CN113584051B

CN113584051B - GhGAI基因在调控植物开花中的应用

Info

Publication number: CN113584051B
Application number: CN202110853200.1A
Authority: CN
Inventors: 王寒涛; 冯震; 喻树迅; 魏恒玲; 付小康; 马亮; 康萌; 芦建华
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-07-27
Filing date: 2021-07-27
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2041-07-27
Also published as: CN113584051A

Abstract

本发明公开了GhGAI基因在调控植物开花中的应用，涉及生物技术领域。根据CottonFGD公布已知的GhGAI(Gh_D07G0779)基因的CDS序列和编码的氨基酸序列，设计兼并引物，利用RT‑PCR技术克隆目的片段，筛选阳性克隆进行酶切、PCR鉴定、DNA测序以及核苷酸序列同源性比较，获得陆地棉GhGAI基因的保守区基因片段。构建过表达载体和反义表达载体，通过根癌农杆菌途径转化植株，达到提前和延后植物开花的目的。

Description

GhGAI基因在调控植物开花中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体地，涉及GhGAI基因在调控植物开花中的应用。

背景技术

作为全球最大的纺织品出口国、棉花消耗国，棉花支撑着中国纺织业的发展。新疆是我国最大的早熟棉生态区之一，每年供给的600万吨棉花其中2/3都来自新疆。北疆棉区春季自然灾害频发，为了降低自然灾害对棉花正常生长的影响，通常通过延迟播期来规避棉花种植的风险，因此，需要培育出性状优良的早熟品种。大多数植物都要经历开花这一过程，开花标志着植物由营养生长转变为生殖生长。同时，开花和棉花早熟性息息相关，开花时间的早晚是判定棉花品种早熟的一个重要指标形状。所以，研究棉花开花相关基因以及其所在的调控网络，对于棉花的早熟育种有着重要意义。

陆地棉(Gossypium hirsutum L.)是一种重要的经济作物。为了不和粮食作物耕地利用上产生冲突，培育棉花早熟品种已成为棉花育种的重要目标。大多数植物都要经历开花这一过程，开花标志着植物由营养生长转变为生殖生长。同时，研究表明，棉花开花和早熟性息息相关，开花时间的早晚是判定棉花品种早熟的一个重要指标性状。所以，研究棉花开花相关基因以及其所在的调控网络，对于棉花的早熟育种有着重要意义。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，发明人从陆地棉中克隆出GhGAI基因，该基因通过构建过表达载体和病毒诱导沉默载体，得到的过表达转基因株系相比于野生型开花提前，而沉默株系开花延迟，说明GhGAI基因在控制棉花开花期方面起到了重要的调控作用，从而完成本发明。

顶芽是决定开花时间的重要组织部位，花芽分化的早晚直接决定了植物开花的时间。为了研究GhGAI基因可能具有的潜在功能，发明人首先比较了GhGAI在早晚熟品种不同时期顶芽中的表达特异性，发明人发现GhGAI基因在早熟棉花品种CCRI50中的表达水平显著高于晚熟棉花品种国欣棉11。通过构建GhGAI基因过表达载体，得到的过表达转基因株系相比于野生型开花提前，利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术进一步验证了GhGAI在棉花中的功能，并观察到被沉默的植株与在相同生长状态下生长的野生型相比出现明显晚花。因此发明人认为GhGAI在调控植物开花方面可能具有关键作用。

本发明提供了GhGAI基因在提调控植物开花中的应用，所述GhGAI基因具有SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列。

GhGAI基因的开放阅读框为1647bp。

在本发明的一些实施方案中，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列能够编码SEQ IDNO:2所示氨基酸序列。该氨基酸序列包含548个氨基酸。

在本发明的一些实施方案中，在植物中提高GhGAI基因的表达量，以促进植物开花。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的在植物中提高GhGAI基因的表达量是通过如下方法实现：提高植物内源GhGAI基因的表达，或在植物中过表达外源GhGAI基因。

在本发明的一个具体要求实施方案中所述过表达外源GhGAI基因是指将所述GhGAI基因利用植物表达载体，经农杆菌介导转化到植物中进行表达。

进一步地，所述GhGAI基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。

更进一步地，所述植物表达载体通过一种组成型或诱导型启动子驱动所述GhGAI基因的表达。

再进一步地，所述组成型启动子是35S启动子。

在本发明中，所述促进开花是指促使植物开花期提前。

在本发明中，所述植物是棉花、玉米、水稻、小麦或拟南芥。

在本发明的一些实施方案中，在植物中降低GhGAI基因的表达量，以延迟植物开花。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的在植物中降低GhGAI基因的表达量是通过如下方法实现：抑制GhGAI基因表达。

在本发明的一个具体要求实施方案中所述抑制GhGAI基因表达是指将所述GhGAI基因构建反义表达载体，利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术，经农杆菌介导转化到植物中，实现基因沉默。

进一步地，所述GhGAI基因反义表达载体导入植物细胞、组织或器官。

更进一步地，所述反义表达载体通过产生干扰RNA抑制所述GhGAI基因的表达。

在本发明中，所述延迟开花是指促使植物开花期推迟。

本发明的有益效果

本发明通过过表达和沉默植物中的GhGAI基因，结果表明GhGAI基因在调控植物开花方面可能具有关键作用。本发明为调控棉花花期提供了有利的基因资源。

附图说明

图1示出了GhGAI基因在中50和国欣棉11中的表达量。

图2中A示出了GhGAI促进过表达转基因拟南芥提早开花；图2中B示出了GhGAI基因在不同材料中的转录水平。

图3中A示出了陆地棉GhGAI沉默株系发生白化现象，相较于对照植株，表现出株高变高，并出现晚花的表型；图3中B示出了沉默植株和空载对照中GhGAI的表达量。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

实施例1

1.棉花材料

本实验选取的棉花材料为陆地棉早熟品种中棉所50和晚熟品种国欣棉11，两个品种在开花时间和生育期存在着极显著差异，种植于中国农业科学院棉花研究所试验田(安阳白璧)，管理措施为正常大田管理。取样方式为两个棉花品种一叶期到五叶期的幼芽，至于液氮中，在提取样品RNA之前放置-80℃留存。

2.试剂和耗材

2.1酶及试剂盒：限制性内切酶，修饰酶、PCR反应体系相关酶、同源重组酶、胶回收试剂盒、克隆试剂盒、质粒小提试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司，荧光定量试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司公司，RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技公司。

2.2其他药品：琼脂糖为西班牙原装产品，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯，卡那霉素等索莱宝生物有限公司，大肠杆菌感受态细胞DH5α和农杆菌感受态购自擎科生物公司。

2.3培养基：LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L；LB固体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L、琼脂粉15g/L，定容至1L；LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55度时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板；1/2MS固体培养基：1/2MS 22g/L，琼脂粉(agar powder)8g/L，蔗糖(sucrose)30g/L。本文中提到的但未列出的各种试剂溶液均按《分子克隆实验指南》第三版上的方法配制，生化试剂为分析纯或以上级。

2.4主要仪器：PCR扩增仪(BIO-RAD)，高速离心机(Hettich MIKRO 200R)、电泳设备(BIO-RAD)、凝胶成像***(BIO-RAD)、荧光定量PCR仪(ABI7500)、电热恒温培养箱(上海森信)、恒温培养振荡器(上海智城)、人工气候试验箱(赛福)、人工气候室。

实验方法与结果

1.棉花GhGAI的生物信息学分析

1.1从CottonFGD(http://www.cottonfgd.org/)上获得GhGAI(Gh_D07G0779)基因的CDS序列和编码的氨基酸序列，采用Primer Premier 5.0软件设计引物，采用PCR(Polymerase Chain Reaction)的方法从陆地棉中50中扩增，其开放阅读框为1647bp，编码548个氨基酸，我们将该基因命名为GhGAI，并对其功能进行研究。GhGAI基因CDS序列为(SEQID NO:1)：

ATGAAGAGAGATCATCAAGAAATTTCTGGGAGTGGTTCAAAACCAGCTGAGAGTTCATCCATTAAAGGGAAATTATGGGAAGAAGATCCAGATGCTGGTGGCATGGACGACGAGTTATTAGCTGTTTTGGGTTACAAAGTTCGGTCATCAGATATGGCGGATGTAGCTCAAAAATTGGAAATGTTGGAGAAAGTTATGGGTACTGCTCAAGAAGATGGGATTTCACAGCTTGGTGATACTGTTCATTTTAATCCTTCAGATCTATCCGGTTGGGTTCAAAATTTGTTGATCGAGTTCAACGGTCCAACAACAACCCCAGATCCCAATTTCAACGATGATTCTGAGTACGATCTTAGAGCAATACCAGGGGTCGCCGCTTACCCACCGGTGAAATCGGATCCGGGTCTAGAAAATACCCGGAAACGAGCTAAAACTGAGTCCTCCTCATCATCATCTTCAACAACTACTCGTCCTGTTGTGTTGATTGACTCACAAGAAGCTGGGGTTCGACTCGTTCATACATTAATGGCTTGTGCTGAAGCTGTTCAACAAGATAATCTTAAACTAGCTGATGCATTAGTGAAACATATTGGGTTACTTGCTTCATCACAAACTGGTGCTATGAGAAAAGTTGCTACTTATTTTGCTGAAGCTTTAGCTCGAAGAATTTATAGAATTTTCCCACCAGATTCACTTGATCCATCATATAATGATAAGTTACAAATTCCCTTCTATGAAACTTGTCCTTATTTGAAATTTGCTCATTTTACAGCCAATCAAGCCATATTGGAAGCTTTTTCAATGGCTAGTAGAGTTCATGTTATTGATTTTGGGCTAAAACAAGGTATGCAATGGCCAGCTTTAATGCAAGCACTTGCATTAAGACCCGGTGGACCACCGGCGTTTCGATTGACCGGAATTGGACCGCCTCAACCGGATAATACTGATGCGTTGCAACAAGTGGGGTGGAAGCTAGCTCAATTGGCCGAACGCATCGGGATCGAATTCGAGTTTCGGGGATTCGTGGCTAATAGTTTAGCCGATCTCGAACCCGAAATGCTCGATATTCGTCCTCCCGAGATTGAAGTAGTAGCGGTGAACGCTGTTTTCGAGCTTCATCCCTTGTTAGCTCGACCGGGTGGGATCGAAAAAGTTGTTTCCTCTATTAAAGCGATGAAACCCAAGATTGTCACGGTTGTTGAACAAGAAGCGAATCACAACGGTCCGGTTTTCTTAGACCGTTTTACTGAAGCTCTCCATTATTATTCTACCCTTTTCGACTCGTTGGAAGGTTCAGGGGTGGCGCCAGCGAGTCAAGACCTGGCTATGTCCGAGTTATACTTAGGAAGACAGATTTGTAACGTGGTTGCTTGTGAAGGGATGGACCGAGTTGAACGACACGAGCCGCTGACTCAGTGGAGAACTCGGATGGAAACGGCCGGGTTTAGCCCTGTTCATTTGGGTTCCAATGCTTATAAACAAGCTAGTATGTTGTTGGCCCTCTTCGCCAGCGGCGATGGGTATAGAGTGGAGGAGAATAATGGGTGTTTAATGCTTGGGTGGCATACAAGGCCACTTATCGCCACCTCGGCTTGGCGACTCGCTGGTACTGAGTCAGGTAGTGAGTTAACTCAGGAGCTGAGTTGA

GhGAI基因编码的氨基酸序列为(SEQ ID NO:2)：

MKRDHQEISGSGSKPAESSSIKGKLWEEDPDAGGMDDELLAVLGYKVRSSDMADVAQKLEMLEKVMGTAQEDGISQLGDTVHFNPSDLSGWVQNLLIEFNGPTTTPDPNFNDDSEYDLRAIPGVAAYPPVKSDPGLENTRKRAKTESSSSSSSTTTRPVVLIDSQEAGVRLVHTLMACAEAVQQDNLKLADALVKHIGLLASSQTGAMRKVATYFAEALARRIYRIFPPDSLDPSYNDKLQIPFYETCPYLKFAHFTANQAILEAFSMASRVHVIDFGLKQGMQWPALMQALALRPGGPPAFRLTGIGPPQPDNTDALQQVGWKLAQLAERIGIEFEFRGFVANSLADLEPEMLDIRPPEIEVVAVNAVFELHPLLARPGGIEKVVSSIKAMKPKIVTVVEQEANHNGPVFLDRFTEALHYYSTLFDSLEGSGVAPASQDLAMSELYLGRQICNVVACEGMDRVERHEPLTQWRTRMETAGFSPVHLGSNAYKQASMLLALFASGDGYRVEENNGCLMLGWHTRPLIATSAWRLAGTESGSELTQELS

1.2具体克隆基因的过程为：

(1)试验材料陆地棉中50和国欣棉11种植于中国农业科学院棉花研究所安阳试验基地，按一般大田管理。取样方式为从子叶展平时开始取棉一苗顶尖，每展平一片真叶取一次样，每次三个生物学重复，所取材料迅速放入液氮中冷冻，用研钵和研磨棒将其研磨至粉末状，大约取100mg样品放于1.5ML离心管中，保存于-80℃冰箱备用。子叶展平时标记为0TLS(0true-leaf stage)，一片真叶展平时标记为1TLS(1true-leaf stage)，往后类推,一直取到第五片真叶完全展开。植物总RNA提取采用TIANGEN公司试剂盒。

(2)RNA的提取步骤为：

1)匀浆处理：取适量纤维样品在液氮中迅速研磨成粉末，加入700μL SL(使用前加入β-巯基乙醇)，立即剧烈震荡使样品混匀；

2)12,000rpm离心2min；

3)将上清液转移至过滤柱CS上，12，000rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头避免接触收集管中的细胞碎片；

4)加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，将混合物转入吸附柱CR3中，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

5)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

6)DNase I工作液：取10μL DNase I储存液和70μL RDD溶液轻柔混匀；

7)向CR3中加入80μL的DNase I工作液，室温静止15min；

8)静置完后，向CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

9)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(使用前加入乙醇)，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

10)重复步骤9；

11)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μLRNase-Free ddH₂O，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，得到RNA溶液。注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μL，体积过小影响回收效率。RNA样品请在-70℃中保存。如果预期RNA得率大于30μg，可将步骤11中离心得到的RNA溶液再加入吸附柱CR3中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，得到RNA溶液。

(3)cDNA的合成。将500ng RNA反转录为cDNA，采用TaKaRa的PrimeScript^TMRTreagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行(宝生物，大连)，具体步骤为：

1)RNA样品中的gDNA的去除：

①反应体系的配置

②将配好的体系室温放置5-10min后，再将体系转置冰上，备用。

2)cDNA单链合成

反应体系的配置：

将上述配好且混匀的体系共20μL放置在37℃下，30min；85℃下，5sec；4℃保存。将反转录后的cDNA放置到-20℃，可长期保存。

(4)荧光定量PCR

1)利用Primer5.0软件设计GhGAI基因的特异性引物,用棉花GhActin7基因为内参基因。

引物序列：

GhActin7-F：5′-ATCCTCCGTCTTGACCTTG-3′(SEQ ID NO:3)

GhActin7-R：5′-TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3′(SEQ ID NO:4)

GhGAI-F：5′-CGGTCCAACAACAACCCCAGAT-3′(SEQ ID NO:5)

GhGAI-R：5′-TCCGATTTCACCGGTGGGTAAG-3′(SEQ ID NO:6)

2)荧光定量PCR

利用Cwbio(China)的UltraSYBR Mixture(Low ROX)试剂盒和AppliedBiosystems 7500仪器完成。具体过程如下：

①将上述的cDNA原液稀释5倍；

②反应体系的配置(冰上操作)：

③将配置好的体系混匀，离心至无气泡，然后利用Applied Biosystems 7500进行荧光定量PCR：按照两步法设置PCR程序：

预变性：95℃2min；95℃，5sec；60℃，34sec，这两步设置40个循环；最后溶解曲线分析：95℃，15sec；60℃，20sec；95℃，15sec。完成上述反应后，将数据导出，计算基因的表达量。

(5)结果分析

GhGAI在中50和国欣棉11两个材料花芽分化时期的相对表达量是利用2^-△△Ct方法计算的。开花期是早熟的重要指标，能够受到花芽分化时期的影响。花芽分化是植物由营养生长转变为生殖生长的重要生理和形态指标。由图1可以看出，GhGAI在早熟棉花品种中的一叶期、二叶期和五叶期的表达水平高于晚熟棉花品种，并且呈现极显著差异。同时，在二叶期表达水平的相比于晚熟棉花品种差异最大，同时也是这五个时期中表达量最高的时期结合到组织表达特异性，说明该基因跟可能和棉花早熟性有关。

实施例2

1.基因引物的设计

采用Prime 5软件设计引物，用PCR(Polymerase Chain Reaction)的方法从陆地棉TM-1中扩增，所用cDNA为步骤3.2中36二叶期的样品。为了扩增基因编码区全长，并加上特定酶切位点，根据GhGAI的CDS序列，分别在起始密码子ATG和终止密码子处设计含有适合酶切位点引物。所用酶切位点为XbaI和SacI。

GhGAI酶切位点引物序列如下：

GhGAI-F：

5′-CACGGGGGACTCTAGAATGAAGAGAGATCATCAAGAAA-3′

(SEQ ID NO:7)

GhGAI-R：

5′-GATCGGGGAAATTCGAGCTCTCAACTCAGCTCCTGAGTTA-3′

(SEQ ID NO:8)

2.基因克隆的PCR反应体系、程序和产物检测

(1)PCR反应体系

根据PrimeSTAR GXL DNA聚合酶说明书，PCR反应体系如下：

(2)PCR反应程序：

(3)PCR产物的检测

取2μL PCR产物，加入3μL 6×Loading Buffer，混匀，点样于1％琼脂糖凝胶，电泳检测条带大小是否1647bp左右。

(4)PCR产物的胶回收

采用Vazyme产物纯化试剂盒，步骤如下：

1)DNA电泳结束后，在紫外灯快速切下含有目的DNA片段的凝胶，建议用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，并尽量去除多余的凝胶。秤取凝胶中粮(去除空管的重量)，100mg凝胶等同于100μL体积，作为一个凝胶体积；

2)加入等体积的Buffer GDP。50～55℃水浴7-10分钟，根据凝胶大小适当调整时间，确保凝胶块完全溶解。水浴期间颠倒混匀2次加速溶胶；

3)短暂离心收集管壁上的液滴。将FastPure DNA Mini Columns-G吸附柱置于Collection Tubes 2ml收集管中，把≤700μL溶胶液转移至吸附柱中，12,000Xg离心30-60sec。若溶胶体积大于700μL，把吸附柱置于收集管中，剩余的溶胶液转移至吸附柱中，12,000×g离心30-60sec；

4)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入300μL Buffer GDP至吸附柱中。静置1min。12,000×g离心30-60sec；

5)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入700μL Buffer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中。12,000×g离心30-60sec；

6)重复步骤5.

7)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。12,000×g离心2min。

8)将吸附柱置于1.5ml灭菌的离心管中，加入20-30μL的灭菌水至吸附柱中央，放置2min。12,000Xg离心1min。弃去吸附柱，把DNA保存于-20℃。

3.PBI121-GhGAI植物表达载体的构建

(1)PBI121质粒的双酶切及胶回收

将PBI121质粒用XbaI和SacI双酶切，电泳回收PBI121载体的大片段产物。

酶切反应体系如下：

(2)PCR胶回收产物和酶切PBI121质粒的连接

把带有接头的PCR产物和双酶切的PBI121质粒用诺唯赞同源重组酶试剂

II One Step Cloning Kit进行连接，连接反应如下：

体系配置于冰上进行：

体系完成后，吹打混匀各组分，37℃反应30min，立即冰水浴5min,转化或者-20℃保存。

(3)连接产物转化大肠杆菌

1)向连接反应体系中加入100ul大肠杆菌DH5a感受态，冰浴30min；

2)42℃水浴热激45～90sec；

3)冰浴2min；加入900ul无抗性的LB液体培养基，37℃，190rpm，孵育1h；

4)离心收菌，4000rpm，3min，弃上层上清，留约100ul混匀后涂布含卡那抗性的LB平板；

5)37℃，恒温培养过夜；

(4)阳性克隆的检测及测序

1)从转化平板上挑取白色菌落，放入含有Kan的液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养8小时；

2)菌落PCR验证阳性克隆，将验证正确的单克隆送到尚亚生物科技有限公司测序，每个序列测3个重复；

(5)阳性菌液的保存

菌液PCR验证且测序正确的菌液中加入一定量的甘油，使甘油终浓度在20％左右，-80℃保存。返还测序正确的质粒用于转农杆菌；

(6)转化农杆菌

利用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，具体转化过程如下：

1)-80℃农杆菌融化，冰水混合状态***冰中；

2)100μL感受态中加入0.01～1μg质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟，液氮5分钟，37℃五分钟，冰浴5分钟；

3)加入700ul无抗性的LB液体培养基，于28℃振荡培养2-3小时；

4)取100-150ul菌液于含有卡那、利福平、链霉素的LB平板上，倒置放于28℃培养箱2-3天；

5)挑选阳性克隆，在加有抗性的LB液体培养基上28度培养48h，菌液PCR验证条带正确的菌液甘油保存终浓度在20％左右，-80℃保存备用；

4.农杆菌介导的拟南芥的转化

(1)拟南芥培养

从1/2MS平板中移栽的哥伦比亚野生型拟南芥，种植在人工气候室，长至盛花期，将已经结的果荚剪去，并保证拟南芥根部营养土的湿度；

(2)拟南芥花序侵染转化

对于35S::GhGAI的过表达载体的拟南芥转化采用的是花序侵染法(Clough andBent,1998)，具体操作如下：

1)菌液活化：取-80℃保存的对应重组载体的农杆菌菌液20μL，接种到1ml LB液体培养基(加入对应的抗生素：卡纳霉素、利福平和链霉素)中，28℃，180rpm，培养14-18h；

2)扩摇：取活化后的对应菌液200μL加入到50ml LB液体培养基(加入对应的抗生素)；28℃，180rpm，培养至菌液OD600值约在1.2-1.6之间(约18-20h)，5000g，离心8min，弃上清，收集菌体；

3)侵染转化的介质配制：1/2MS减半、6％蔗糖、0.02％的SilwetL-77，用NaOH将pH调至5.6-5.7；

4)用转化介质悬浮上述菌体，将OD600调至0.6-0.8；

5)浸染：将拟南芥花序(主要是未开放的花苞)置于转化介质中30-50sec，浸染后，将拟南芥在弱光或者避光条件下平放24h；

6)将处理后的拟南芥放置正常条件下培养，并在侵染后的一周内每天给拟南芥叶片喷水；为了提高转化效率，可在约一周后进行重复侵染；

7)待成熟后，收获拟南芥种子，即为转基因的T0代种子。

5.转基因拟南芥植株的表型鉴定

(1)将收获的种子消毒后种植在含卡那霉素的1/2MS上，后进行4℃春化2天，转移到人工气候试验箱中，10天左右会阳性植株生长正常，而阴性植株叶片变黄，不再生长；

(2)将阳性拟南芥植株移栽至小花盆中种植，待生长一个月后提取DNA用PCR进行检测，检测时所用引物为：

35S-F：5′-GACGCACAATCCCACTATCC-3′(SEQ ID NO:9)

GhGAI-R：5′-TCAACTCAGCTCCTGAGTTA-3′(SEQ ID NO:10)

(3)每一代的植株都要进行阳性株系的检测，直至繁殖至T3代，获得纯合转基因拟南芥株系。T3代株系做qRT-PCR检测,荧光定量验证的过程如下：

提取RNA，反转录成cDNA，GhGAI荧光定量的引物：

GhGAI-F：5′-CGGTCCAACAACAACCCCAGAT-3′(SEQ ID NO:11)

GhGAI-R：5′-TCCGATTTCACCGGTGGGTAAG-3′(SEQ ID NO:12)

冰上配制qRT-PCR反应体系，进行荧光定量PCR反应。荧光定量验证结果证实GhGAI基因在转基因植株中转录水平极显著高于非转基因拟南芥，如图2。

(4)将转基因T3代植株与非转基因植株进行消毒培养于1/2MS培养基上，4℃春化两天后，10天左右拟南芥幼苗长出真叶即移到小花盆里生长，同等条件下种植栽培，生长到25天左右，转基因株系开始抽薹开花，非转基因拟南芥开花晚于转基因拟南芥(附图2)；说明过表达GhGAI明显促进拟南芥开花和生殖生长发育。

实施例3

1.棉花材料种植

对收获的中24种子进行硫酸脱绒后，挑选饱满的种子种植在人工气候室中，光周期和温度条件为：光照16h，28℃；黑暗8h，22℃。待幼苗子叶展平，第一片真叶露出(约10天)后，进行VIGS菌液注射试验。

2.pCLCrVA沉默载体的构建

构建VIGS的沉默载体pCLCrVA选用的是Spe I和Asc I两个酶切位点，首先对质粒进行双酶切，并胶回收酶切产物。GhGAI沉默片段从中50二叶期cDNA里通过PCR进行扩增，用到的引物为：

VA-GAI-F：

5′-ATGCCTGCAGACTAGTGATCCCAATTTCAACGATGAT-3′(SEQ ID NO:13)

VA-GAI-R：

5′-AGACCTAGGGGCGCGCCACCAGTTTGTGATGAAGCAA-3′(SEQ ID NO:14)

VIGS沉默片段胶回收以后，按照ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺唯赞，南京)操作说明进行基因片段和载体的重组连接。将反应体系转入大肠杆菌感受态Trans 5α中，具体步骤同3.3.3。将菌液涂布到加有卡那霉素(Kan，50μg/ml)的LB平板，放置在37℃温度下，倒置过夜培养12-16h，挑选阳性的单克隆进行测序。将测序正确的质粒转入农杆菌,并进行菌落PCR，条带正确的菌液甘油保存至-80℃。

3.菌液注射

棉花VIGS的具体操作过程参考Gu等人的方法(Gu et al.,2014)，具体过程如下：

(1)活化菌液：将20μL的-80℃冻存的上述重组质粒的农杆菌菌液(连接目的基因(GhGAI)的pCLCrVA载体、阳性对照(PDS)的pCLCrVA、空载对照pCLCrVA和载体pCLCrVB)加入含三抗(卡那霉素、利福平和链霉素)的液体LB培养基中，在28℃，180rpm条件下培养14-16h；

(2)扩摇：将50-100μL的活化菌液加入50ml含上述三种抗生素的液体LB培养基，在28℃，180rpm条件下培养16-20h，使菌液的OD600值在1.5-2.0之间(这时的菌液一般变为橙黄色)。5000g，离心10min，回收菌体；

(3)转化介质的调配：

转化介质的配方：MgCl2，10mM；MES(2-(4-Morpholino)ethanesulfonic acid)，10mM，用NaOH调pH为5.6；AS(acetosyringone)，200μM。

用转化介质对上述收集的菌体进行悬浮，调OD600值在1.5左右，室温静置3h以上(避光)。

(4)将pCLCrVB与pCLCrVA(空载)、阳性对照的pCLCrVA、目的基因的pCLCrVA的介质分别按照1:1混匀；

(5)用1ml的无菌注射器针头划破棉花子叶背面的表皮，去除针头，将混匀后的菌液注入子叶，直至子叶完全侵润；

(6)将注射后的棉花幼苗避光过夜培养，后置于光温条件为：23℃；16h(光照)/8h(黑暗)条件下的人工气候室正常管理。

4.沉默株系的鉴定

待注射阳性对照(PDS)的pCLCrVA棉花幼苗的叶片出现白化表型后，对注射的pCLCrVA::GhGAI和pCLCrVA(空载)取叶片，提取DNA和RNA，进行PCR和荧光定量PCR检测，将检测出含有目的片段的幼苗种植到大花盆中正常管理，直至棉花开花。通过荧光定量PCR，检测到沉默植株中GhGAI的表达量相较于空载对照降低80％左右(图3)。

5.表型鉴定

将筛选到的阳性植株移栽到大盆中直至开花。相比于正常植株，阳性植株的叶片产生明显的白化现象，表明病毒在植株体内表现出毒性作用，并且这种毒性作用一直持续到棉花开花时期。而将GhGAI基因沉默的植株相较于对照植株，表现出株高变高，并出现晚花的表型，进一步证明GhGAI在控制棉花开花期方面具有重要的作用。

序列表

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> GhGAI基因在调控植物开花中的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagagag atcatcaaga aatttctggg agtggttcaa aaccagctga gagttcatcc 60

attaaaggga aattatggga agaagatcca gatgctggtg gcatggacga cgagttatta 120

gctgttttgg gttacaaagt tcggtcatca gatatggcgg atgtagctca aaaattggaa 180

atgttggaga aagttatggg tactgctcaa gaagatggga tttcacagct tggtgatact 240

gttcatttta atccttcaga tctatccggt tgggttcaaa atttgttgat cgagttcaac 300

ggtccaacaa caaccccaga tcccaatttc aacgatgatt ctgagtacga tcttagagca 360

ataccagggg tcgccgctta cccaccggtg aaatcggatc cgggtctaga aaatacccgg 420

aaacgagcta aaactgagtc ctcctcatca tcatcttcaa caactactcg tcctgttgtg 480

ttgattgact cacaagaagc tggggttcga ctcgttcata cattaatggc ttgtgctgaa 540

gctgttcaac aagataatct taaactagct gatgcattag tgaaacatat tgggttactt 600

gcttcatcac aaactggtgc tatgagaaaa gttgctactt attttgctga agctttagct 660

cgaagaattt atagaatttt cccaccagat tcacttgatc catcatataa tgataagtta 720

caaattccct tctatgaaac ttgtccttat ttgaaatttg ctcattttac agccaatcaa 780

gccatattgg aagctttttc aatggctagt agagttcatg ttattgattt tgggctaaaa 840

caaggtatgc aatggccagc tttaatgcaa gcacttgcat taagacccgg tggaccaccg 900

gcgtttcgat tgaccggaat tggaccgcct caaccggata atactgatgc gttgcaacaa 960

gtggggtgga agctagctca attggccgaa cgcatcggga tcgaattcga gtttcgggga 1020

ttcgtggcta atagtttagc cgatctcgaa cccgaaatgc tcgatattcg tcctcccgag 1080

attgaagtag tagcggtgaa cgctgttttc gagcttcatc ccttgttagc tcgaccgggt 1140

gggatcgaaa aagttgtttc ctctattaaa gcgatgaaac ccaagattgt cacggttgtt 1200

gaacaagaag cgaatcacaa cggtccggtt ttcttagacc gttttactga agctctccat 1260

tattattcta cccttttcga ctcgttggaa ggttcagggg tggcgccagc gagtcaagac 1320

ctggctatgt ccgagttata cttaggaaga cagatttgta acgtggttgc ttgtgaaggg 1380

atggaccgag ttgaacgaca cgagccgctg actcagtgga gaactcggat ggaaacggcc 1440

gggtttagcc ctgttcattt gggttccaat gcttataaac aagctagtat gttgttggcc 1500

ctcttcgcca gcggcgatgg gtatagagtg gaggagaata atgggtgttt aatgcttggg 1560

tggcatacaa ggccacttat cgccacctcg gcttggcgac tcgctggtac tgagtcaggt 1620

agtgagttaa ctcaggagct gagttga 1647

<210> 2

<211> 548

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Arg Asp His Gln Glu Ile Ser Gly Ser Gly Ser Lys Pro Ala

1 5 10 15

Glu Ser Ser Ser Ile Lys Gly Lys Leu Trp Glu Glu Asp Pro Asp Ala

20 25 30

Gly Gly Met Asp Asp Glu Leu Leu Ala Val Leu Gly Tyr Lys Val Arg

35 40 45

Ser Ser Asp Met Ala Asp Val Ala Gln Lys Leu Glu Met Leu Glu Lys

50 55 60

Val Met Gly Thr Ala Gln Glu Asp Gly Ile Ser Gln Leu Gly Asp Thr

65 70 75 80

Val His Phe Asn Pro Ser Asp Leu Ser Gly Trp Val Gln Asn Leu Leu

85 90 95

Ile Glu Phe Asn Gly Pro Thr Thr Thr Pro Asp Pro Asn Phe Asn Asp

100 105 110

Asp Ser Glu Tyr Asp Leu Arg Ala Ile Pro Gly Val Ala Ala Tyr Pro

115 120 125

Pro Val Lys Ser Asp Pro Gly Leu Glu Asn Thr Arg Lys Arg Ala Lys

130 135 140

Thr Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Thr Thr Arg Pro Val Val

145 150 155 160

Leu Ile Asp Ser Gln Glu Ala Gly Val Arg Leu Val His Thr Leu Met

165 170 175

Ala Cys Ala Glu Ala Val Gln Gln Asp Asn Leu Lys Leu Ala Asp Ala

180 185 190

Leu Val Lys His Ile Gly Leu Leu Ala Ser Ser Gln Thr Gly Ala Met

195 200 205

Arg Lys Val Ala Thr Tyr Phe Ala Glu Ala Leu Ala Arg Arg Ile Tyr

210 215 220

Arg Ile Phe Pro Pro Asp Ser Leu Asp Pro Ser Tyr Asn Asp Lys Leu

225 230 235 240

Gln Ile Pro Phe Tyr Glu Thr Cys Pro Tyr Leu Lys Phe Ala His Phe

245 250 255

Thr Ala Asn Gln Ala Ile Leu Glu Ala Phe Ser Met Ala Ser Arg Val

260 265 270

His Val Ile Asp Phe Gly Leu Lys Gln Gly Met Gln Trp Pro Ala Leu

275 280 285

Met Gln Ala Leu Ala Leu Arg Pro Gly Gly Pro Pro Ala Phe Arg Leu

290 295 300

Thr Gly Ile Gly Pro Pro Gln Pro Asp Asn Thr Asp Ala Leu Gln Gln

305 310 315 320

Val Gly Trp Lys Leu Ala Gln Leu Ala Glu Arg Ile Gly Ile Glu Phe

325 330 335

Glu Phe Arg Gly Phe Val Ala Asn Ser Leu Ala Asp Leu Glu Pro Glu

340 345 350

Met Leu Asp Ile Arg Pro Pro Glu Ile Glu Val Val Ala Val Asn Ala

355 360 365

Val Phe Glu Leu His Pro Leu Leu Ala Arg Pro Gly Gly Ile Glu Lys

370 375 380

Val Val Ser Ser Ile Lys Ala Met Lys Pro Lys Ile Val Thr Val Val

385 390 395 400

Glu Gln Glu Ala Asn His Asn Gly Pro Val Phe Leu Asp Arg Phe Thr

405 410 415

Glu Ala Leu His Tyr Tyr Ser Thr Leu Phe Asp Ser Leu Glu Gly Ser

420 425 430

Gly Val Ala Pro Ala Ser Gln Asp Leu Ala Met Ser Glu Leu Tyr Leu

435 440 445

Gly Arg Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Cys Glu Gly Met Asp Arg Val

450 455 460

Glu Arg His Glu Pro Leu Thr Gln Trp Arg Thr Arg Met Glu Thr Ala

465 470 475 480

Gly Phe Ser Pro Val His Leu Gly Ser Asn Ala Tyr Lys Gln Ala Ser

485 490 495

Met Leu Leu Ala Leu Phe Ala Ser Gly Asp Gly Tyr Arg Val Glu Glu

500 505 510

Asn Asn Gly Cys Leu Met Leu Gly Trp His Thr Arg Pro Leu Ile Ala

515 520 525

Thr Ser Ala Trp Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Gly Ser Glu Leu Thr

530 535 540

Gln Glu Leu Ser

545

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcctccgtc ttgaccttg 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtccgtcag gcaactcat 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggtccaaca acaaccccag at 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tccgatttca ccggtgggta ag 22

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cacgggggac tctagaatga agagagatca tcaagaaa 38

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatcggggaa attcgagctc tcaactcagc tcctgagtta 40

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gacgcacaat cccactatcc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcaactcagc tcctgagtta 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cggtccaaca acaaccccag at 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tccgatttca ccggtgggta ag 22

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgcctgcag actagtgatc ccaatttcaa cgatgat 37

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agacctaggg gcgcgccacc agtttgtgat gaagcaa 37

Claims

1.GhGAI 基因在调控植物开花中的应用，其特征在于，所述GhGAI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；所述植物为棉花或者拟南芥；在植物中提高GhGAI基因的表达量，以促进植物开花；在植物中减少GhGAI基因的表达量，以延迟植物开花。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列能够编码SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的在植物中提高GhGAI基因的表达量是通过如下方法实现：提高植物内源GhGAI基因的表达，或在植物中过表达外源GhGAI基因。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的在植物中降低GhGAI基因的表达量是通过如下方法实现：构建反义表达载体，减少GhGAI基因的表达。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述过表达外源GhGAI基因是指将所述GhGAI基因利用植物表达载体，经农杆菌介导转化到植物中。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述构建反义表达载体是指将GhGAI基因整合到沉默载体中，经农杆菌介导转化到植物中。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述GhGAI基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述GhGAI基因通过构建反义表达载体导入植物细胞、组织或器官，所述反义表达载体通过产生干扰RNA抑制所述GhGAI基因的表达。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体通过一种组成型或诱导型启动子驱动所述GhGAI基因的表达。