CN115806611A - 抗新型冠状病毒n蛋白的抗体及其应用 - Google Patents
抗新型冠状病毒n蛋白的抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及抗体技术领域,具体涉及抗新型冠状病毒N蛋白的抗体及其应用。本发明提供的针对新型冠状病毒N蛋白的抗体能够特异性地结合新型冠状病毒N蛋白抗原,对新型冠状病毒具有较高的亲和力,且能够高效结合不同新型冠状病毒突变株。利用该抗体可开发用于新型冠状病毒的免疫诊断试剂,能够不受病毒突变株抗原蛋白突变的影响,具有灵敏度高、特异性好的优势,有利于降低检测成本、缩短检测时间、提高检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域,尤其涉及抗新型冠状病毒N蛋白的抗体及其应用。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV,SARS-CoV-2)是冠状病毒β属成员,有包膜,其基因特征与SARS病毒(SARS-CoV)和MERS病毒(MERS-CoV)具有明显区别。SARS-CoV-2的包膜结构嵌合4种蛋白:刺突糖蛋白(S蛋白)、小包膜糖蛋白(E蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白)和血凝素糖蛋白(HE蛋白)。
新冠病毒属于RNA病毒,较DNA病毒更容易发生突变。新型冠状病毒在复制过程中,个别病毒中的某个或某些基因序列可能出现轻微的改变,基因序列的改变让病毒得以存活下来,并进行进一步的繁殖,进而形成了一个新的新型冠状病毒变异毒株。目前新型冠状病毒已出现Beta,Gamma,Delta,Omicron突变株。
免疫检测是新型冠状病毒重要的检测方法,利用抗原与抗体特异性结合的原理,对样品中是否存在新型冠状病毒及其含量水平进行检测。新型冠状病毒表面存在多种结构蛋白,包括众多抗原表位,以此来制备抗体检测抗原的存在,可直接证明样本中含有新型冠状病毒。抗体的亲和力和特异性是影响检测灵敏度和准确性的关键因素,因此,开发具有优异性能的抗新型冠状病毒抗体对于新型冠状病毒的检测和诊断具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供抗新型冠状病毒N蛋白的抗体及其应用。
具体地,本发明提供以下技术方案:
本发明提供新型冠状病毒抗体,所述抗体的重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示,轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.4-6所示。
以上所述的抗体能够特异性地结合新型冠状病毒及其N蛋白抗原,且对于不同新型冠状病毒突变株均具有较高的亲和力。
优选地,所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示或与如SEQ IDNO.7所示的氨基酸序列具有至少80%的相似性,轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或与如SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列具有至少80%的相似性。
在具有以上所述的重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3和轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的情况下,重链可变区的氨基酸序列为与如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%的序列相似性的氨基酸序列,且轻链可变区的氨基酸序列为与如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%的序列相似性的氨基酸序列对应的抗体或其抗原结合片段也在本发明的保护范围内。
在本发明的一些实施方式中,所述新型冠状病毒抗体为单克隆抗体。其中,单克隆抗体包括动物源抗体、嵌合抗体或人源化抗体等。
在本发明的一些实施方式中,所述抗体还包括重链恒定区。可选的重链类型包括IgG1型。
在本发明的一些实施方式中,所述抗体还包括重链恒定区,所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
在本发明的一些实施方式中,所述抗体还包括轻链恒定区,可选的轻链类型为κ链。
在本发明的一些实施方式中,所述抗体还包括轻链恒定区,所述抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在本发明的一些实施方式中提供一种新型冠状病毒抗体,其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示,轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在上述抗体的基础上,本发明提供以上所述的抗体的抗原结合片段。
抗原结合片段是指包含抗体轻链可变区和/或重链可变区的部分序列片段的多肽,其保持特异性结合新型冠状病毒的能力,或者可与全长抗体竞争对新型冠状病毒的特异性结合。
优选地,所述抗原结合片段为选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体中的任意一种。
本发明还提供包含所述新型冠状病毒抗体,或包含上述抗原结合片段的双特异性或多特异性抗体。
在上述抗体或抗体结合片段的基础上,本发明提供编码所述新型冠状病毒抗体或所述抗原结合片段的核酸分子。
根据以上所述的抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列和密码子规则,本领域技术人员能够获得编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列。由于密码子的简并性,编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列并不唯一,所有能够编码产生上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子均在本发明的保护范围内。
在本发明的一些实施方式中,编码重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示,编码轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明提供包含以上所述的核酸分子的生物材料,所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
以上所述的核酸分子与启动子和/或终止子可操作性地连接可得到表达盒。
以上所述的载体包括但不限于质粒载体、病毒载体等。
以上所述的宿主细胞包括微生物细胞或动物细胞。其中微生物细胞包括但不限于大肠杆菌、酵母等,动物细胞包括但不限于昆虫细胞、CHO细胞、293T细胞等。
本发明提供的抗体或抗原结合片段可采用本领域常规方法制备得到,包括:化学合成、宿主表达等。
在本发明的一些实施方式中,将编码所述抗体或抗原结合片段的核酸分子导入宿主细胞中,得到重组细胞,培养重组细胞,经分离、纯化得到所述抗体或抗原结合片段。
本发明还提供抗体偶联物,其为将所述新型冠状病毒抗体或所述抗原结合片段或所述双特异性抗体或多特异性抗体与标记物或蛋白偶联得到,所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、胶体金标记、放射性标记中的一种或多种。
本发明提供一种新型冠状病毒N蛋白表位肽,所述表位肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.14所示。
上述新型冠状病毒N蛋白表位肽位于新型冠状病毒N蛋白的103-155位,将其偶联载体蛋白后作为免疫原免疫动物,制备杂交瘤细胞,并筛选能够稳定分泌抗新型冠状病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株。
本发明提供所述新型冠状病毒N蛋白表位肽在制备新型冠状病毒抗体或多肽疫苗中的应用。
本发明提供含有所述新型冠状病毒N蛋白表位肽的多肽疫苗。
本发明提供一种抗体组合物,所述抗体组合物包含第一抗体和第二抗体,所述第一抗体为以上所述的新型冠状病毒抗体或其抗原结合片段,所述第二抗体的重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.15-17所示;轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.18-20所示。
优选地,所述第二抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示,轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示。
进一步优选地,所述第二抗体的重链全长的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示,轻链全长的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
基于本发明的抗体、抗原结合片段、表位肽的功能,本发明提供以上所述的新型冠状病毒抗体或所述抗原结合片段或所述双特异性或多特异性抗体或所述核酸分子或所述生物材料或所述抗体偶联物或所述新型冠状病毒N蛋白表位肽或所述抗体组合物的以下任一种应用:
(1)在制备用于检测新型冠状病毒或其N蛋白在样品中的存在或其水平的产品中的应用;
(2)在制备用于诊断新型冠状病毒感染或由新型冠状病毒感染导致疾病的产品中的应用;
(3)在非诊断和治疗目的的检测新型冠状病毒或其N蛋白在样品中的存在或其水平中的应用;
(4)在检测新型冠状病毒疫苗的抗原含量中的应用;
(5)在新型冠状病毒疫苗的质量控制中的应用;
(6)在制备用于预防或治疗新型冠状病毒感染或由新型冠状病毒感染导致的疾病的药物中的应用。
上述(1)、(2)所述的应用中,所述产品可为检测试剂或试剂盒。
上述(1)、(3)所述的应用中,所述样品可以是来自有生命的人或动物的样品(包括血液、***物、口鼻分泌物等),也可以是体外培养的细胞或细胞培养液等并非来自有生命的人或动物的样品。
上述(2)、(6)所述的应用中,由新型冠状病毒感染导致疾病包括新型冠状病毒肺炎等。
上述(5)所述的应用中,疫苗的质量控制包括检测疫苗中抗原质量、含量、稳定性等是否合格。
上述应用中,利用本发明提供的抗体或其抗原结合片段进行新型冠状病毒或其抗原、疫苗检测的方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等。
本发明提供一种产品,所述产品包含以上所述的新型冠状病毒抗体,或包含所述抗原结合片段,或包含所述双特异性或多特异性抗体,或包含所述抗体偶联物,或包含所述新型冠状病毒N蛋白表位肽,或包含所述抗体组合物;
所述产品为检测试剂或药物组合物。
本发明提供一种检测试剂,所述检测试剂包含以上所述的新型冠状病毒抗体,或包含所述抗原结合片段,或包含所述双特异性或多特异性抗体,或包含所述抗体偶联物。
以上所述的检测试剂可用于检测新型冠状病毒或其N蛋白在样品中的存在或其水平,或者用于诊断新型冠状病毒感染或由新型冠状病毒感染导致疾病,或者用于检测新型冠状病毒疫苗的免疫原性、新型冠状病毒疫苗的质量控制。
上述检测试剂除包含所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物外,还可包含携带可检测的标记的第二抗体以检测本发明的抗体或其抗原结合片段。其中,可检测的标记包括但不限于胶体金、酶、放射性同位素、荧光染料等。
上述检测试剂可为任意的免疫诊断试剂,包括但不限于酶联免疫检测试剂、化学发光检测试剂、侧向流免疫层析检测试剂、免疫荧光检测试剂等。
在本发明的一些实施方式中提供一种侧向流免疫层析检测试剂,所述检测试剂的检测线包被有以上所述的抗体或所述抗原结合片段。
具体地,所述检测试剂为检测卡或检测条,包括检测垫,所述检测垫上设置有检测线和质控线,所述检测线包被有所述抗体或其抗原结合片段(鼠源),所述质控线上包被有羊抗鼠IgG抗体。
所述检测试剂还包括结合垫,所述结合垫上喷涂有胶体金标记的抗新型冠状病毒N蛋白抗体。
所述检测试剂还包括样品垫和吸水垫。
所述检测试剂中,样品垫设置于底板上靠近检测垫的检测线一侧,结合垫交叠设置于样品垫与检测垫之间,吸水垫设置于底板上靠近检测垫的质控线一侧且与检测垫部分交叠。
本发明提供一种药物组合物,所述药物组合物包含以上所述的抗体或所述抗原结合片段,或包含所述双特异性抗体或多特异性抗体。
上述药物组合物除包含所述抗体或其抗原结合片段外,还可包含药学上可接受的载体、赋形剂或其他活性成分。
本发明的有益效果在于:本发明提供针对新型冠状病毒N蛋白的抗体,该抗体能够结合新型冠状病毒N蛋白抗原,对新型冠状病毒具有较高的亲和力,且能够高效结合不同新型冠状病毒突变株(Beta,Gamma,Delta,Omicron);该抗体与其它冠状病毒、RSV病毒等无交叉反应,具有较高的特异性。利用该抗体可开发侧向流免疫层析检测试剂等免疫诊断试剂,用于新型冠状病毒的检测,能够不受病毒突变株抗原蛋白突变的影响,具有灵敏度高、特异性好的优势,能够降低检测成本、缩短检测时间、提高检测效率,在免疫诊断领域具有广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中单克隆抗体的特异性检测结果,其中,1、流感A的NP蛋白;2、新冠N蛋白;3、流感B的NP蛋白;4、RSV病毒的F蛋白;5、上样buffer;6、空白。
图2为本发明实施例5中侧向流免疫层析检测试剂对灭活新冠病毒培养物的测试结果。
图3为本发明实施例5中侧向流免疫层析检测试剂对标准化重组新冠病毒N蛋白的测试结果。
图4为本发明实施例5中侧向流免疫层析检测试剂对新冠病毒不同突变株的N蛋白的测试结果。
图5为本发明实施例5中侧向流免疫层析检测试剂对临床样本的测试结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明中的附图,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1单克隆抗体的制备
1、新冠病毒N抗原的设计、制备及载体偶联
根据GenBank中的新冠病毒蛋白序列(登录号:YP_00972439)获得新冠病毒N蛋白序列(SEQ IDNO.13)。经过免疫原性、亲疏水性及表面可及性等分析,经筛选最终确定以N蛋白区的103-155序列为抗原(SEQ ID NO.14),该肽及C端偶联匙孔血蓝载体蛋白KLH的合成肽(COVID-N4-KLH)抗原由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2、免疫小鼠
将合成多肽蛋白COVID-N4-KLH与弗氏完全佐剂按1:1混匀500μL乳化后,皮下多点注射6-8周龄雌性Balb/c小鼠4只,每只小鼠抗原接种剂量为50μg,三周后抗原与弗氏不完全佐剂按1:1混匀500μL乳化后皮下多点注射,每只小鼠抗原接种剂量为50μg,间隔三周后以50μg不加佐剂的剂量进行腹腔注射,共免疫4次。
3、免疫血清效价测定
采用间接ELISA法测定免疫血清效价。取50μg合成肽COVID-N4-KLH溶解于10mL0.05M pH 9.6磷酸盐缓冲液,包被聚苯乙烯96孔板,100μL/孔,4℃过夜。使用PBS(含有0.05%(V/V)Tween-20)洗板三次,用10mM PBS含1%BSA封闭液100μL/孔,37℃封闭2h,用PBS(含有0.05%(V/V)Tween-20)洗板三次,第三次免疫后10天小鼠尾静脉采血,鼠免疫血清用含1%BSA 10mM PBS进行10-2~10-8倍稀释,加入96孔板,100μL/孔,37℃、1h,以PBS(含有0.05%(V/V)Tween-20)洗板三次后,加入1:10000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma,INC.),100μL/孔,37℃、30min,同上洗板后,TMB显色,100μL/孔,室温避光10min,加50μL/孔2M H2SO4终止反应,测450nm吸收值,以免疫前小鼠血清作为阴性对照,以测定值与对照值之比≥2.1为阳性判断值来确定免疫血清效价,结果如表1所示。
表1
稀释倍数 | 免疫小鼠1 | 免疫小鼠2 | 免疫小鼠3 | 免疫小鼠4 |
10000 | 2.51 | 2.50 | 2.67 | 2.55 |
50000 | 1.63 | 1.60 | 1.66 | 1.71 |
100000 | 1.13 | 0.90 | 0.95 | 1.03 |
500000 | 0.55 | 0.54 | 0.58 | 0.62 |
1000000 | 0.19 | 0.11 | 0.16 | 0.17 |
4、杂交瘤的制备
取稀释106后的血清效价高于0.15的小鼠,融合前3天,取合成肽COVID-N4-KLH与等体积的PBS混匀后,以每只50μg/500μL的剂量腹腔注射BALB/c待融合小鼠进行加强免疫。无菌取小鼠脾脏,制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0按1:1的比例混合,1000g室温离心5min,弃上清,用手指轻弹离心管底部,使沉淀松散,离心管置于37℃水浴中,将在37℃水浴保温的50%聚乙二醇(PEG,MW4000,Sigma)用滴管一滴滴加入离心管中,边滴边摇动离心管,1min内滴完,滴完后静置2min,每隔1min加入37℃预热的无血清1640培养基1mL、2mL、3mL、4mL、5mL和10mL来终止聚乙二醇的作用,细胞混合物1000g室温离心5min,弃上清,加入HAT培养液(次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)(HAT,Sigma))轻轻重悬细胞,将细胞分至96孔板中,每孔200μL。培养三天后,观察细胞融合情况,更换一半HAT培养液,连续数日,直至有克隆形成,融合后七天更换HT培养液(次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T)(HT,Sigma))培养。
5、筛选分泌抗新冠病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞
间接ELISA法筛选细胞培养上清,选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化,并用有限稀释法连续克隆化2-3次,直至到100%细胞阳性率。对于最终得到的5株效价格较高的杂交瘤细胞株培养上清进行间接ELISA方法检测,同时采用0.02M PBS进行稀释检测,结果如表2所示。
表2
最后获得稳定分泌抗新冠病毒N蛋白单克隆抗体细胞株,标记为F7A1。将克隆化后阳性率达100%的细胞扩增培养后液氮冻存。
6、腹水的制备和纯化
将杂交瘤细胞株F7A1以1×106/只的剂量注入液体石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔,饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein G Sepharose Fast Flow纯化单克隆抗体,以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度,纯度达到90%以上。
实施例2单克隆抗体的特性鉴定
1、抗体浓度的测定:经杂交瘤细胞F7A1制备的腹水经纯化后获得抗新冠病毒N蛋白单克隆抗体F7A1,使用Thermofisher公司生产的Nanodrop核酸蛋白测定仪测定,其浓度为3.8mg/mL。
2、抗体亚型鉴定:采用Thermofisher的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的亚型,F7A1分泌抗体的亚型为IgG1型,轻链为κ链。
3、纯化抗体的效价鉴定:将50μg合成新冠病毒标准株N蛋白肽(登录号为YP_00972439)溶于10mL pH 9.6的0.05M碳酸盐包被缓冲液中,加入96孔板,每孔100μL,4℃过夜。PBS(含有0.05%(V/V)Tween-20)洗板三次,用10mM PBS含1%BSA封闭液150μL/孔,37℃封闭2h,使用PBS(含有0.05%(V/V)Tween-20)洗板三次,每孔加入100μL纯化抗体,37℃孵育1h,PBS(含有0.05%(V/V)Tween-20)洗板三次,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体为二抗,37℃孵育30min,PBS(含有0.05%(V/V)Tween-20)洗板三次,每孔加入100μL,TMB显色,37℃孵育15min后,加入2M H2SO4溶液终止反应,酶标仪在吸光度值450nm处检测。多次结果显示抗体F7A1的效价在1×106。
4、亲和力测试:
用1×CB将新冠病毒重组表达新冠病毒标准株重组表达N抗原蛋白分别稀释到0.5μg/mL、1μg/mL,以100μL/孔的量加入酶标板孔中,并做复孔,置4℃过夜或37℃吸附2小时。将包被好的微孔板甩干,按照洗板机设定的操作程序(AFP程序)清洗一遍,按200μL/孔的量加入封闭液,置于37℃温箱中2h,之后置于4℃过夜。临用前,将封闭好的微孔板从4℃取出,甩干,加入清洗液(1×PBS-T)使酶标版湿润;将单克隆抗体用1×PBS预稀释至30μg/mL,并记录预稀释的倍数m,以稀释10倍即3μg/mL作为(S1)最高浓度,然后再以1:3梯度稀释(在96深孔板中稀释),一共8个稀释梯度(S1-S8)。
将100μL稀释好的单克隆抗体,加入在吸水纸上拍干净的96孔微孔板,37℃孵育30min;
孵育后将酶标板甩干,在吸水纸上拍干,用洗板机清洗酶标板3次,1-4列每孔加入100μL的1×PBS;5列与6列每孔,加入200μL尿素处理液,37℃孵育30min;孵育后将酶标板甩干,在吸水纸上拍干,用洗板机清洗酶标板3次,每孔加入100μL预先用二抗稀释液稀释10000倍的羊抗鼠-HRP酶标二抗,37℃孵育30min;孵育后将酶标板甩干,在吸水纸上拍干,用洗板机清洗酶标板3次,取TMB显色液,每孔加入100μL显色液,37℃孵育5-10min;显色后每孔加入50μL终止液。在酶标仪上设置进行450nm/630nm读值。多次结果显示抗体F7A1的亲和力在2.55×108。
5、特异性检测:通过Western blot方式对单克隆抗体的特异性进行检测,使用的抗原分别为流感病毒A的NP重组蛋白,流感病毒B的NP重组蛋白,RSV病毒的F蛋白以及新型冠状病毒的N蛋白。上述蛋白用上样缓冲液稀释后,经SDS-PAGE后用Bio-Rad电转移装置将蛋白转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭1h,pH7.4的Tris-HCl缓冲液(含有0.1%(V/V)Tween-20)洗膜3次,每次5min,1:1000加入经纯化的杂交瘤细胞F7A1制备的抗新冠病毒单克隆抗体,4℃孵育过夜,pH 7.4的Tris-HCl缓冲液(含有0.1%(V/V)Tween-20)洗膜3次,每次5min,加入1:10000稀释的羊抗鼠IgG多克隆抗体(Sigma)为二抗,室温孵育2h,TBST洗膜3次,用滤纸吸去多余的溶液,平铺于干净的保鲜纸上,加入1.4mL Pierce-ThermoScientific ECL系列Western化学发光底物反应液(A:B=1:1),使膜完全浸润于反应液中,迅速取出,用滤纸吸去多余液体,铺于另一张保鲜纸上,用保鲜纸把膜包好,放入X射线摄影暗盒,在暗房中显影。结果如图1所示,杂交瘤细胞F7A1制备的抗新冠病毒单克隆抗体仅与新型冠状病毒N蛋白发生特异性反应,出现单一的特异性条带。
实施例3单克隆抗体的序列测定
取纯化后的杂交瘤细胞F7A1制备的抗新冠病毒N蛋白的单克隆抗体共5mg,由艾柏森生物科技有限公司进行抗体轻链可变区与重链可变区的测序,上述新冠病毒N蛋白单克隆抗体的重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示;轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示。重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示,轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示,重链全长的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示,轻链全长的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。具有单克隆抗体相应可变区序列的抗体亲和力高,特异性好,因此相应的抗体可变区域可以用于重组抗体、单链抗体、双特异性抗体的开发,用于诊断用途的相关产品(酶联免疫、化学发光、侧向流免疫层析、免疫荧光检测等免疫诊断试剂)或者治疗用途的相关产品开发。
实施例4利用单克隆抗体开发侧向流免疫层析检测试剂
1、胶体金的制备:
采用还原法制备,制金条件为1/万氯金酸100mL+1.6mL 1%柠檬酸三钠。
2、抗体配对优选实验:将挑选的抗体H2B4、F7A1、G4D8、E9C2、D7F1、F5H2、E7G6、C8A6、C2F3分别进行酶标记。另外用1×CB将重组新冠病毒N抗原分别稀释到0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL四个浓度,每个样本复孔检测,每孔加入100μL样本。结果如表3所示。
表3
根据上述结果,选择线性关系最优的抗体C2F3作为标记单抗使用。单克隆抗体C2F3的重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.15-17所示;轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.18-20所示。重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示,轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示,重链全长的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示,轻链全长的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
3、胶体金标记鼠抗新冠病毒N蛋白单克隆抗体
物理吸附法,通过调节pH使胶体金与抗体结合起来。具体标记条件为:pH 8.0的条件下,每毫升胶体金加入0.1M碳酸钾溶液20μL,小鼠抗新冠病毒N蛋白单抗C2F3标记浓度为20μg/mL。
4、检测线
取适当浓度(0.1-3.0mg/mL)的小鼠抗新冠病毒N蛋白单克隆抗体F7A1包被在硝酸纤维素膜上制备检测线。喷点量为0.2-1.8μL/mm,37℃干燥。
5、质控线
取0.5-2.0mg/mL山羊抗小鼠IgG多克隆抗体,在纤维膜上制备质控线,喷点量为0.1-1.5μL/mm,37℃干燥。
6、侧向流免疫层析检测试剂的检测方法
将检测卡(检测条)、样本稀释液和样本恢复至18~30℃。检测卡或检测条的检测方法如下:
(1)从铝箔袋中取出检测卡或检测条,做好样本标记,放在水平工作台面上平置;
(2)取20μL鼻咽或口咽拭子样本提取液直接加入到加样孔中(检测卡)或指示箭头下端的加样处(检测条);
(3)再加入100μL(2~3滴)样本稀释液;
(4)15~20分钟内判读结果,20分钟后检验结果无效。
7、检验结果的解释
(1)检测线阳性:检测线和质控线显色,提示样本检出新型冠状病毒(2019-nCoV)I抗原,可能处于早期感染或现症感染,需结合临床症状进行最终的确认。
(2)阴性:检测窗仅出现一条红色质控线,表示样本未检出新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原。
(3)无效:检测窗无红色质控线出现。
实施例5新冠病毒抗原侧向流免疫层析检测试剂的性能测试
1、灵敏度测试
(1)灭活新冠病毒培养物测试
使用利用单克隆抗体开发的侧向流免疫层析快检试剂(制备方法见实施例4)检测灭活新冠病毒(标准株)培养物,结果如图2所示,最低可测试到低至10TCID50/mL的病毒培养物。
(2)标准化重组新冠病毒N蛋白测试
采用中国计量科学研究院制备的新型冠状病毒核衣壳蛋白溶液标准物质(标准物质编号:GBW(E)091097)对利用单克隆抗体开发的侧向流免疫层析快检试剂(制备方法见实施例4)进行检测。结果如图3所示,该试剂可检出最低达10pg/mL的标准重组新冠病毒N蛋白。
2、特异性测试
(1)重组新冠变异病毒株N蛋白测试
利用基因工程技术获得来自于新冠病毒不同突变株(Beta,Gamma,Delta,Omicron)的N蛋白,随后采用利用单克隆抗体开发的侧向流免疫层析快检试剂(制备方法见实施例4)进行检测。结果如图4所示,检测试剂可检出不同突变株的重组N蛋白。
(2)临床样本测试
使用利用单克隆抗体开发的侧向流免疫层析快检试剂(制备方法见实施例4)检测100例正常人的鼻拭子样本,结果显示,检测结果清晰可见,背景干净,表明该产品特异性良好,部分检测结果如图5所示。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.新型冠状病毒抗体,其特征在于,所述抗体的重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示,轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.4-6所示。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗体,其特征在于,所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示或与如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列具有至少80%的相似性,轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或与如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列具有至少80%的相似性。
3.权利要求1或2所述的新型冠状病毒抗体的抗原结合片段;
优选地,所述抗原结合片段为选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体中的任意一种。
4.双特异性或多特异性抗体,其特征在于,所述双特异性或多特异性抗体包含权利要求1或2所述的新型冠状病毒抗体,或包含权利要求3所述的抗原结合片段。
5.核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码权利要求1或2所述的新型冠状病毒抗体,或编码权利要求3所述的抗原结合片段;
优选地,编码重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,编码轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
6.生物材料,其特征在于,所述生物材料包含权利要求5所述的核酸分子,所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
7.抗体偶联物,其特征在于,其为将权利要求1或2所述的新型冠状病毒抗体或权利要求3所述的抗原结合片段或权利要求4所述的双特异性或多特异性抗体与标记物或蛋白偶联得到,所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、胶体金标记、放射性标记中的一种或多种。
8.新型冠状病毒N蛋白表位肽,其特征在于,所述表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
9.权利要求1或2所述的新型冠状病毒抗体或权利要求3所述的抗原结合片段或权利要求4所述的双特异性或多特异性抗体或权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的生物材料或权利要求7所述的抗体偶联物或权利要求8所述的新型冠状病毒N蛋白表位肽的以下任一种应用:
(1)在制备用于检测新型冠状病毒或其N蛋白在样品中的存在或其水平的产品中的应用;
(2)在制备用于诊断新型冠状病毒感染或由新型冠状病毒感染导致疾病的产品中的应用;
(3)在非诊断和治疗目的的检测新型冠状病毒或其N蛋白在样品中的存在或其水平中的应用;
(4)在检测新型冠状病毒疫苗的抗原含量中的应用;
(5)在新型冠状病毒疫苗的质量控制中的应用;
(6)在制备用于预防或治疗新型冠状病毒感染或由新型冠状病毒感染导致的疾病的药物中的应用。
10.一种产品,其特征在于,所述产品包含权利要求1或2所述的新型冠状病毒抗体,或包含权利要求3所述的抗原结合片段,或包含权利要求4所述的双特异性或多特异性抗体,或包含权利要求7所述的抗体偶联物,或包含权利要求8所述的新型冠状病毒N蛋白表位肽;
所述产品为检测试剂或药物组合物;
优选地,所述检测试剂为侧向流免疫层析检测试剂,所述检测试剂的检测线包被有权利要求1或2所述的新型冠状病毒抗体或权利要求3所述的抗原结合片段。
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