CN113249333B - 一种分泌抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株rsvn4c3 - Google Patents

一种分泌抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株rsvn4c3 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分泌抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株RSVN4C3，在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO:C2020254，所述的杂交瘤细胞株RSVN4C3分泌的抗呼吸道合胞病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体用于制备检测或诊断呼吸道合胞病毒感染的试剂盒，试剂盒可以是免疫胶体金试纸条或ELISA试剂盒，本发明提供的杂交瘤细胞株RSVN4C3可稳定分泌抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体(MAb)，对单克隆抗体(MAb)的反应性与特异性进行了鉴定，为今后RSV病毒感染的诊断、感染机制的研究奠定了基础。

Description

一种分泌抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株 RSVN4C3
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是涉及一种分泌抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株RSVN4C3。
背景技术
人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,RSV)是世界范围内引起急性下呼吸道感染(ALRI)的主要病因，可导致5岁以下儿童和免疫功能低下的成年人住院治疗。RSV感染与发达国家和发展中国家儿童急性下呼吸道感染 (ALRIs)的高发病率和死亡率有关。在发达国家，它是婴儿出生一个月，引起婴儿住院的主要原因；而在发展中国家，RSV是婴儿死亡的主要原因，每年约有 3400万5岁以下儿童发展为严重的RSV疾病，其中350万儿童需要住院治疗， 6.6万至19.9万人死亡，其中99％发生在发展中国家。尽管RSV造成了巨大的疾病负担，但目前还没有获得许可的疫苗上市，世界卫生组织已将研制RSV疫苗列为全球疫苗计划的优先发展计划之一。
RSV为非节段性、单股负链RNA病毒,隶属于副粘病毒科、肺病毒属。RSV 基因组长度约为15.2kb，能编码11种蛋白:NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、 M2-1、M2-2和L10。在RSV基因组编码的所有蛋白中,核蛋白(N蛋白)无论是在 A、B亚型之间还是在同一亚型内部，都是保守性最高的蛋白。国内外许多研究报道都将N蛋白基因作为分子生物学检测的靶基因。N蛋白是RSV中RNA依赖的RNA聚合酶复合物的重要组成部分，并且N蛋白同时是细胞毒T细胞识别的重要抗原之一。因此，N基因及其编码蛋白的研究对于进一步研究RSV的致病机理和免疫机制、RSV快速诊断试剂的研制都具有重要意义。但目前国内对N 蛋白研究很少。
发明内容
针对上述存在的技术问题，本发明提供了一种分泌抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株RSVN4C3。
本发明的技术方案是：
一种杂交瘤细胞株RSVN4C3，在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO:C2020254。
进一步地，所述的杂交瘤细胞株RSVN4C3的制备方法为：
S1、取RSV贵州2017年分离毒株B133株Hep-2细胞培养上清，提取RSV 的总RNA；反转录合成cDNA第一链，以其为模板，设计特异性引物，序列如下：
P1：5′-AATGGATCCATGGCTCTTAGCAAAGTC-3′(下划线部分为BamHI 酶切位点)，
P2：5′-ATTGTCGACAAGCTCTACATCATTATC-3′(下划线部分为Sall酶切位点)，
S2、以P1、P2为引物，采用PCR扩增RSV N基因片段，反应条件为：94℃ 30s；52℃30s，72℃延伸1min，共35个循环；获得908bp的PCR扩增产物，用 BamHI和Sall分别双酶切PCR产物和pQE30表达载体，回收目的基因片段和载体片段；
S3、用T4 DNA连接酶连接目的基因片段和载体片段，连接产物转化感受态大肠杆菌XL1-blue，涂LB氨苄青霉素平板，37℃静止培养过夜，次日分别挑取单菌落，接种于3mlLB培养液中，37℃振荡培养16h，提取质粒，双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳分析，阳性质粒进行基因测序；
S4、测序正确的重组表达质粒转化大肠杆菌XL1-blue菌，接种于含100μg /ml氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中管中，37℃振荡培养过夜；按1％接种量分别接种于含100μg/mlAmp的5ml LB细菌培养基中管和200ml LB培养基三角瓶中扩大培养，37℃振荡培养至菌液A600值约为0.6时，加入终浓度为 100μg/ml的IPTG，37℃振荡培养诱导4h；收集菌体经超声破碎，离心，取上清，用Ni2+亲和层析柱进行纯化；纯化表达产物经进行12％SDS-PAGE及Western blot鉴定分析，得到纯化后的重组RSV核蛋白；
S5、用纯化后的重组RSV核蛋白免疫BALA/C小鼠，按每只每次小鼠100微克的剂量免疫，首次免疫使用弗氏完全佐剂乳化，二次免疫和三次免疫使用不完全佐剂乳化，免疫间隔时间为两周，三次免疫7d后经小鼠尾部采血测血清抗体效价，融合前3d加强免疫一次，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0按照常规方法进行细胞融合，HAT选择培养基筛选培养融合杂交瘤细胞；
S6、生长的杂交瘤细胞经间接ELISA法、间接免疫荧光法及western-blot 法检测杂交瘤细胞上清，筛选分泌抗呼吸道合胞病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明还提供了一种杂交瘤细胞株RSVN4C3在制备检测或诊断呼吸道合胞病毒感染试剂中的应用。
进一步地，所述杂交瘤细胞株RSVN4C3分泌的抗呼吸道合胞病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体与RSV N蛋白发生抗原抗体反应，属IgG型抗体。所述杂交瘤细胞株RSVN4C3分泌的抗呼吸道合胞病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体与RSV N 蛋白发生抗原抗体反应，属IgG型抗体。
本发明还提供了间接免疫荧光法检测呼吸道合胞病毒抗原及胶体金法检测呼吸道合胞病毒抗原以诊断呼吸道合胞病毒感染的试剂盒，ELISA法检测呼吸道合胞病毒抗原以诊断呼吸道合胞病毒感染的试剂盒及IgM捕获法检测病人血清呼吸道合胞病毒特异性IgM抗体以诊断呼吸道合胞病毒感染的方法。该4种方法及试剂盒包含所述杂交瘤细胞株RSVN4C3分泌的抗呼吸道合胞病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体。
可以选择地，所述试剂盒为免疫胶体金试纸条。
更进一步地，所述试纸条按照连接顺序依次包括样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述硝酸纤维素膜与胶体金垫之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与吸水纸之间有搭接，所述胶体金垫是由吸附有胶体金标记的抗RSVN4C3单克隆抗体的玻璃纤维素膜组成，所述硝酸纤维素膜上具有山羊抗鼠IgG多克隆抗体包被的质控线，以及抗RSV N蛋白单克隆抗体包被的检测线。
更进一步地，所述质控线是通过将山羊抗鼠IgG多克隆抗体以0.8mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上得到的；所述检测线是通过将抗RSV N蛋白单克隆抗体以0.5mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上得到的。
更进一步地，所述检测线和质控线间隔0.5cm。
更进一步地，上述免疫胶体金试纸条用于人呼吸道合胞病毒检测的检测方法为：
S1、在点样孔滴加测试样品200μL，反应10-15min观察结果；
S2、结果判定：
质控线和检测线都出现红色条带，则为阳性；
仅在质控线出现现一条红色条带，则为阴性；
若质控线无条带出现，不论检测线是否出现红色条带结果均判定为无效。
还可以选择地，所述检测或诊断呼吸道合胞病毒的试剂盒为ELISA试剂盒。
本发明的有益效果是：本发明克隆了RSV N蛋白全长基因，在大肠杆菌中表达重组N蛋白，并进行纯化，及用纯化的重组核蛋白免疫BALB/C小鼠，以免疫鼠脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合，筛选出分泌抗呼吸道合胞病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该交瘤细胞株可稳定分泌抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体(MAb)，对单克隆抗体(MAb)的反应性与特异性进行了鉴定，为今后RSV病毒感染的诊断、感染机制及疫苗开发的研究奠定了基础。
附图说明
图1是在大肠杆菌中表达、纯化的重组RSV核衣壳蛋白的SDS-PAGE分析图。
图2是杂交瘤细胞株RSVN4C3分泌的单克隆抗体与大肠杆菌中表达纯化的重组RSV核衣壳蛋白的Western blot反应结果图。
图3是杂交瘤细胞株RSVN4C3分泌的单克隆抗体特异性识别RSV感染 Hep-2细胞的免疫荧光结果图。其中，A：正常未感染Hep-2细胞；B:RSV感染 Hep-2细胞。
图4是胶体金标记RSVN4C3单克隆抗体制备的抗原检测诊断试剂的特异性试验结果。
图5是RSVN4C3单克隆抗体胶体金抗原检测试剂灵敏度试验结果。
具体实施方式
实施例1
一种分泌抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株RSVN4C3，在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，地址是中国武汉，保藏日期是2020年12 月1日，其保藏编号为CCTCC NO:C2020254。
该杂交瘤细胞株RSVN4C3的制备方法为：
材料与方法
取RSV贵州2017年分离毒株B133株Hep-2细胞培养上清，按Trizol试剂说明书提取RSV的总RNA，反转录合成cDNA第一链，以其为模板，设计特异性引物，序列如下：
P1：5′-AATGGATCCATGGCTCTTAGCAAAGTC-3′(下划线部分为BamHI 酶切位点)，
P2：5′-ATTGTCGACAAGCTCTACATCATTATC-3′(下划线部分为Sall酶切位点)；
以P1、P2为引物，PCR扩增RSV N基因片段，反应条件为：94℃30s；52℃ 30s，72℃延伸1min，共35个循环；获得908bp的PCR扩增产物，用BamHI 和SalI分别双酶切PCR产物和pQE30表达载体，回收目的基因片段和载体片段；
用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化感受态大肠杆菌XL1-blue，涂LB氨苄青霉素平板，37℃静止培养过夜，次日分别挑取单菌落，接种于3ml LB培养液中，37℃振荡培养16h，提取质粒，双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳分析，阳性质粒进行基因测序；
测序正确的重组表达质粒转化大肠杆菌XL1-blue菌，接种于含100μg/ml 氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中管中，37℃振荡培养过夜；按1％接种量分别接种于含100μg/mlAmp的5ml LB细菌培养基中管和200ml LB培养基三角瓶中扩大培养，37℃振荡培养至菌液A600值约为0.6时，加入终浓度为100μg /ml的IPTG，37℃振荡培养诱导4h；收集菌体经超声破碎，离心，取上清，用 Ni2+亲和层析柱进行纯化，纯化表达产物经进行12％SDS-PAGE及Western blot 鉴定分析。
重组RSV-N蛋白的表达及鉴定
将RSV-N基因扩增并克隆岛表达载体pQE-30，重组质粒在大肠杆菌表达出 RSV-N蛋白产物经12％SDS-PAGE分析，可见相对分子量约30kD的特异蛋白条带，大小与预期相符。Western blot分析显示，纯化表达重组蛋白与鼠抗RSV-N 单抗发生特异性反应，证实表达蛋白为RSV-N蛋白。见图1、2。
杂交瘤细胞株的建立与鉴定
用纯化重组RSV核衣壳蛋白免疫BAL A/C小鼠，取免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经HAT选择培养筛选杂交瘤细胞。
使用间接免疫荧光及间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，3次有限稀释法亚克隆后，获得1株稳定分泌抗RSV-N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为 RSVN-4C3。
本株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与未感染Hep-2细胞无反应，与RSV感染Hep-2细胞反应，在细胞浆呈现特异性免疫荧光(图3，其中，A：正常未感染Hep-2细胞；B:RSV感染Hep-2细胞)。
间接免疫荧光法特异性鉴定显示本株单抗均只与RSV感染细胞反应，与流感病毒(H1N1，PR8株)，EV71病毒及柯萨基病毒(CA16)感染细胞均无反应。
RSVN4C3杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，制备腹水的单抗效价，以包被重组核蛋白的间接ELISA法测定，RSVN4C3腹水抗体的效价为1:1，000，000；间接免疫荧光法测定，RSVNC3的效价为1:100000；均明显高于免疫血清的效价。
经单抗亚类的鉴定，RSVN4C3单抗重链均为IgG1，轻链均为κ链。
本单抗识别RSV核衣壳蛋白，识别氨基酸序列为：
MALSKVKLNDTLNKDQLLSSSKYTIQRSTGDSIDTPNYDVQKHINKLCGMLLI TEDANHKFTGLIGMLYAMSRLGREDTIKILKDAGYHVKANGVDVTTHRQDIN GKEMKFEVLTLASLTTEIQINIEIESRKSYKKMLKEMGEVAPEYRHDSPDCGM IILCIAALVITKLAAGDRSGLTAVIRRANNVLKNEMKRYKGLLPKDIANSFYE VFEKYPHFIDVFVHFGIAQSSTRGGSRVEGIFAGLFMNAYGAGQVMLRWGVL AKSVKNIMLGHASVQAEMEQVVEVYEYAQKLGGEAGFYHILNNPKASLLSL TQFPHFSSVVLGNAAGLGIMGEYRGTPRNQDLYDAAKAYAEQLKENGVINYSVLDLTAEELEAIKHQLNPKDNDVEL
实施例2
使用杂交瘤细胞株RSVN4C3分泌的抗呼吸道合胞病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体，用间接免疫荧光法，检测临床呼吸道合胞病毒感染。
取下呼吸道感染患者鼻咽分泌物或鼻咽洗液样本，用生理盐水稀释，2000 转/分钟离心5分钟收集鼻咽脱落细胞，100微升生理盐水悬浮脱落细胞后，滴细胞到载玻片上，吹干后丙酮固定细胞。加入1:10000稀释的RSVN4C3单克隆抗体，稀释液用含3％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液(PBS)，37℃反应30 分钟，PBS洗涤玻片10分钟，加1：50稀释的FITC荧光标记羊抗鼠IgG抗体， 37℃反应30分钟，PBS洗涤玻片10分钟后吹干玻片，加荧光保护剂后加上盖玻片，指甲油封闭固定盖玻片四周后，荧光显微镜观察细胞，细胞内发现绿色荧光颗粒为阳性，表明是呼吸道合胞病毒感染，反之细胞内无绿色荧光颗粒，检测为阴性，非呼吸道合胞病毒感染。
实施例3
本实施例提供了一种检测或诊断呼吸道合胞病毒感染的试剂盒，该试剂盒为免疫胶体金试纸条，该试剂盒包含所述杂交瘤细胞株RSVN4C3分泌的抗呼吸道合胞病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体。
试纸条按照连接顺序依次包括样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述硝酸纤维素膜与胶体金垫之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与吸水纸之间有搭接，所述胶体金垫是由吸附有胶体金标记的抗RSVN4C3单克隆抗体的玻璃纤维素膜组成，所述硝酸纤维素膜上具有山羊抗鼠IgG多克隆抗体包被的质控线，以及抗RSV N蛋白单克隆抗体包被的检测线。
质控线是通过将山羊抗鼠IgG多克隆抗体以0.8mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上得到的；检测线是通过将抗RSV N蛋白单克隆抗体以0.5mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上得到的。检测线和质控线间隔0.5cm。
实施例4
本实施例提供的是实施例3的免疫胶体金试纸条用于人呼吸道合胞病毒检测的检测方法，包括以下步骤：
S1、在点样孔滴加测试样品200μL，反应10-15min观察结果；
S2、结果判定：
质控线和检测线都出现红色条带，则为阳性；
仅在质控线出现现一条红色条带，则为阴性；
若质控线无条带出现，不论检测线是否出现红色条带结果均判定为无效。
实施例5
本实施例提供的是实施例3的免疫胶体金试纸条的特异性试验。
以胶体金标记的RSVN4C3单克隆抗体制备抗原检测诊断试剂特异性识别呼吸道合胞病毒病毒，与RSV的两个基因型A及B都呈现阳性反应，而与流感病毒H1N1，肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A16(CA16)无交叉反应(图4)。
实施例6
本实施例提供的是实施例3的免疫胶体金试纸条的灵敏度试验。
胶体金标记RSVN4C3单克隆抗体制备抗原检测诊断试剂盒的灵敏度试验分析显示，本抗原检测试剂可以检测到105个PFU以上的病毒颗粒(图5)。
实施例7
本实施例提供了一种双抗体夹心法检测呼吸道合胞病毒抗原以诊断呼吸道合胞病毒感染ELISA试剂盒。
以1:10000磷酸盐缓冲液(PBS pH7.2)稀释的RSVN4C3单克隆抗体，每孔100μL加入96孔ELISA反应板，4℃包被过夜，再每孔加入100μL 3％BSA 室温封闭1小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入100μL患者鼻咽冲洗液，37℃反应1小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入100μL稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的RSVN4C3单克隆抗体，37℃反应1小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入HRP底物(TMB或OPD)，37℃显色反应30分钟后终止反应，用酶标仪测定各样本孔吸光度OD值，OD值高于阴性对照2倍以上判断为阳性。
实施例8
本实施例提供了一种IgM捕获法检测病人血清呼吸道合胞病毒特异性IgM 抗体以诊断呼吸道合胞病毒感染的ELISA试剂盒。
以1:500磷酸盐缓冲液(PBS pH7.2)稀释的羊抗人IgM抗体，每孔100μL 加入96孔ELISA反应板，4℃包被过夜，再每孔加入100μL 3％BSA室温封闭1 小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入100μL1:100稀释患者血清，37℃反应1小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入100μL(50ng)重组呼吸道合胞病毒N蛋白，37℃反应1小时，PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的RSVN4C3单克隆抗体，37℃反应1小时， PBS-Tween20洗涤ELISA板3次，加入HRP底物(TMB或OPD)，37℃显色反应30分钟后终止反应，用酶标仪测定各样本孔吸光度OD值，OD值高于阴性对照2倍以上判断为阳性。呼吸道合胞病毒特异性IgM抗体阳性可以诊断呼吸道合胞病毒近期感染。
序列表
<110> 贵州省人民医院
<120> 一种分泌抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株RSVN4C3
<130> 无
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> 根据实验要求而设计，用于HRSV N基因片段扩增的特异性引物
<400> 1
aatggatcca tggctcttag caaagtc
27
<210> 2
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> 根据实验要求而设计，用于HRSV N基因片段扩增的特异性引物
<400> 2
attgtcgacaagctctacatcattatc
27

Claims (8)

1.一种分泌抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株RSVN4C3，其特征在于，在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏编号为CCTCC NO:C2020254。
2.一种如权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株RSVN4C3在制备检测或诊断呼吸道合胞病毒感染试剂中的应用。
3.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株RSVN4C3分泌的抗呼吸道合胞病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体与RSV N蛋白发生抗原抗体反应，属IgG型抗体。
4.一种检测或诊断呼吸道合胞病毒感染的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求3所述的单克隆抗体。
5.一种检测或诊断呼吸道合胞病毒感染的免疫胶体金试纸条，其特征在于，包含如权利要求3所述的单克隆抗体。
6.如权利要求5所述的一种检测或诊断呼吸道合胞病毒感染的免疫胶体金试纸条，其特征在于，所述试纸条按照连接顺序依次包括样品垫，胶体金垫，硝酸纤维素膜，吸水纸及位于下方的作为组装平台使用的PVC底板，所述硝酸纤维素膜与胶体金垫之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与吸水纸之间有搭接，所述胶体金垫是由吸附有胶体金标记的如权利要求3所述的单克隆抗体的玻璃纤维素膜组成，所述硝酸纤维素膜上具有山羊抗鼠IgG多克隆抗体包被的质控线，以及抗RSV N蛋白单克隆抗体包被的检测线。
7.如权利要求6所述的一种检测或诊断呼吸道合胞病毒感染的免疫胶体金试纸条，其特征在于，所述质控线是通过将山羊抗鼠IgG多克隆抗体以0.8mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上得到的；所述检测线是通过将抗RSV N蛋白单克隆抗体以0.5mg/ml的浓度包被在硝酸纤维素膜上得到的。
8.如权利要求4所述的一种检测或诊断呼吸道合胞病毒感染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为ELISA试剂盒。
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