％胎牛血清的DMEM培养基(含有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中进行培养、传代；
2)培养至第10代后，杂交瘤细胞株仍然能够生长良好、稳定传代，且上清中的效价仍可达到1:50以上，结果表明获得了能够稳定传代并可持续稳定分泌抗狂犬病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
杂交瘤细胞的保存包括以下步骤：在杂交瘤细胞的传代培养中，由于在连续传代过程中可能会产生突变进而丧失分泌单克隆抗体的能力，此外也为了防止培养过程中可能发生的污染，因此必须保存一部分杂交瘤细胞；
1)去掉细胞培养皿中的培养液，加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基悬浮细胞；
2)1000r/min离心10分钟，弃去上清，细胞沉淀用细胞冻存液(二甲基亚砜：胎牛血清：DMEM＝1:3:6)悬浮细胞，浓度为5×105细胞/ml；
3)用台盼蓝进行细胞计数，活率应该在95％以上；
4)将细胞无菌分装至冻存管，1ml/管，4℃放置2小时，然后-20℃放置2小时，-80℃过夜，最后转入液氮中进行长期保存。
按上述方法制备获得的能持续、稳定分泌狂犬病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株名称为RV1。
实施例4、制备狂犬病毒特异性单克隆抗体
1)采用动物体进行单克隆抗体大量制备：选择成年BALB/c小鼠，腹腔接种免疫抑制剂可引起炎症反应的降值烷，0.5ml/只小鼠；
2)7～10日后腹腔接种杂交瘤细胞RV1，2×106～3×106个/只小鼠。间隔5日后，待腹部明显膨大，皮肤有紧张感即可用9号针头采集腹水；
3)将腹水离心(10,000r/min，离心30分钟)，以除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清；
4)将上清用15～30倍体积的pH7.4的PBS缓冲液稀释，用Protein A亲和层析柱进行纯化，用Na3PO4 pH值为7.0溶液平衡ProteinA预装柱，平衡3～5个柱体积，然后将上清结合ProteinA预装柱，样品结合完后用Glycine-HCL pH值为3.0洗脱液进行洗脱，即获得纯化的RV1。
实施例5、狂犬病毒特异性杂交瘤细胞株的基因测序、单克隆抗体重组表达***的建立及单克隆抗体的纯化
包括以下步骤：
1)特异性阳性克隆杂交瘤细胞株总RNA提取、反转录、PCR及序列测定：
①总RNA提取：取杂交瘤细胞悬液250μl，加入750μl的Trizol，上下颠倒混匀，加入200μl的氯仿，混匀，4℃12000rpm离心15min。吸取上清至新的1.5ml EP管中，加入600μl的异丙醇，混匀离心10min。将异丙醇弃去，用75％的DEPC乙醇洗涤，离心。将乙醇弃去，烘干，用20μl无RNA酶水溶解RNA。
②反转录：利用Invitrogen反转录试剂盒按说明书进行反转录，获得杂交瘤细胞的cDNA。
③PCR反应及其产物的克隆测序：针对重链和轻链可变区设计通用引物，序列信息如下：
表3重链及轻链可变区通用引物
名称 序列(5’-3’)
V<sub>H</sub>-1(正向) GTGAATTCATGCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG
V<sub>H</sub>-2(反向) ATGTCGACTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC
V<sub>L</sub>-1(正向) GTGAATTCATGGACATTGTGATGACCCAGTCTCC
V<sub>L</sub>-2(反向) CAGTCGACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC
利用扩增引物对目的片段进行扩增，扩增完后胶回收片段，然后连接载体进行序列测定，获取单克隆抗体重链和轻链可变区序列信息。
2)特异性单克隆抗体的基因序列的合成及重组表达***的建立
①基因序列的合成：根据已测得单抗RV1的重链和轻链可变区的序列，将鼠抗体重链和轻链恒定区的序列补充在可变区部分，然后送往上海捷瑞生物工程有限公司进行基因序列的合成，并进行昆虫细胞密码子优化，RV1重链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3(全长序列即为编码序列)所示，轻链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4(全长序列即为编码序列)所示。
②穿梭载体的构建：根据重链和轻链的序列信息以及pFastBacdual(购自ThermoFisher公司，货号10712024)载体序列信息，设计相应引物(序列见下表2)，扩增重链和轻链全长的片段，胶回收完后通过同源重组的方法连入pFastBacdual载体中，其中pFastBacdual载体含有两个启动子，即PH启动子和P10启动子，并且在PH启动子序列后面含有GP67信号肽序列信息，P10启动子序列后面含有HDM信号肽序列信息，连入载体后进行序列测定确保序列的准确性。
表4表达载体构建引物序列信息
名称 序列(5’-3’)
RV1-HF TCATACATCTACGCGGCCGCTAGCGACGTGCAGTTGCAG
RV1-HR TCCCCCATCTCCCGGTACCCTTTCCGGGGGA
RV1-LF CTGCCTTTGCGGCGGATGAATTCGACATCGTGATGACCCAGA
RV1-LR CTAGTACTTCTCGACAAGCTTGGAGCACTCGGTTGGA
③重组Bacmid的筛选与提取：将构建好的穿梭载体转化DH10Bac感受态，然后涂布三抗平板(卡那霉素、庆大霉素、四环霉素)，37℃培养箱培养48h后挑取白斑，利用M13引物进行鉴定，阳性克隆目的片段大小为4600bp，阴性克隆为300bp，选取完全无300bp条带的克隆摇菌，12h后采用异丙醇沉淀法进行Bacmid的提取，然后利用Nanodrop进行浓度测定。
④重组杆状病毒的拯救：转染前将密度为2×106的SF9细胞铺六孔板，重组Bacmid按5μg和2.5μg的量进行转染，转染试剂用量为8μl，转染后4～6h进行换液，28℃培养，72h后收获扩增P2代病毒，采用同样方法进行P3代病毒扩增。P4代病毒的扩增采取摇瓶扩增，病毒接种比例为1：100。
3)特异性单克隆抗体的表达与纯化：将P4代病毒按1:5的比例接种密度为2×106的Hi5细胞，28℃培养，48h后收获细胞，8000r/min离心1h取上清，然后用0.22μm滤膜过滤备用。用Na3PO4 pH值为7.0溶液平衡ProteinA预装柱，平衡3～5个柱体积，然后将细胞上清结合ProteinA预装柱，样品结合完后用Glycine-HCL pH值为3.0洗脱液进行洗脱，即获得纯化的狂犬病毒G蛋白特异性单克隆抗体RV1。用紫外分光光度计测定OD280nm值，用该OD280nm值除以经验系数1.48即为单克隆抗体的浓度，单位为mg/ml。结果显示，RV1分泌的单克隆抗体浓度为1.26mg/ml。
实施例6、制备狂犬病毒糖蛋白抗原定量检测酶联免疫试剂盒
1)用狂犬病毒特异性单克隆抗体制备抗原包被板
将实施例5获得的纯化后的特异性单克隆抗体用pH 9.6的碳酸盐溶液稀释1μg/ml的包被工作液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，100μl/孔，2～8℃下放置8～12小时，使特异性单克隆抗体与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后2～8℃密封保存。
2)制备辣根过氧化物酶标记的狂犬病毒特异性单克隆抗体
将实施例5制备的狂犬病毒的特异性单克隆抗体用戊二醛氧化法与辣根过氧化物酶(HRP)进行偶联，用pH7.4的PBS缓冲液充分透析，加等量的优质丙三醇，-20℃以下保存。具体步骤如下：
①将5mg HRP溶于0.2ml含有1.25％戊二醛的0.1mol/L pH值6.8的PBS缓冲液中，置室温偶联18个小时，充分透析出去多余戊二醛；
②加生理盐水至1ml，然后加入2.5mg纯化的狂犬病毒的特异性单克隆抗体及0.1mlpH值9.6的1mol/L碳酸盐缓冲液，置于2～8℃放置24小时；
③加入0.1ml 0.3mol/L的赖氨酸溶液，室温放置2小时；
④用pH7.4的PBS缓冲液充分透析，通过离心除去沉淀，上清即为酶结合物。用酶标记物稀释液按一定比例稀释后即为酶标记物的工作液。
3)制备狂犬病毒糖蛋白抗原标准品
为了方便结果分析，所述试剂盒还包括狂犬病毒糖蛋白抗原标准品，具体可为狂犬病毒疫苗厂生产的狂犬病毒糖蛋白抗原纯化液，纯度不低于80％，抗原含量为4IU分装成1.0ml/管，使用时用样品稀释液进行(1:20～1:640)倍比稀释，贴好标签，置于-20℃以下保存备用。
4)样品稀释液的制备为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，1瓶(24ml/瓶)。
5)底物液A的制备为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液(1瓶，12ml/瓶)
6)底物液B的制备为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液(1瓶，12ml/瓶)。
7)20倍浓缩洗涤液的制备为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(50ml/瓶，2瓶)。
8)终止液的制备2mol/L的硫酸溶液(1瓶，12ml/瓶)。
9)根据需要，试剂盒中还可以有样品稀释板(2块，96孔/块)，用于样品的稀释。
实施例7、狂犬病毒糖蛋白抗原定量检测酶联免疫试剂盒的使用方法
1)平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。
2)配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；
3)样品稀释：抗原标准品用样品稀释液进行1:20～1:640倍系列稀释，对应抗原浓度分别为200mIU、100mIU、50mIU、25mIU、12.5mIU、6.2mIU，待测样品同样用样品稀释液进行4～8个梯度稀释。
4)加样：取出所需板条，剩余板条装入铝箔袋中封好，置于2～8℃保存备用。将稀释好的待检样品、系列稀释的抗原标准品加入到包被板中，100μl/孔，设1孔作为阴性质控，仅加入样品稀释液。加样过程时间跨度应尽量短。如图1所示，加样：S1～S6：1:20～1:640倍比稀释抗原标准品，N：表示阴性质控孔，仅加入样品稀释液；T1：表示加各待检样品。
5)温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。
6)洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。
7)加酶：各孔加100μl酶标抗体。
8)温育：置37℃温箱，反应30min。
9)洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。
10)显色每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。
11)每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。
12)测定每孔的OD450nm值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值)。
13)结果分析：抗原标准品(200mIU)孔OD450nm值应≥1.5，否则无效；阴性质控孔OD450nm值应≤0.15，否则无效；浓度计算：根据抗原标准品各孔OD450nm值绘制标准曲线，计算各待测样品中狂犬病毒含量。
在上述检测方法中，待测样品的选择可以是多样的，可为疫苗生产过程中的培养液、灭活液、纯化液、浓缩液和破乳后的成品疫苗等。
步骤13)中的结果分析方法可为：以抗原标准品检测孔各稀释度OD450nm值和阴性质控孔OD450nm值作为X轴，以蛋白浓度为Y轴，采用EXCEL程序，→“***”→“散点图”，选择“带平滑线和数据标记的散点图”→“趋势线”→选中“多项式”→“显示公式”和“显示R平方值”。通常R2值≥0.98表明标准曲线可信(其中应舍弃OD过高或者过低的点)。每一块96孔板应设一组标准并绘制相应标准曲线。根据多项式公式，样品孔OD450nm值带入计算获得样品中抗原浓度。
以上检测过程约需1.5小时，一次实验最多可检测88份样品。
实施例8、灵敏度试验
选用3批试剂盒，用样品稀释液，100μl/孔，重复8孔，按照实施例6的试剂盒和实施例7的检测方法进行检测，计算其平均值(X)+3×标准差(SD)即为本试剂盒的检测灵敏度，以其中最大值作为本试剂盒的灵敏度。
表5灵敏度试验
试剂盒批次 平均值(X) 标准差(SD) X+3SD
1 0.75 0.38 1.89
2 1.59 0.46 2.97
3 1.61 0.49 3.08
经3次重复试验结果(表4)显示，本试剂盒的灵敏度为3.08mIU，但低于该灵敏度也可用本试剂盒检测出。
实施例9、特异性试验
选用BHK21细胞宿主蛋白、犬细小病毒抗原、犬瘟热抗原、犬腺病毒抗原和犬副流感抗原，用试剂盒中的样品稀释液进行稀释，按照实施例6的试剂盒和实施例7的检测方法进行检测，同时设置阴性质控孔(即仅加入样品稀释液)，检测结果显示，本试剂盒对以上病原均无非特异性反应，特异性100％。
实施例10、本发明试剂盒及其检测方法与小鼠NIH法方法的比较
为了验证本发明专利检测结果的准确性与便捷性，现与小鼠NIH法进行比较试验。用本发明专利试剂盒和小鼠NIH法同时检测3份狂犬病PV株样品。检测结果见表6所示，两种检测方法符合率较高。
表6本试剂盒与小鼠NIH法的比较试验结果
Figure BDA0002646099300000151
Figure BDA0002646099300000161
同时，在操作便捷性方面，本试剂盒整个操作仅需1.5小时，最多可检测88份样品，可将狂犬病疫苗的检定时间由28天缩短至1.5小时，以此缩短疫苗待检时间，提高疫苗的生产和销售效率,并最终替代NIH动物法。
<110> 中牧实业股份有限公司
<120> 检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
<130> WHOI201056
<170> Patent-In 3.5
<160> 4
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Lys
20 25 30
Tyr Asn Trp Trp Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Tyr Asn Tyr Pro Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Asn Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Ser Arg Thr Asn Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Asn Tyr Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Tyr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Gly Gly Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Asn Thr
85 90 95
His Tyr Ser Thr Gly Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 3
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacgtgcagt tgcaggagtc cggtcccgga ttggtgaagc catcccagtc cttgtccttg 60
acctgctccg tgactggcta ctccatcacc tccaagtaca actggtggtg gatcaggcag 120
ttccccggaa acaagttgga gtggatggga tacatctact acgacggtag ctacaactac 180
cctcctagct tgaagaaccg tatctccatc acccgcgaca ccagcaagaa ccagttcttc 240
ctcaacttga acagcgtgac caccgaggac accgctacct actactgcgc tcgcggcggt 300
agcagccgta ccaactgggg acagggaacc accttgaccg tcagctccac ccacacctgc 360
cctccatgcc ccgccccaga gttgctcggc ggcccatccg tcttcctgtt ccctccaaag 420
cctaaggaca ccctcatgat cagccgtacc ccagaggtca cctgcgtcgt cgtcgatgtg 480
tcccacgagg accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggtgtgga ggtgcacaac 540
gctaagacca agcctagaga ggagcagtac aacagcacct acagagtcgt gagcgtgctg 600
accgtgttgc accaggactg gctgaacgga aaggagtaca agtgcaaggt gagcaacaag 660
gctttgcccg ccccaatcga gaaaaccatc agcaaggcta agggtcagcc acgcgagcca 720
caggtgtaca ccttgcctcc tagccgcgac gagttgacca agaaccaggt ttccctcacc 780
tgcctcgtga agggtttcta ccctagcgac atcgctgtcg agtgggagag caacggccag 840
cctgagaaca actacaagac cacccctcct gtgctcgact ccgacgggtc gttcttcttg 900
tactccaagc tgaccgtaga taagtccaga tggcagcagg gtaacgtctt ctcttgtagc 960
gtcatgcacg aggctttgca caaccactac acccagaaga gcttgagctt gtcccccgga 1020
aag 1023
<210> 4
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacatcgtga tgacccagag cccatccagc ttggctatgt ccgtcggaca gaaggtcacc 60
atgtcctgca actactccca gtccctgttg tacagctcca accagaagta ctacctcgcc 120
tggtatcagc agaagccagg tcagtcccca aagttgctcg tgtacttcgc ctcgggtgga 180
gagagcggtg tgcccgacag attcatcggt tccggcagcg gaaccgactt caccttgacc 240
atcagcagcg tgcaggctga ggacctcgcc gactacttct gcaacaccca ctacagcacc 300
ggattgacct tcggcgctgg aaccaagctg gagttgaagg cccctagcgt caccttgttc 360
cctcctagct ccgaggagtt gcaggctaac aaggctacct tggtctgcct gatcagcgac 420
ttctaccccg gcgctgtgac cgtggcttgg aaggccgact ccagccctgt caaggccggc 480
gtcgagacca ccacccctag caagcagtcc aacaacaagt acgccgcttc ctcctacttg 540
agcctcaccc ctgagcagtg gaagagccac agatcctaca gctgccaggt gacccacgag 600
ggtagcaccg tcgaaaaaac cgtcgctcca accgagtgct cc 642

Claims (10)

1.一种特异性定量检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒，包括捕获抗体包被的酶联反应板和酶标记检测抗体；所述与狂犬病毒糖蛋白抗原特异性结合的单克隆抗体含有重链可变区RV1-VH和轻链可变区RV1-VL；所述RV1-VH和RV1-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述RV1-VH和所述RV1-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述RV1-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第31～36位氨基酸所示；所述RV1-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第51～66位氨基酸所示；所述RV1-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNo.1的第99～105位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24～40位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第56～62位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第95～103位氨基酸所示。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述RV1-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～116位所示；其RV1-VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1～113位所示。
3.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括抗原标准品，所述抗原标准品为狂犬病毒糖蛋白抗原。
4.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板的获得方法是将所述捕获抗体溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔50ng～1000ng捕获抗体，2～8℃下放置8～12小时，使捕获抗体与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
5.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括底物液A、底物液B和终止液；所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括样品稀释液和20倍浓缩洗涤液；样品稀释液为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；20倍浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。
7.权利要求1-6中任意一项所述的酶联免疫试剂盒在特异性定量检测狂犬病毒糖蛋白抗原中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，待测样品为疫苗生产过程中的培养液、灭活液、纯化液、浓缩液或破乳后的成品疫苗。
9.与狂犬病毒糖蛋白抗原特异性结合的单克隆抗体，含有重链可变区RV1-VH和轻链可变区RV1-VL；所述RV1-VH和RV1-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述RV1-VH和所述RV1-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述RV1-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNo.1的第31～36位氨基酸所示；所述RV1-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第51～66位氨基酸所示；所述RV1-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第99～105位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24～40位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第56～62位氨基酸所示；所述RV1-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第95～103位氨基酸所示；
优选的，所述RV1-VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～116位所示；其RV1-VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1～113位所示。
10.权利要求9所述的单克隆抗体在制备检测狂犬病毒糖蛋白抗原的试剂盒中的应用。
CN202010854943.6A 2020-08-24 2020-08-24 检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用 Active CN111999497B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010854943.6A CN111999497B (zh) 2020-08-24 2020-08-24 检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010854943.6A CN111999497B (zh) 2020-08-24 2020-08-24 检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111999497A true CN111999497A (zh) 2020-11-27
CN111999497B CN111999497B (zh) 2023-08-08

Family

ID=73474007

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010854943.6A Active CN111999497B (zh) 2020-08-24 2020-08-24 检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111999497B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112684185A (zh) * 2020-12-25 2021-04-20 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司 一种可溶性b7-h4定量检测试剂盒及其应用
CN113009139A (zh) * 2021-02-26 2021-06-22 中牧实业股份有限公司 检测猪伪狂犬病毒抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
CN114958774A (zh) * 2022-05-08 2022-08-30 中国医学科学院医学生物学研究所 抗狂犬病病毒单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011080765A2 (en) * 2010-01-04 2011-07-07 Indian Immunologicals Limited Recombinant human bivalent diabody against rabies virus and uses thereof
CN103848915A (zh) * 2012-12-03 2014-06-11 长春百克生物科技股份公司 新型抗狂犬病毒糖蛋白人源基因工程抗体的制备与应用
CN105481979A (zh) * 2016-01-07 2016-04-13 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体rv3a5及其应用
CN109580945A (zh) * 2018-12-11 2019-04-05 中牧实业股份有限公司 检测***o型广西株抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
CN109900902A (zh) * 2019-03-29 2019-06-18 中牧实业股份有限公司 一种猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011080765A2 (en) * 2010-01-04 2011-07-07 Indian Immunologicals Limited Recombinant human bivalent diabody against rabies virus and uses thereof
CN103848915A (zh) * 2012-12-03 2014-06-11 长春百克生物科技股份公司 新型抗狂犬病毒糖蛋白人源基因工程抗体的制备与应用
CN105481979A (zh) * 2016-01-07 2016-04-13 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体rv3a5及其应用
CN109580945A (zh) * 2018-12-11 2019-04-05 中牧实业股份有限公司 检测***o型广西株抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
CN109900902A (zh) * 2019-03-29 2019-06-18 中牧实业股份有限公司 一种猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
郑佳琳等: "狂犬病病毒糖蛋白抗原表位富集区单克隆抗体的制备", 《中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集》, pages 332 - 335 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112684185A (zh) * 2020-12-25 2021-04-20 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司 一种可溶性b7-h4定量检测试剂盒及其应用
CN112684185B (zh) * 2020-12-25 2024-01-12 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司 一种可溶性b7-h4定量检测试剂盒及其应用
CN113009139A (zh) * 2021-02-26 2021-06-22 中牧实业股份有限公司 检测猪伪狂犬病毒抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
CN113009139B (zh) * 2021-02-26 2022-07-29 中牧实业股份有限公司 检测猪伪狂犬病毒抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
CN114958774A (zh) * 2022-05-08 2022-08-30 中国医学科学院医学生物学研究所 抗狂犬病病毒单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用
CN114958774B (zh) * 2022-05-08 2023-10-27 中国医学科学院医学生物学研究所 抗狂犬病病毒单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111999497B (zh) 2023-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111153991A (zh) 一种人SARS-CoV-2单克隆抗体及其制备方法和应用
CN109900902B (zh) 一种猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
CN111848786B (zh) 一种单克隆抗体、其制备方法及用途
CN111999497B (zh) 检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
US10766949B2 (en) Method for preparing whole bovine-derived broadly neutralizing antibody against serotype O foot-and-mouth disease virus
CN113740536B (zh) 一种非洲猪瘟病毒p30阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
CN114874995B (zh) 猪瘟病毒2型Erns蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用
WO2012163263A1 (en) Reagents and methods for prrsv detection
CN115160411A (zh) 一种非洲猪瘟病毒优势抗原的筛选、制备及应用
CN109900903B (zh) 一种猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
CN108918869B (zh) fiber2蛋白及其重组蛋白在检测血清4型禽腺病毒抗体方面的应用
CN109580945B (zh) 检测***o型广西株抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
CN113687073B (zh) 一种非洲猪瘟病毒p54阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
KR101080071B1 (ko) 재조합 ｎ 단백질에 대한 단클론 항체를 이용한 리프트계곡열 경합적 효소결합면역측정법
CN109824775B (zh) ***a型武汉株单克隆抗体及其组合物与应用
CN113583118B (zh) 用于检测番鸭呼肠孤病毒的单链抗体、嵌合抗体和双夹心elisa检测试剂盒
CN113009139B (zh) 检测猪伪狂犬病毒抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
CN107098980A (zh) 一种检测风疹病毒抗体的融合蛋白及其制备方法
CN109613238B (zh) 检测***a型武汉株抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
CN107619435B (zh) 一种猪瘟病毒e2蛋白的抗原表位、抗体的制备及应用
CN116718765A (zh) 一种牛结节性皮肤病阻断elisa抗体检测试剂盒及其应用
Pasandideh et al. Production of monoclonal antibody against prokaryotically expressed G1 protein of bovine ephemeral fever virus
CN114230661B (zh) 一种用于番茄黄化斑驳相关病毒检测的抗体及其制备方法和应用
CN116790509B (zh) 一种分泌抗猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株及其应用
CN117866053B (zh) 同时检测多种猪细小病毒的多克隆抗体及其制备和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant