CN113444736A - GhbHLH122基因在调控植物开花中的应用 - Google Patents

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喻树迅
王寒涛
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Abstract

本发明提供了一种GhbHLH122基因在调控植物开花中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，GhbHLH122基因在提高促进植物开花中得以应用，植物包括棉花和拟南芥；本发明从荧光定量结果证实GhbHLH122基因在转基因植株中转录水平极显著高于非转基因拟南芥，故转基因拟南芥提前开花。因此，转基因拟南芥中开花相关基因的表达量极显著高于非转基因拟南芥，表明GhbHLH122基因在促进棉花开花方面可能具有关键作用，可以作为短季棉培育的有利基因资源。

Description

GhbHLH122基因在调控植物开花中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种GhbHLH122基因在调控植物开花中的应用。
背景技术
棉花作为重要的经济作物，纺织及化工等领域的重要原材料，在世界经济中占有举足轻重的地位。我国人口众多，可耕作土地面积相对较少，增加复种指数，提高土地利用率，始终是农业生产的主题之一。通过转基因技术创制早熟新材料，进一步培育熟性早、抗逆性强、株型紧凑、适合机械化的棉花品种，推进我国长江和黄河流域棉花的麦(油)后直播，提高长江和黄河流域棉区的复种指数，对加快我国棉花产业的转型升级具有重要意义。
bHLH(basic helix-loop-helix，碱性螺旋-环-螺旋)转录因子是植物中一类重要转录因子。bHLH超家族成员具有两个高度保守且功能不同的结构域，即碱性区域(basicregion)和螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，HLH)。在植物体内，bHLH转录因子主要参与植物的生长发育、非生物胁迫响应、种子萌发、花的形态建成等过程。植物的bHLH转录因子的研究相对较晚，1989年首次报到了一个从玉米R家族中分离得到的与花青素合成有关的bHLH转录因子，后来在矮牵牛花中又克隆到同源基因，R基因在植物体内不同组织中调节花青素生物合成相关的基因的表达。bHLH家族PIF4蛋白可直接激活FT的表达，同时受温度调节的组蛋白异构体H2A.Z通过结合FT基因的启动子，间接调节PIF4在FT基因启动子的结合。bHLH蛋白调控开花途径机制为：温度上升，FT基因启动子上的H2A.Z的核小体与DNA分离，转录因子PIF4与FT启动子结合，激活FT的表达，促进植株开花。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供GhbHLH122基因在调控植物开花中的应用。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
第一方面，本发明提供了一种GhbHLH122基因在调控植物开花中的应用。
优选地，GhbHLH122基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，GhbHLH122基因编码多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，GhbHLH122基因在提高促进植物开花中的应用。
优选地，植物包括棉花和拟南芥。
第二方面，本发明提供了一种重组质粒，该重组质粒含有GhbHLH122基因片段，其开放阅读框具有如SEQ ID NO.3所示的序列。
第三方面，本发明提供了一种重组载体，其包括GhbHLH122基因和载体。
优选地GhbHLH122基因的开放阅读框具有如SEQ ID NO.3所示的序列。
优选地，载体为pBI121。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明从荧光定量结果证实GhbHLH122基因在转基因植株中转录水平极显著高于非转基因拟南芥，故转基因拟南芥提前开花。因此，转基因拟南芥中开花相关基因的表达量极显著高于非转基因拟南芥，表明GhbHLH122基因在促进棉花开花方面可能具有关键作用，可以作为短季棉培育的有利基因资源。
附图说明
图1为本发明的T1代转基因拟南芥株系的PCR检测结果示意图。
图2为本发明的T3代转基因拟南芥株系的荧光定量鉴定结果示意图(WT为非转基因拟南芥，6、7和8为三个转基因拟南芥株系)。
图3为本发明的T3代转基因拟南芥株系的表型鉴定示意图(WT为非转基因拟南芥，6、7和8为三个转基因拟南芥株系)。
具体实施方式
本发明提供了一种GhbHLH122基因在调控植物开花中的应用。
实验材料
1.棉花材料
本实验选取的棉花材料为陆地棉TM-1，拟南芥材料为哥伦比亚野生型(WT)。均种植于温室内，管理措施为正常实验室管理。
2.试剂和耗材
酶及试剂盒：高保真酶、胶回收试剂盒、RNA反转录试剂盒购自宝生物工程大连有限公司；质粒少量提取试剂盒、
Figure BDA0003225732360000021
II One Step Cloning Kit试剂盒购自Vazyme公司；限制性内切酶(BamH I、Sac I)购自NEB公司；植物总RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；荧光定量UItraSYBR Mixture(Low ROX)购自康为世纪生物科技公司。
其他药品：琼脂糖为西班牙原装产品，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯，氨苄青霉素等购自宝生物工程(大连)有限公司，大肠杆菌感受态细胞DH5α购自北京擎科生物科技公司。
培养基：LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L。
LB固体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L、琼脂粉15g/L，定容至1L。
LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板；1/2MS固体培养基：1/2MS 22g/L，琼脂粉(agar powder)8g/L，蔗糖(sucrose)30g/L。
主要仪器：PCR扩增仪(BIO-RAD)，高速离心机(Hettich MIKRO 200R)、电泳设备(BIO-RAD)、凝胶成像***(BIO-RAD)、荧光定量PCR仪(ABI7500)、电热恒温培养箱(上海森信)、恒温培养振荡器(上海智城)、人工气候试验箱(赛福)、人工气候室。
实施例1：
棉花GhbHLH122基因的生物信息学分析与克隆
从CottonFGD上获得GhbHLH122(Gh_D05G0688)的基因序列，采用Oligo 7软件设计引物，采用PCR(Polymerase Chain Reaction)的方法从陆地棉TM-1中扩增，其CDS序列长1284bp，编码427个氨基酸，蛋白的相对分子量为47.12kDa，等电点为8.55。
扩增引物：
GhbHLH122F:5′-ATGGAGTCAGATCTTCAACAC-3′(SEQ ID NO.1)；
GhbHLH122R:5′-TTATTGCTGCCGCTGCTG-3′(SEQ ID NO.2)。
开放阅读框的序列(SEQ ID NO.3)为：
ATGGAGTCAGATCTTCAACACCACCACCACCATAATCTCTTTGACTATCATCAATCTCAACATAATCAAAAACAGATGAACTCTGGGTTGACGAGGTACCAATCTGCACCTAGTTCGTATTTTTCCAACATTCTGGACAGAGATTTCTGCCAAGAGATTTTAAATCGACCTTCCAGTCCCGAAACAGAACGAATCATCGCAAAGTTTTTGTCGAGTAGCGGTGATGCTGCCGGTGGCGGTGATGCTAATACGGAAACCATTCCATCGCAGAATCTTTGCACCGCTACGCAGAGTTCACCTGTTAGAGAAACACCTGTGAAAATCGAGCAGTCAGCGCAGATTATGACGCCAATTAATAATCAAACAGGGCTTATGCAGCAGCCTAAATATTCCTCTGCTTCCCAGAATTTTTATCAAAGCCAACCTCCACAGTATTTGCTAAATCAGCAACCATCAGCTTCAGCTATGGATTACACCACTCCAAATCCAACGGGGATGAAGATGGGTGGAGGCAACAATTCCAATCTTATTAGACACAGTAGCTCACCTGCAGGGTTATTCTCCAAAATTAACATTGAAAACATTGCAGGCTACGGAGTGATGCGGGGAATGGGAGATTATGGAAGCGTTAATAGCAGTAACAGAGAAGCAACGTTTCGTTCAGCAAGCAGGCCACCTACACCCTCTGGGCTGATGACTCCAATTGCGGAGATGGGGAACAAAAGTATGGGTCCATTTAGCTCCGAAAATGCTGGATTTGGTGAAAATCGTCCCAACAATTATTCCTCAGGGCTCCCGGTTACTTCTTGGGACGATTCCATGATGATTTCTGATAACATGTCAGGCATAAAAAGACTGAGGGAAGATGATAGATCACTTTCTGGCTTAGACGGAGCTGAAACTAAGAATGCAGATGGCGGCAACCATCGTCCGCCGCCACTTTTGGCTCATCACTTGAGTTTACCAAAAAGTTCAGATATGTCTGCCATTGAGAAGTTCCTGCAGTATCAGGATTCTGTTCCTTGTAAGATCCGGGCCAAAAGAGGCTGTGCCACTCACCCTAGAAGCATTGCTGAGAGGGTGAGAAGAACCAAAATAAGCGAGCGAATGAGGAAACTACAAGACCTTGTTCCAAACATGGATAAGCAAACAAACACTGCAGACATGCTAGATTTGGCCGTTGATTACATCAAAGACCTCCAGAAACAGGTCAAGTCACTGTCGGATAGTCGTGCAAAGTGTTCTTGTGCCGCACAGCAGCAGCAGCAGCAGCGGCAGCAATAA。
编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)为：
MESDLQHHHHHNLFDYHQSQHNQKQMNSGLTRYQSAPSSYFSNILDRDFCQEILNRPSSPETERIIAKFLSSSGDAAGGGDANTETIPSQNLCTATQSSPVRETPVKIEQSAQIMTPINNQTGLMQQPKYSSASQNFYQSQPPQYLLNQQPSASAMDYTTPNPTGMKMGGGNNSNLIRHSSSPAGLFSKINIENIAGYGVMRGMGDYGSVNSSNREATFRSASRPPTPSGLMTPIAEMGNKSMGPFSSENAGFGENRPNNYSSGLPVTSWDDSMMISDNMSGIKRLREDDRSLSGLDGAETKNADGGNHRPPPLLAHHLSLPKSSDMSAIEKFLQYQDSVPCKIRAKRGCATHPRSIAERVRRTKISERMRKLQDLVPNMDKQTNTADMLDLAVDYIKDLQKQVKSLSDSRAKCSCAAQQQQQQRQQ。
具体克隆基因的过程为：
1.取样方法
在棉花的盛花期，取成熟的棉花叶片，速冻于液氮，存于-80°冰箱备用。
2.RNA的提取
以下所有离心步骤均在室温下进行。
1)匀浆处理:100mg植物叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入700μl的裂解液SL(使用前加入β-巯基乙醇)，立即剧烈震荡使样品混匀。注意1：对于预期RNA得率小于10μg的植物样本，请使用100mg的起始样本量；对于富含淀粉的样本或成熟叶片，请将裂解液SL用量增加至700μl。注意2：由于植物多样性非常丰富，而且同种植物的不同生长发育阶段和不同组织的RNA含量都不相同，请根据具体实验情况选择合适的植物材料的用量；
2)12,000rpm离心2min；
3)将上清液转移至过滤柱CS上，12,000rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头避免接触收集管中的细胞碎片；
4)加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，将混合物转入吸附柱CR3中，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
5)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
6)DNaseI工作液：取10μl的DNaseI储存液和70μl的RDD溶液轻柔混匀；
7)向CR3中加入80μl的DNaseI工作液，室温静止15min；
8)静置完后，向CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
9)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前加入乙醇)，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
10)重复步骤9)；
11)12,000rpm(-13,400×g)离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μl的RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm(-13,400×g)离心1min，得到RNA溶液。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。RNA样品请在-70℃中保存。如果预期RNA得率大于30μg，可将步骤11中离心得到的RNA溶液再加入吸附柱CR3中，室温放置2min，12,000rpm(-13,400×g)离心1min，得到RNA溶液。
为预防RNase污染，注意事项：
1)经常更换新手套，因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染；
2)使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染；
3)RNA在裂解液SL中时不会被RNase降解，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿；
4)配制溶液应使用RNase-Free ddH2O。
3.反转录
RNA的反转录方法参照采用TaKaRa的反转录试剂盒DRR037A的说明书进行，RT的反应液的配置在冰上进行，具体操作如下：
Figure BDA0003225732360000051
反转录反应条件如下:
37℃15min(反转录反应)，
85℃5s(反转录酶的失活反应)，
500ng RNA反转录为cDNA，将反转录产物cDNA溶液稀释8倍作为PCR反应模板。
4.基因克隆的PCR反应体系、程序和产物检测
1)PCR反应体系
根据PrimeSTAR GXL DNA聚合酶说明书，PCR反应体系如下：
Figure BDA0003225732360000061
2)PCR反应程序
Figure BDA0003225732360000062
3)PCR产物的检测
取1μl的PCR产物，加入11μl 6×Loading Buffer，混匀，点样于1％琼脂糖凝胶，电泳检测。
5.PCR产物的胶回收
1)紫外灯下从电泳胶上切下所需回收的条带，注意刀片需消毒，胶块应尽量小，使之易融化完全；
2)事先将一个eppendorf管称重，然后将胶块放入后再次称重，获得胶块的重量；
3)以每100mg胶块加入300μl的量加入Binding Buffer，查看胶块是否浸在液体中；
4)56℃水浴10min以融化胶块释放DNA，期间每2-3min需取出震荡；
5)待胶块完全融化后按照每100mg胶块150μl的量加入异丙醇，充分震荡混匀；
6)将High Pure Filter Tube安装到Collection Tube上；
7)将所有eppendorf管中的液体转移到High Pure Filter Tube中去，注意不要超过700μl，若超过需分两次离心；
8)12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；
9)加入500μl Wash Buffer后再次离心1min；
10)倒掉收集管中的液体后再次加200μl的Wash Buffer，12000rpm离心1min；
11)小心将Filter Tube取下后装入一个新的eppendorf管上；
12)在滤芯的正中加上30μl的Elution Buffer，室温放置1min，12000rpm离心1min。
6.胶回收产物与克隆载体PMD-18T连接
1)在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μl
试剂 使用量
pMD18-T Vector*<sup>1</sup> 1μl
Insert DNA*<sup>3</sup> 0.1-0.3pmol
灭菌水 up to 5μl
2)加入5μl(等量)的Solution I；
3)16℃反应30min。
注)①室温(25℃)也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
②5min也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
③长片段PCR产物(2kb以上)进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时。
7.连接产物转化大肠杆菌
1)向连接反应体系中加入100μl大肠杆菌DH5a感受态，冰浴30min；
2)42℃水浴热激45s；
3)冰浴2min；加入900μl的LB液体培养基，37℃，150rpm，孵育1h；
4)离心收菌，4000rpm，3min，弃上层上清，留约100μl混匀后涂布含氨苄抗性的LB平板；
5)37℃，恒温培养过夜。
8.阳性克隆的检测及测序
1)从转化平板上挑取白色菌落，放入含有Amp的液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养8h；
2)菌落PCR验证阳性克隆，将验证正确的单克隆送到金维智生物科技有限公司测序，每个序列测3个重复。
9.阳性菌液的保存
菌液PCR验证且测序正确的菌液中加入一定量的甘油，使甘油终浓度在20％左右，-70℃保存。
实施例2：
PBI121-35S::GhbHLH122植物表达载体的构建
1.质粒提取及酶切
质粒提取采用vazyme公司质粒少量提取试剂盒，提取含有目的基因GhbHLH122片段的克隆载体质粒，质粒浓度经检测为220ng/μl，琼脂糖凝胶电泳检测，无蛋白污染，达到试验要求；同时提取过表达载体pBI121，选用内切酶BamH I和Sac I进行双酶切，酶切后纯化获得线性化的pBI121载体。
2.pBI121-35S::GhbHLH122过表达载体的构建
本试验载体构建采用
Figure BDA0003225732360000082
II One Step Cloning Kit试剂盒，该试剂盒适用于任意载体与任意基因片段的连接，反应时间仅需15min，要求***片段与线性化载体分别在5′端和3′端有15bp重叠区域。
扩增引物为：
OE-GhbHLH122F:5′-cgggggactctagaggatccATGGAGTCAGATCTTCAACAC-3′(SEQ IDNO.5)；
OE-GhbHLH122R:5′-gatcggggaaattcgagctcTTATTGCTGCCGCTGCTG-3′(SEQ IDNO.6)。
其操作程序如下：以目的基因GhbHLH122的克隆载体为模板，扩增后纯化***片段；将获得的***片段GhbHLH122与pBI121线性化载体按照2:1的摩尔比例配置体系。
Figure BDA0003225732360000081
将上述溶液混匀，50℃下反应10min，然后放在冰上，转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆，送样测序，获得包含正确目的基因的过表达载体。
该过程使用平板为抗卡那霉素的LB抗性培养基，配制的卡那霉素50mg/mL，用时稀释1000倍，即100mL的培养基加入100μl的50mg/mL卡那霉素。
实施例3：
重组载体转化农杆菌感受态
利用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，具体转化过程如下：
1)向上海唯地生物的根癌农杆菌LBA4404感受态细胞100μl中加入含有目的基因的过表达载体质粒1μg，混匀后冰浴5min；液氮速冻5min，37℃热激5min；
2)冰浴5min，再加入700μl无抗性的LB液体培养基；
3)190rpm，28℃，培养150min后，4000rpm离心5min，取100μL菌液涂在含有卡那霉素、链霉素和利福平的LB筛选培养基上，28℃培养大约36-48h，抗性菌落可见；
4)挑取单菌落在1mL的含有三抗的LB液体培养基中培养16h左右，直至浑浊；
5)菌落PCR和酶切鉴定，筛选出阳性农杆菌株，20％甘油菌液于-80℃保存。
实施例4：
农杆菌介导的拟南芥的转化
采用花序浸染法转化拟南芥
1)将-20℃保存的农杆菌菌液20μl接种到1mL的LB液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养过夜，取活化菌液200μl加入到50mL的LB液体培养基28℃、180rpm振荡培养；
2)待菌液OD值约为1.2时，3000转/每分离心菌液收集菌体；
3)转化介质配方为：1/2MS(大量元素减半，其他不变)、5％蔗糖，0.01μg/ml苄氨基嘌呤(BAP)，0.03％silwetL-77，20mg/L乙酰丁香酮，KOH调pH值至5.7；
4)用上述转化介质悬浮菌体，调OD至0.8开始浸染；
5)将拟南芥花序置于转化介质中30-50s,浸染后用保鲜膜将拟南芥包起来，暗培养一天后置于正常条件下培养；
6)种子成熟后收获T0代种子。
实施例5：
转基因拟南芥植株的表型鉴定
1)将收获的种子消毒后种植在含卡那霉素的1/2MS上，后进行4℃春化3天，转移到人工气候试验箱中，10天左右会阳性植株生长正常，而阴性植株叶片变黄，不再生长。
2)将阳性拟南芥植株移栽至小花盆中种植，待生长一个月后提取DNA用PCR进行检测，检测时所用引物为：
上游引物35sF 5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’(SEQ ID NO.7)。
下游引物35sR 5’-TTATTGCTGCCGCTGCTG-3’(SEQ ID NO.8)。
3)每一代的植株都要进行阳性株系的检测，直至繁殖至T3代，获得纯合转基因拟南芥株系。T3代株系做qRT-PCR检测,荧光定量验证的过程如下：
提取RNA，反转录成cDNA，分别设计GhbHLH122和拟南芥内参基因AtActin2荧光定量的引物：
GhbHLH122上游引物：5’-TTGTCGAGTAGCGGTGATGCTG-3’(SEQ ID NO.9)；
下游引物：5’-TCTGCGTAGCGGTGCAAAGATT-3’(SEQ ID NO.10)；
AtActin2上游引物：5’-AAGCTCTCCTTTGTTGCTGTT-3’(SEQ ID NO.11)；
下游引物：5’-GACTTCTGGGCATCTGAATCT-3’(SEQ ID NO.12)。
冰上配制qRT-PCR反应体系，进行荧光定量PCR反应。
PCR反应体系为：
Figure BDA0003225732360000091
Figure BDA0003225732360000101
PCR反应程序：
Figure BDA0003225732360000102
熔解曲线分析
95℃15s；60℃1min；95℃15s；60℃15s。
结果显示：
(1)T1代转基因拟南芥株系的PCR检测结果
通过提取T1代转基因拟南芥不同株系的DNA，利用特异引物进行PCR扩增，在拟南芥转基因株系6、7和8中扩增到明显的条带，如图1。
(2)T3代转基因拟南芥株系的荧光定量鉴定结果
荧光定量验证结果证实GhbHLH122基因在转基因植株中转录水平极显著高于非转基因拟南芥，如图2。
(3)T3代转基因拟南芥株系的表型鉴定
将转基因T3代植株与非转基因植株同等条件下种植栽培，如图3，可以看到转基因拟南芥提前开花。可以看出，GhbHLH122转基因拟南芥株系开花明显早于野生型拟南芥，表明GhbHLH122基因可以促进拟南芥提前开花。
以上结果也证实，GhbHLH122基因在促进棉花开花方面可能具有关键作用，可以作为短季棉培育的有利基因资源。
最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> GhbHLH122基因在调控植物开花中的应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 1
atggagtcag atcttcaaca c 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 2
ttattgctgc cgctgctg 18
<210> 3
<211> 1284
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 3
atggagtcag atcttcaaca ccaccaccac cataatctct ttgactatca tcaatctcaa 60
cataatcaaa aacagatgaa ctctgggttg acgaggtacc aatctgcacc tagttcgtat 120
ttttccaaca ttctggacag agatttctgc caagagattt taaatcgacc ttccagtccc 180
gaaacagaac gaatcatcgc aaagtttttg tcgagtagcg gtgatgctgc cggtggcggt 240
gatgctaata cggaaaccat tccatcgcag aatctttgca ccgctacgca gagttcacct 300
gttagagaaa cacctgtgaa aatcgagcag tcagcgcaga ttatgacgcc aattaataat 360
caaacagggc ttatgcagca gcctaaatat tcctctgctt cccagaattt ttatcaaagc 420
caacctccac agtatttgct aaatcagcaa ccatcagctt cagctatgga ttacaccact 480
ccaaatccaa cggggatgaa gatgggtgga ggcaacaatt ccaatcttat tagacacagt 540
agctcacctg cagggttatt ctccaaaatt aacattgaaa acattgcagg ctacggagtg 600
atgcggggaa tgggagatta tggaagcgtt aatagcagta acagagaagc aacgtttcgt 660
tcagcaagca ggccacctac accctctggg ctgatgactc caattgcgga gatggggaac 720
aaaagtatgg gtccatttag ctccgaaaat gctggatttg gtgaaaatcg tcccaacaat 780
tattcctcag ggctcccggt tacttcttgg gacgattcca tgatgatttc tgataacatg 840
tcaggcataa aaagactgag ggaagatgat agatcacttt ctggcttaga cggagctgaa 900
actaagaatg cagatggcgg caaccatcgt ccgccgccac ttttggctca tcacttgagt 960
ttaccaaaaa gttcagatat gtctgccatt gagaagttcc tgcagtatca ggattctgtt 1020
ccttgtaaga tccgggccaa aagaggctgt gccactcacc ctagaagcat tgctgagagg 1080
gtgagaagaa ccaaaataag cgagcgaatg aggaaactac aagaccttgt tccaaacatg 1140
gataagcaaa caaacactgc agacatgcta gatttggccg ttgattacat caaagacctc 1200
cagaaacagg tcaagtcact gtcggatagt cgtgcaaagt gttcttgtgc cgcacagcag 1260
cagcagcagc agcggcagca ataa 1284
<210> 4
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 4
Met Glu Ser Asp Leu Gln His His His His His Asn Leu Phe Asp Tyr
1 5 10 15
His Gln Ser Gln His Asn Gln Lys Gln Met Asn Ser Gly Leu Thr Arg
20 25 30
Tyr Gln Ser Ala Pro Ser Ser Tyr Phe Ser Asn Ile Leu Asp Arg Asp
35 40 45
Phe Cys Gln Glu Ile Leu Asn Arg Pro Ser Ser Pro Glu Thr Glu Arg
50 55 60
Ile Ile Ala Lys Phe Leu Ser Ser Ser Gly Asp Ala Ala Gly Gly Gly
65 70 75 80
Asp Ala Asn Thr Glu Thr Ile Pro Ser Gln Asn Leu Cys Thr Ala Thr
85 90 95
Gln Ser Ser Pro Val Arg Glu Thr Pro Val Lys Ile Glu Gln Ser Ala
100 105 110
Gln Ile Met Thr Pro Ile Asn Asn Gln Thr Gly Leu Met Gln Gln Pro
115 120 125
Lys Tyr Ser Ser Ala Ser Gln Asn Phe Tyr Gln Ser Gln Pro Pro Gln
130 135 140
Tyr Leu Leu Asn Gln Gln Pro Ser Ala Ser Ala Met Asp Tyr Thr Thr
145 150 155 160
Pro Asn Pro Thr Gly Met Lys Met Gly Gly Gly Asn Asn Ser Asn Leu
165 170 175
Ile Arg His Ser Ser Ser Pro Ala Gly Leu Phe Ser Lys Ile Asn Ile
180 185 190
Glu Asn Ile Ala Gly Tyr Gly Val Met Arg Gly Met Gly Asp Tyr Gly
195 200 205
Ser Val Asn Ser Ser Asn Arg Glu Ala Thr Phe Arg Ser Ala Ser Arg
210 215 220
Pro Pro Thr Pro Ser Gly Leu Met Thr Pro Ile Ala Glu Met Gly Asn
225 230 235 240
Lys Ser Met Gly Pro Phe Ser Ser Glu Asn Ala Gly Phe Gly Glu Asn
245 250 255
Arg Pro Asn Asn Tyr Ser Ser Gly Leu Pro Val Thr Ser Trp Asp Asp
260 265 270
Ser Met Met Ile Ser Asp Asn Met Ser Gly Ile Lys Arg Leu Arg Glu
275 280 285
Asp Asp Arg Ser Leu Ser Gly Leu Asp Gly Ala Glu Thr Lys Asn Ala
290 295 300
Asp Gly Gly Asn His Arg Pro Pro Pro Leu Leu Ala His His Leu Ser
305 310 315 320
Leu Pro Lys Ser Ser Asp Met Ser Ala Ile Glu Lys Phe Leu Gln Tyr
325 330 335
Gln Asp Ser Val Pro Cys Lys Ile Arg Ala Lys Arg Gly Cys Ala Thr
340 345 350
His Pro Arg Ser Ile Ala Glu Arg Val Arg Arg Thr Lys Ile Ser Glu
355 360 365
Arg Met Arg Lys Leu Gln Asp Leu Val Pro Asn Met Asp Lys Gln Thr
370 375 380
Asn Thr Ala Asp Met Leu Asp Leu Ala Val Asp Tyr Ile Lys Asp Leu
385 390 395 400
Gln Lys Gln Val Lys Ser Leu Ser Asp Ser Arg Ala Lys Cys Ser Cys
405 410 415
Ala Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Arg Gln Gln
420 425
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 5
cgggggactc tagaggatcc atggagtcag atcttcaaca c 41
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 6
gatcggggaa attcgagctc ttattgctgc cgctgctg 38
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 7
gacgcacaat cccactatcc 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 8
ttattgctgc cgctgctg 18
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 9
ttgtcgagta gcggtgatgc tg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 10
tctgcgtagc ggtgcaaaga tt 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 11
aagctctcct ttgttgctgt t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 12
gacttctggg catctgaatc t 21

Claims (9)

1.GhbHLH122基因在调控植物开花中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于： 所述GhbHLH122基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述GhbHLH122基因编码多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述GhbHLH122基因在提高促进植物开花中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物包括棉花和拟南芥。
6.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒含有GhbHLH122基因片段，所述GhbHLH122基因的开放阅读框具有如SEQ ID NO.3所示的序列。
7.一种重组载体，其特征在于：其包括GhbHLH122基因和载体。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述GhbHLH122基因的开放阅读框具有如SEQ ID NO.3所示的序列。
9.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述载体为pBI121。
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