CN107266544B - 蛋白质SiNADP-ME3及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用 - Google Patents

蛋白质SiNADP-ME3及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了蛋白质SiNADP‑ME3及其编码基因与相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用。本发明的蛋白质SiNADP‑ME3的氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；蛋白质SiNADP‑ME3的编码基因序列如序列1所示。通过实验证明：SiNADP‑ME3在植物干旱胁迫下维持产量发挥着重要的作用，该基因具有在作物抗旱和水分高效利用方面具有重要的实践意义，也为深入理解谷子耐旱性产生的机理提供了线索。

Description

蛋白质SiNADP-ME3及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质SiNADP-ME3及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用。
背景技术
干旱已成为世界范围内农作物产量进一步提高和稳定生长的主要限制因素。谷子作为我国传统的粮草兼用作物，具有耐贫瘠、水分利用效率高和光合作用效率高等优良特性，在旱作农业中占有重要地位。随着水资源的日益匮乏，加强谷子耐旱种质资源研究、挖掘新的抗旱基因、进一步提高谷子耐旱性，对促进谷子生产水平的提高和其他作物抗旱性的改良具有重要的战略意义。
NADP-ME参与植物的防御和胁迫应答。非光合型NADP-ME涉及各种胁迫因素引起的防御反应，例如物理损伤、病原体侵入和UV-B辐射等。在这些应激下，NADP-ME活性显著增加，推测NADP-ME在苹果酸代谢过程中催化还原物质NADPH的产生，用于木质素和其他物质合成。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何提高植物抗逆性。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了SiNADP-ME3蛋白质的新用途。
本发明提供了SiNADP-ME3蛋白质在调控植物抗逆性中的应用；
所述SiNADP-ME3蛋白质为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
Figure BDA0001377972270000011
Figure BDA0001377972270000021
上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了与SiNADP-ME3蛋白质相关的生物材料的新用途。
本发明提供了与SiNADP-ME3蛋白质相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用：
所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：
A1)编码SiNADP-ME3蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码SiNADP-ME3蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码SiNADP-ME3蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述应用中，所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了SiNADP-ME3蛋白质或上述生物材料的新用途。
本发明提供了SiNADP-ME3蛋白质或上述生物材料在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用。
本发明还提供了SiNADP-ME3蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用。
上述应用中，所述抗逆性为抗旱性。
上述应用中，所述调控为提高，具体体现在：在充分浇水的条件下，转SiNADP-ME3拟南芥的根长、叶片面积、茎伸长率、生长速率、花茎高度高于野生型拟南芥；在水分胁迫条件下，转SiNADP-ME3拟南芥水分散失率和细胞死亡率均低于野生型拟南芥；在干旱胁迫下，转SiNADP-ME3拟南芥的存活率和总生物量高于野生型拟南芥。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。
本发明提供的培育抗逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中SiNADP-ME3蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物。
上述方法中，所述抗逆性为抗旱性。
上述方法中，所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(9)中任一种：
(1)转基因植物的叶片面积高于受体植物；
(2)转基因植物的根长长于受体植物；
(3)转基因植物的茎伸长率和/或生长速率高于受体植物；
(4)转基因植物的花茎高度高于受体植物；
(5)转基因植物的抽薹时间早于受体植物；
(6)转基因植物的水分散失率低于受体植物；
(7)转基因植物的细胞死亡率低于受体植物；
(8)转基因植物的存活率高于受体植物；
(9)转基因植物的总生物量高于受体植物。
上述方法中，所述提高受体植物中SiNADP-ME3蛋白质的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达SiNADP-ME3蛋白质；
所述过表达的方法为将SiNADP-ME3蛋白质的编码基因导入受体植物；
所述SiNADP-ME3蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。
在本发明的实施例中，所述SiNADP-ME3蛋白质的编码基因通过含有SiNADP-ME3基因表达盒的SiNADP-ME3基因重组表达载体导入所述受体植物中；
所述含有SiNADP-ME3基因表达盒的SiNADP-ME3基因重组表达载体为超表达载体pCAMBIA1304::35S::SiNADP-ME3；所述超表达载体pCAMBIA1304::35S::SiNADP-ME3为将序列1所示的SiNADP-ME3基因的CDS序列***pCAMBIA1304骨架载体的NcoI酶切位点中，且保持pCAMBIA1304骨架载体其他序列不变得到的载体。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述SiNADP-ME3基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
上述应用中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物可为拟南芥，所述拟南芥可为野生型拟南芥(哥伦比亚型)。
本发明在前期的研究中，利用谷子旱敏感材料An04与抗旱品种Yugu1间的转录组学分析数据，结合谷子抗旱性状全基因组关联分析，获得了一个与抗旱性相关的候选基因SiNADP-ME3。本发明首先构建了超表达载体pCAMBIA1304::35S::SiNADP-ME3，并利用农杆菌介导的花序侵染法将超表达载体pCAMBIA1304::35S::SiNADP-ME3转入野生型拟南芥，得到转SiNADP-ME3拟南芥。通过实验证明：转SiNADP-ME3拟南芥相较于野生型具有萌发早、根长长、叶面积大和花茎高等特点；水分生理研究实验结果表明转SiNADP-ME3拟南芥具有更高水分利用效率；抗性实验则表明转SiNADP-ME3拟南芥具有更高的植物抗旱性。转SiNADP-ME3拟南芥在充分浇水及干旱胁迫下均表现出更高的生物量积累。证明SiNADP-ME3在植物干旱胁迫下维持产量发挥着重要的作用，在作物抗旱和水分高效利用方面具有重要的实践意义，也为深入理解谷子耐旱性产生的机理提供了线索。
附图说明
图1为超表达载体pCAMBIA1304::35S::SiNADP-ME3的构建。
图2为转SiNADP-ME3拟南芥的筛选。图A为转SiNADP-ME3拟南芥的PCR检测结果；图B为转SiNADP-ME3拟南芥的qRT-PCR分析结果。
图3为转SiNADP-ME3拟南芥在正常水分供给下的表型分析。图A为8日龄转SiNADP-ME3拟南芥、野生型拟南芥(WT)和转空载体拟南芥(VC)的初生根长度比较；图B为18日龄转SiNADP-ME3拟南芥、野生型拟南芥(WT)和转空载体拟南芥(VC)的幼苗叶面积比较；图C为25-40日龄转SiNADP-ME3拟南芥、野生型拟南芥(WT)和转空载体拟南芥(VC)的平均茎伸长率比较；图D为8日龄转SiNADP-ME3拟南芥、野生型拟南芥(WT)和转空载体拟南芥(VC)的初生根长度的形态学比较；图E为18日龄转SiNADP-ME3拟南芥、野生型拟南芥(WT)和转空载体拟南芥(VC)的幼苗莲座叶的形态学比较；图F为在充分浇水的条件下生长的23日龄转SiNADP-ME3拟南芥、野生型拟南芥(WT)和转空载体拟南芥(VC)幼苗的生长形态。误差条表示平均值±SE(n＝30)；*表示在P≤0.05和**P≤0.01水平上的显着差异。
图4为转SiNADP-ME3拟南芥的脱水耐旱性分析。图A为3周龄的转SiNADP-ME3拟南芥、野生型拟南芥(WT)和转空载体拟南芥(VC)叶片在脱水处理0h、1h和6h的表型图；图B为在脱水6h后野生型拟南芥(WT)和转SiNADP-ME3拟南芥的离体叶的台盼蓝染色图；图C为在脱水处理6h后转SiNADP-ME3拟南芥、野生型拟南芥(WT)和转空载体拟南芥(VC)的离体植株失水率。
图5为转SiNADP-ME3拟南芥的干旱胁迫实验。图A为在土壤中生长的转SiNADP-ME3拟南芥、野生型拟南芥(WT)和转空载体植株(VC)的耐旱表型；图B为复水后转SiNADP-ME3拟南芥、野生型拟南芥(WT)和转空载体植株(VC)的存活率；图C为干旱处理后转SiNADP-ME3拟南芥、野生型拟南芥(WT)和转空载体植株(VC)的总生物量。
图6为SiNADP-ME3基因的表达模式。图A为孕穗期SiNADP-ME3基因qRT-PCR分析结果；图B为抽穗期SiNADP-ME3基因qRT-PCR分析结果；图C为孕穗期SiNADP-ME3基因RT-PCR分析结果；图D为抽穗期SiNADP-ME3基因RT-PCR分析结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的谷子品种豫谷1号(Yugu1)在记载于文献“胡咸廷.豫谷1号[J].新农业,1985,(05):25.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pCAMBIA1304骨架载体是普如汀生物技术(北京)有限公司的产品，产品目录号为Biovectorpcambia1304。
下述实施例中的根癌农杆菌GV3101是北京天恩泽生物技术有限公司的产品，产品目录号为140384-10。
实施例1、转SiNADP-ME3拟南芥的获得及抗逆性分析
一、转SiNADP-ME3拟南芥的获得
1、pCAMBIA1304::35S::SiNADP-ME3超表达载体的构建
将序列1所示的SiNADP-ME3基因的CDS序列***pCAMBIA1304骨架载体的NcoI酶切位点中，得到pCAMBIA1304::35S::SiNADP-ME3超表达载体。pCAMBIA1304::35S::SiNADP-ME3超表达载体表达SiNADP-ME3蛋白，SiNADP-ME3蛋白的氨基酸序列如序列2所示。
2、重组菌的制备
将pCAMBIA1304::35S::SiNADP-ME3超表达载体转入根癌农杆菌GV3101中，得到重组菌pCAMBIA1304::35S::SiNADP-ME3/GV3101。
将pCAMBIA1304转入农杆菌根癌农杆菌GV3101中，得到重组菌pCAMBIA1304/GV3101。
3、转SiNADP-ME3拟南芥的获得及鉴定
利用农杆菌介导的花序侵染法用重组菌pCAMBIA1304::35S::SiNADP-ME3/GV3101侵染野生型拟南芥(哥伦比亚型)进行遗传转化，收集转基因T0代种子并播种于含有60mg/L潮霉素的1/2MS筛选培养基中，大约2周左右观察发现多数种子不能萌发或发芽后叶片白化生长受到抑制，只有极少数植株生长态势良好，将健康株系转移至营养钵内继续培养，并利用PCR方法检测阳性转基因植株。按株系收获T1代转基因种子，然后进一步分株系进行繁殖培养，直至获取T3代转基因植株种子。
按照上述方法利用农杆菌介导的花序侵染法用重组菌pCAMBIA1304/GV3101侵染野生型拟南芥(哥伦比亚型)进行遗传转化，得到转空载体拟南芥。
PCR检测阳性转基因植株方法如下：提取转基因植株的基因组DNA，采用pC1304F：ACGCACAATCCCACTAT和pC1304RAGAGGGTGAAGGTGAT引物进行PCR扩增，扩增得到大小为1938bp的植株为阳性转SiNADP-ME3拟南芥。部分阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系的PCR检测结果如图2A所示。从图中可以看出：阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系#35、#40、#49均可以扩增出目的条带，而野生型拟南芥没有扩增出条带。
4、转SiNADP-ME3拟南芥的SiNADP-ME3表达量检测
为了检测SiNADP-ME3在转SiNADP-ME3拟南芥株系中的遗传稳定性，提取T3代阳性转SiNADP-ME3拟南芥RNA，以反转录获得的cDNA模板进行实时荧光qRT-PCR检测。同时以SiNADP-ME3基因在拟南芥中的同源基因AtNADP-ME3(At1g79750)为参照基因，Actin为内参基因分析过表达植株的表达量。引物序列如下：
SiNADP-ME3-F：CTCAAGGACAAGGGCAAGATCC；
SiNADP-ME3-R：GGCCAATGTAGAACTCGTCGTT；
AtNADP-ME-F：TTTGATCATGTCCGGTGCCATT；
AtNADP-ME-R：AGATTCGATGCCAGTCCGAGTT。
结果如图2B所示。结果表明：在以Actin为内参基因和AtNADP-ME3为参照基因的对比下，SiNADP-ME3基因在阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系#35、#40、#49中均有较高的表达量，说明SiNADP-ME3已成功整合到拟南芥染色体上并能遗传到子代中。
选取阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系#35、#40、#49用于下述抗逆性分析实验。
二、转SiNADP-ME3拟南芥的抗逆性分析
1、根长、叶片面积及茎伸长率检测
在充分浇水条件下，将阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系#35、#40、#49、转空载体拟南芥(VC)和野生型拟南芥(WT)的种子同时播种于1/2MS培养基中。种子萌发后8d，比较阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系#35、#40、#49、转空载体拟南芥、野生型拟南芥幼苗的初生根长。然后分别将幼苗移入土中，比较萌发后18d的幼苗叶面积，拟南芥萌发生长25天后，首次测量花茎高度，然后每隔3天测量同一植株的花茎高度，每个株系至少测量10株，重复3次。平均茎伸长率＝(萌发n天后花茎高度－萌发(n-3)天后花茎高度)/3。
结果如图3所示。结果表明：在充分浇水的条件下，转空载体拟南芥(VC)的生长状态和野生型拟南芥(WT)没有显著性差异(初生根长、叶面积和茎伸长率统计数据经t检验后，P值大于0.1，无显著性差异)。阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系#35、#40、#49在发芽期、幼苗生长期、抽薹期和成熟期均都表现较明显的生长优势。其中，阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系#35、#40、#49的根长均比转空载体拟南芥(VC)和野生型拟南芥(WT)长(图3A和图3D)。将幼苗移入土中后，阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系#35、#40、#49均表现出较大的总叶面积(图3B和图3E)，阳性转SiNADP-ME3植株的叶片面积是野生型拟南芥和转空载体拟南芥的2-2.5倍。而且在拟南芥抽薹时间上，阳性转SiNADP-ME3拟南芥在萌发22天后抽薹，野生型拟南芥萌发24天后抽薹，阳性转SiNADP-ME3拟南芥要比野生型提前1-2天。在生长前期(萌发后24-37d)阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系#35、#40、#49的平均茎伸长率均高于野生型拟南芥和转空载体拟南芥，均有较快的生长速率(图3C和图3F)，在萌发后37d时，转SiNADP-ME3拟南芥的花茎高度为29.3-31.6cm，而野生型拟南芥的花茎高度为23.4-25.6cm。
2、水分胁迫的耐受性检测
(1)脱水处理
为了进一步探究阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系对水分胁迫的耐受性，将发芽后生长3周的野生型拟南芥、转空载拟南芥以及阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系#35、#40、#49放置于干燥的滤纸上在干旱培养箱(温度为25℃，湿度为30％，光照强度为150μmoL·m-2·s-1，光照周期为16h光照/8h黑暗的)内进行脱水处理试验，分别在脱水处理1h、3h和6h后检测植株的失水程度。
结果如图4所示。结果表明：随着处理时间的增长，野生型拟南芥和转空载拟南芥叶片的萎蔫速度更快，而阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系#35、#40、#49水分散失较慢，保水性较强，当脱水处理时间达到6h后，野生型拟南芥的叶片萎蔫更加严重(图4A)。
(2)台盼蓝染色
对脱水处理6h后的植株叶片进行台盼蓝染色。具体步骤如下：将脱水处理6h后的各株系植物进行台盼蓝染色，鉴定细胞膜的破坏程度。台盼蓝染液配方：1mL的乳酚溶液加入2.5mg曲利苯蓝，50mL乳酚溶液体系即25％乳酸、23％水溶苯酚、25％甘油，无菌水定容至50mL。将待检测的株系分别放入台盼蓝染液中沸水浴10min，室温染色12h后，2.5mg/mL的水合氯醛脱色3-4d，期间需要更换脱色液，脱色后观察是否有蓝斑，并照相留证。染色后的叶片可在50％的甘油中保存。
结果表明：野生型拟南芥和转空载体拟南芥的颜色均比阳性转SiNADP-ME3拟南芥深，说明野生型拟南芥和转空载体拟南芥的细胞死亡率均高于阳性转SiNADP-ME3拟南芥(图4B)。
(3)水分散失率
由于阳性转SiNADP-ME3拟南芥相较于同时期的野生型拟南芥有较强的生长优势，采取面积失水率的计算方式排除叶片面积的大小对于失水率的影响计算水分散失率。具体步骤如下：将在正常条件下生长3周的阳性转SiNADP-ME3拟南芥、野生型拟南芥和转空载拟南芥整株剪下后放在装有干燥的滤纸的培养皿内称重并拍照测量植株的表面积；将样品连同培养皿一起放置在温度为21-25℃，湿度为45-50％的培养箱内，在指定的时间内称重并拍照。植株的叶片面积失水率＝(植株鲜重－风干后重量)/(风干时间×叶片面积)。
结果表明：阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系#35、#40、#49的水分散失率均低于野生型拟南芥和转空载拟南芥(图4C)。
上述结果表明：阳性转SiNADP-ME3拟南芥确实可以提高其耐旱能力。
3、抗旱性检测
将在1/2MS培养基上正常条件下萌发生长10d的野生型拟南芥、转空载拟南芥以及阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系#35、#40、#49的幼苗移栽到营养土中，恢复生长2d。然后将幼苗移入温度为25℃，湿度为30％，光照强度为150μmoL·m-2·s-1，光照周期为16h光照/8h黑暗的干旱培养箱中生长。干旱处理15d后，观察植株的生长状态。复水8d后统计植株的存活率和生物量。生物量的计算方法为：取成熟后相同株数的植株烘干后称重，所得重量即为总生物量。
结果表明：干旱处理15d后所有野生型拟南芥和转空载体拟南芥叶片均出现严重的萎蔫和枯死，而阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系#35、#40、#49均只少数叶片出现干枯的现象(图5A)，同时发现阳性转SiNADP-ME3植株相较于野生型拟南芥和转空载体拟南芥的生长状态有明显的优势。所有植株复水处理8d后，阳性转SiNADP-ME3拟南芥株系#35、#40、#49的存活率均显著高于野生型植株(图5B)，能够很快恢复生长，并能正常开花结果，形成的总生物量更大(图5C)。
综上所述，转SiNADP-ME3拟南芥相较于野生型拟南芥具有萌发早、根长长、叶面积大和花茎高等特点；水分生理研究实验结果表明阳性转SiNADP-ME3拟南芥具有更高水分利用效率；抗性实验则表明阳性转SiNADP-ME3拟南芥具有更高的植物耐旱性。转SiNADP-ME3拟南芥在充分浇水及干旱胁迫下均表现出更高的生物量积累。证明SiNADP-ME3在植物干旱胁迫下维持产量发挥着重要的作用。
实施例2、SiNADP-ME3基因在谷子中的组织特异性表达
为了验证SiNADP-ME3基因在谷子中的组织特异性表达特征，采用实时荧光qRT-PCR和半定量RT-PCR的方法分析Yugu1在正常生长条件下孕穗期以及抽穗期SiNADP-ME3基因的组织特异性表达。具体步骤如下：
1、植物组织RNA的提取
用Trizol(Cat no.15596-026，Invitrogen，Scotland，UK)法提取组织(根、茎、叶和穗)RNA，然后用Purelink RNA Kit(Cat no.12183018，Invitrogen，Scotland，UK)进行纯化，去除杂质及DNA片段。具体步骤如下：
(1)将研钵、研杵、剪刀和镊子等提取RNA专用工具至于托盘内，淋上95％酒精火中煅烧约5min中，除去RNase，稍冷却后浸入液氮中预冷。RNA提取专用操作台先用75％的酒精擦拭干净后喷洒RNase Zap除去RNase。整个RNA提取操作过程中需穿洁净实验服，戴手套和口罩，避免唾液和汗液中的RNase进入样品使RNA被降解。
(2)快速称取0.1-0.15g叶片或其他组织，放入盛有液氮的研钵中迅速冷冻，待其变脆后快速研磨1-2次，使材料破碎成粉状，研磨充分。过程中需不断补充液氮以保持低温，降低RNA的降解。
(3)将研磨充分的材料转移到已经加入1mL Trizol试剂的2mL RNase-free离心管中，充分振荡后至于冰上，待所有样品加入Trizol后，涡旋振荡15s，室温静置5min。
(4)每1mL的Trizol加200μL的氯仿，涡旋振荡15s，室温放置2-3min，4℃12000rpm条件下离心15min。
(5)转移上清液到新的1.5mL RNase-free的离心管中，加等体积70％酒精，充分混匀并使产生的沉淀溶解。
(6)吸取700μL混匀的样品加入Pure Link RNA Mini Kit试剂盒的柱子中，室温12000rpm离心15s，重复3-4次，直至所有样品过完柱子。
(7)向过滤柱中加入700μL WBⅠ室温12000rpm离心15s，清洗柱子，弃去滤液。
(8)向过滤柱中加入500μL WBⅡ室温12000rpm离心15s，清洗柱子，弃去滤液，重复操作一次，室温12000rpm离心2min，使柱子干燥。
(9)将过滤柱转移至新的1.5mL RNase-free的离心管中，加入30-100μLRNase-free water，室温放置1min，溶解RNA。
(10)室温12000rpm离心2min，收集RNA。提取的RNA可立即反转成cDNA，-20℃保存，也可直接放于-80℃保存。
(11)取少量RNA用NANODROP 1000测定样品的OD260、OD280、OD320、OD260/OD280及其浓度进行鉴定。只有RNA样品的OD260/OD280比值在1.9-2.1之间，OD260/OD230比值≥2.0，才能用于后续试验。
(12)用1％琼脂糖凝胶电泳，快速电泳检测RNA质量。高质量的RNA应具有28S和18S两条明亮且清晰的带，并且28S的亮度是18S的两倍以上。
2、RNA反转成cDNA
使用TaKaRa Primer ScriptⅡ1st Stand cDNA synthesis Kit(Cat no.6210A，Takara，Otsu Shiga，Japan)反转录试剂盒，将RNA反转成cDNA。具体步骤如下：
(1)在200μL的RNase-free离心管中加入下列试剂：oligo dT(500μg/mL)1μL、dNTPMixture 1μL、总RNA 5μg、RNase Free dH2O至总体积为10μL。
(2)离心管放置于PCR上，65℃反应5min，然后于冰上迅速冷却。
(3)在上述离心管中加入以下反应液：5×Prime Script TM Buffer 4μL、RNaseInhibitor(40U/μL)0.5μL(20U)、Prime Script TM Rtase(200U/μL)1μL(200U)、RNaseFree dH2O 4.5μL。
(4)将离心管放置于PCR仪上，按照42℃反应40min，70℃反应15min，4℃停止反应的程序反转成cDNA，将反转成功的cDNA稀释10倍后放置于-20℃保存。
3、通过qRT-PCR的方法检测SiNADP-ME3基因表达量差异性
(1)根据SiNADP-ME3基因的CDS序列使用NCBI引物设计网页设计引物，并用常规PCR的方法检测引物的保守性，选择扩增片端单一的引物。引物序列如下：
Seita.3G109300：CGCATCCTTCCATCTGTA和CCATCTCCGACGACATAT；
Actin：TATGGGTCATCAACAGCTTGTC和GTAGTCCCTCGTGATGAGATCC。
(2)使用FastStart Universal SYBR Green Master kit(Cat no.04913914001，Roche，Mannheim，Germany)进行qRT-PCR实验，将配置好体系加入标准96孔qRT-PCR板。
(3)用AppLied Biosystems 7300 analyzer(AppLied Biosystems，Foster City，CA，USA)荧光定量PCR仪器运行qRT-PCR程序。qRT-PCR每个样品均进行三次独立实验重复。反应体系如表1。
表1、PCR反应体系
反应液成分 体积 最终浓度
FastStart UniversaL SYBR 25.0μL 1×
Primers:F+R(30μM) 各0.5μL 300nM
cDNA(100ng/μL) 5μL 200ng
ddH<sub>2</sub>O 19μL
表2、PCR反应程序
程序名称 温度 时间
预变性 95℃ 2min
变性 95℃ 1min
退火 60℃ 1min
延伸 72℃ 1min
总延伸 72℃ 7min
4、通过RT-PCR的方法检测SiNADP-ME3基因特异性表达
使用上述设计的荧光引物，以Yugu1品种抽穗期的根、茎、叶和穗的cDNA为模板检测SiNADP-ME3基因的特异性表达，首先用Actin引物将各组织的模板亮度调成一致，记录此时各组织模板的用量，然后再用SiNADP-ME3基因引物扩增各组织模板。KOD FX酶(CodeNo.KFX-101TOYOBO Japan)反应体系及程序如表3和表4所示。
表3、PCR扩增体系
成分 加入量
DNA模板 nμL
2×Prime GC Buffer 12.5μL
Primer F/R 各0.75μL
2Mm dNTP 5μL
KOD Fx酶 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O up to 25μL
表4、PCR反应程序
Figure BDA0001377972270000111
Figure BDA0001377972270000121
(注：循环数为30个循环)
结果如图6所示。图A和图B分别为孕穗期和抽穗期的qRT-PCR检测结果：由图可看出在孕穗期，SiNADP-ME3基因在茎部具有较高的表达量；而在抽穗期，该基因在茎部中有较高的表达量；图C和图D分别为孕穗期和抽穗期的RT-PCR检测结果：在孕穗期，SiNADP-ME3基因在茎部有较高的表达量，而在抽穗期，该基因在根部中有较高的表达量。总体来看，SiNADP-ME3基因在根和茎中都有较高的表达量。根系和茎是作为吸收和传输矿质元素水分等的主要组织，SiNADP-ME3基因大量表达可以调控其细胞的渗透势、pH和离子吸收平衡等，在逆境胁迫时帮助植物体抵御逆境胁迫，提高植物抗逆性。
序列表
<110>中国农业科学院作物科学研究所
<120>蛋白质SiNADP-ME3及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用
<160>2
<210>1
<211>1731bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
atgtcgtcgg agatggagat ggctggcggc ggcgtcgagg acgcgtacgg cgaggaccgc 60
gccaccgagg agcatctcgt cacgccgtgg gccttctccg tcgccagcgg ctacaccctg 120
ctccgcgacc cgcggcacaa caagggcctg gccttctcgg aggcggagcg caacgcgcac 180
tacctgcgcg gcctgctccc gcccgcgctg gcgtcgcagg agctccagga gaagaagatc 240
atgcacaacc tgcgccagta cacggtgccc ctgcagcgct acatcgccat gatggacctg 300
caggagcgca acgagcgtct cttctacaag ctcctcatcg acaacgtcga ggagctgctc 360
cccgtcgtct acacgcccac cgtcggcgag gcgtgccaga agtacggcag catctacagg 420
cgcccgcagg ggctctacat cagcctcaag gacaagggca agatccttga ggtgctcaag 480
aactggccgg agaggagcat ccaggtcatc gtcgtcaccg acggcgagcg catcctgggg 540
ctcggggacc tgggctgcca ggggatgggg atccccgttg gcaagctgtc tctctacacc 600
gccctcggag gcgttcgccc atccgcttgc ctgccgatca caatcgatgt tggcaccaac 660
aacgagacct tgctcaacga cgagttctac attggcctcc gccaaagacg tgccaccggc 720
caggaatacc acgagcttct cgaagagttc atgaccgccg tcaagcaaaa ctacggcgag 780
aaagtcctaa cccagttcga ggactttgcc aaccacaatg cttttgactt gcttgccaag 840
tacagcaaga gccatctcgt gttcaacgac gatatccagg gaacagcctc ggtggtcctc 900
gcaggtctct tggcggcgct caaggtggtc ggtggcactc ttgctgacca cacctacctg 960
ttccttggtg ccggcgaggc tggaactggt attgctgacc tcattgctct tgagatgtca 1020
aaacattcgg agactccgat cgacgattgc cgcaagaaga tctggcttgt ggactccaag 1080
ggcctgatcg tggagtcgcg caaggagtcg ctgcagcact tcaagcagcc gtgggcgcac 1140
gatcacgagc ccctcaagac cctgctggag gccgtggagt ccatcaagcc gacggtgctg 1200
atcggcacct ccggcgtggg ccgcaccttc accaaggagg tggtggaggc catggcgtcc 1260
ttcaacgaga ggcccgtcat cttcgcgctg tccaacccga cgtcgcactc ggagtgcacg 1320
gcggaggagg cttacacctg gtcccagggc cgcgccgtgt tcgccagcgg cagccccttc 1380
gacgccgtcg agcacgaagg caaggtgtac gtgccggggc agtccaacaa cgcctacata 1440
ttccctgggt tcggcctcgg cgtggtcatc tccggcgcca tccgcgtcca cgacgacatg 1500
ctgctggcgg cgtcggaggc gctggcggag caggtcaccg acgagcactt cgccaagggg 1560
ctcatcttcc cgccgttcac caacatccgc accatctcgg cgcgcatcgc cgccaaggtg 1620
gccgaaaagg cctacgagct cggcctcgcc agccgcctgc cgcgccccga cgaccttgtc 1680
aagtacgccc agagctgcat gtacacccca acctaccgca gctaccggta a 1731
<210>2
<211>576
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
Met Ser Ser Glu Met Glu Met Ala Gly Gly Gly Val Glu Asp Ala Tyr
1 5 10 15
Gly Glu Asp Arg Ala Thr Glu Glu His Leu Val Thr Pro Trp Ala Phe
20 25 30
Ser Val Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Leu Arg Asp Pro Arg His Asn Lys
35 40 45
Gly Leu Ala Phe Ser Glu Ala Glu Arg Asn Ala His Tyr Leu Arg Gly
50 55 60
Leu Leu Pro Pro Ala Leu Ala Ser Gln Glu Leu Gln Glu Lys Lys Ile
65 70 75 80
Met His Asn Leu Arg Gln Tyr Thr Val Pro Leu Gln Arg Tyr Ile Ala
85 90 95
Met Met Asp Leu Gln Glu Arg Asn Glu Arg Leu Phe Tyr Lys Leu Leu
100 105 110
Ile Asp Asn Val Glu Glu Leu Leu Pro Val Val Tyr Thr Pro Thr Val
115 120 125
Gly Glu Ala Cys Gln Lys Tyr Gly Ser Ile Tyr Arg Arg Pro Gln Gly
130 135 140
Leu Tyr Ile Ser Leu Lys Asp Lys Gly Lys Ile Leu Glu Val Leu Lys
145 150 155 160
Asn Trp Pro Glu Arg Ser Ile Gln Val Ile Val Val Thr Asp Gly Glu
165 170 175
Arg Ile Leu Gly Leu Gly Asp Leu Gly Cys Gln Gly Met Gly Ile Pro
180 185 190
Val Gly Lys Leu Ser Leu Tyr Thr Ala Leu Gly Gly Val Arg Pro Ser
195 200 205
Ala Cys Leu Pro Ile Thr Ile Asp Val Gly Thr Asn Asn Glu Thr Leu
210 215 220
Leu Asn Asp Glu Phe Tyr Ile Gly Leu Arg Gln Arg Arg Ala Thr Gly
225 230 235 240
Gln Glu Tyr His Glu Leu Leu Glu Glu Phe Met Thr Ala Val Lys Gln
245 250 255
Asn Tyr Gly Glu Lys Val Leu Thr Gln Phe Glu Asp Phe Ala Asn His
260 265 270
Asn Ala Phe Asp Leu Leu Ala Lys Tyr Ser Lys Ser His Leu Val Phe
275 280 285
Asn Asp Asp Ile Gln Gly Thr Ala Ser Val Val Leu Ala Gly Leu Leu
290 295 300
Ala Ala Leu Lys Val Val Gly Gly Thr Leu Ala Asp His Thr Tyr Leu
305 310 315 320
Phe Leu Gly Ala Gly Glu Ala Gly Thr Gly Ile Ala Asp Leu Ile Ala
325 330 335
Leu Glu Met Ser Lys His Ser Glu Thr Pro Ile Asp Asp Cys Arg Lys
340 345 350
Lys Ile Trp Leu Val Asp Ser Lys Gly Leu Ile Val Glu Ser Arg Lys
355 360 365
Glu Ser Leu Gln His Phe Lys Gln Pro Trp Ala His Asp His Glu Pro
370 375 380
Leu Lys Thr Leu Leu Glu Ala Val Glu Ser Ile Lys Pro Thr Val Leu
385 390 395 400
Ile Gly Thr Ser Gly Val Gly Arg Thr Phe Thr Lys Glu Val Val Glu
405 410 415
Ala Met Ala Ser Phe Asn Glu Arg Pro Val Ile Phe Ala Leu Ser Asn
420 425 430
Pro Thr Ser His Ser Glu Cys Thr Ala Glu Glu Ala Tyr Thr Trp Ser
435 440 445
Gln Gly Arg Ala Val Phe Ala Ser Gly Ser Pro Phe Asp Ala Val Glu
450 455 460
His Glu Gly Lys Val Tyr Val Pro Gly Gln Ser Asn Asn Ala Tyr Ile
465 470 475 480
Phe Pro Gly Phe Gly Leu Gly Val Val Ile Ser Gly Ala Ile Arg Val
485 490 495
His Asp Asp Met Leu Leu Ala Ala Ser Glu Ala Leu Ala Glu Gln Val
500 505 510
Thr Asp Glu His Phe Ala Lys Gly Leu Ile Phe Pro Pro Phe Thr Asn
515 520 525
Ile Arg Thr Ile Ser Ala Arg Ile Ala Ala Lys Val Ala Glu Lys Ala
530 535 540
Tyr Glu Leu Gly Leu Ala Ser Arg Leu Pro Arg Pro Asp Asp Leu Val
545 550 555 560
Lys Tyr Ala Gln Ser Cys Met Tyr Thr Pro Thr Tyr Arg Ser Tyr Arg
565 570 575

Claims (3)

1.如下任一所述生物材料在提高植物抗逆性中的应用：
所述生物材料为下述A1）至A9）中的任一种：
A1）蛋白质，氨基酸序列如序列2所示；
A2）编码A1）所述的蛋白质的核酸分子；
A3）含有A2）所述核酸分子的表达盒；
A4）含有A2）所述核酸分子的重组载体；
A5）含有A3）所述表达盒的重组载体；
A6）含有A2）所述核酸分子的重组微生物；
A7）含有A3）所述表达盒的重组微生物；
A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物；
含有A5）所述重组载体的重组微生物；
所述抗逆性为抗旱性；所述植物为双子叶植物。。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：A2）所述核酸分子为序列1所示的DNA分子。
3.一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中A1）所述的蛋白质的含量，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物；所述提高受体植物中权利要求中1所述的蛋白质的含量的方法为在受体植物中过表达权利要求1中所述的蛋白质；所述过表达的方法为将权利要求1中所述的蛋白质的编码基因导入受体植物；
所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子；
所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物体现在如下（1）-（9）中任一种：
（1）转基因植物的叶片面积高于受体植物；
（2）转基因植物的根长长于受体植物；
（3）转基因植物的茎伸长率和/或生长速率高于受体植物；
（4）转基因植物的花茎高度高于受体植物；
（5）转基因植物的抽薹时间早于受体植物；
（6）转基因植物的水分散失率低于受体植物；
（7）转基因植物的细胞死亡率低于受体植物；
（8）转基因植物的存活率高于受体植物；
（9）转基因植物的总生物量高于受体植物；
所述抗逆性为抗旱性；所述植物为双子叶植物。
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