CN113481123B - 一种耐盐碱产吲哚乙酸的菌株kj-1及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ‑1及应用，属于农业微生物领域，菌株KJ‑1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021332。该菌株具有较高的盐碱耐受性，适应温度范围广，可合成更多吲哚乙酸，并且具有固氮作用，能够促进种子萌发及作物生长。
Description
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，更具体的说是涉及一种耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ-1及应用。
背景技术
土壤盐碱化会影响作物生长，严重的盐碱土壤地区作物几乎不能存活。具体地，盐分含量高时，土壤溶液渗透压高于植物细胞液渗透压，会引起根毛细胞脱水，导致枯萎或“烧苗”；并且高浓度盐分会干扰作物对养分的吸收，造成作物营养紊乱。而碱性盐除其本身对作物的毒性外，还可产生碱性反应，使磷酸盐以及铁、锌、锰等许多营养元素在土壤中被固定，进而影响作物对营养元素的吸收利用，产生缺钙、缺镁、缺磷等现象。因此，如何促进作物在盐碱环境下的生长发育是本领域技术人员研究的重点。
盐碱环境下的微生物具有较强的耐盐碱能力，并且，有些菌株还可分泌生长素、减轻作物盐胁迫、促进作物生长发育，因此，对耐盐碱的促生微生物进行挖掘具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ-1，耐盐碱性强，可有效促进作物生长发育。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ-1，节杆菌属(Arthrobacter halodurans)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M 2021332，保藏时间为2021年4月6日。
上述耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ-1可应用于作物栽培。
具体地，可将菌株KJ-1制成促生菌剂或生物肥施入土壤，或进行浸种处理，或在作物生长不同阶段进行施用。
进一步优选地，上述作物栽培的环境包括盐碱地和非盐碱地。
优选地，上述耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ-1可用于固氮，其能够将大气中的氮气还原为氨。
优选地，上述耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ-1可用于合成吲哚乙酸。
进一步优选地，上述菌株利用色氨酸合成吲哚乙酸。
优选地，上述耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ-1可用于促进作物生长。
进一步优选地，上述菌株可促进盐胁迫或非盐胁迫的小麦生长。
优选地，上述耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ-1可用于促进作物种子萌发。
进一步优选地，上述菌株可促进盐胁迫或非盐胁迫的小麦种子萌发。
由上述技术方案可知，本发明公开的耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ-1具有较高的盐碱耐受性，适应温度范围广，可合成吲哚乙酸，并且具有固氮作用，能够促进种子萌发及作物生长。
附图说明
图1所示为KJ-1菌落形态。
图2所示为KC-1菌落形态。
图3所示为吲哚乙酸标准曲线。
图4所示非盐胁迫小麦接种菌株KJ-1对幼苗鲜重的影响。
图5所示为非盐胁迫小麦接种菌株KJ-1对根鲜重的影响。
图6所示为盐胁迫小麦接种菌株KJ-1对幼苗鲜重的影响。
图7所示为盐胁迫小麦接种菌株KJ-1对根鲜重的影响。
图8所示为盐胁迫小麦接种菌株KJ-1对根长的影响。
图9所示为菌株KJ-1对小麦种子发芽率的影响。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ-1及菌株KC-1的分离及鉴定
从新疆地区盐碱地采集土壤，装入干净的采样袋，做好标记，于4℃冰箱中保存备用。
将采集到的土样称取10g置于装有90mL灭菌水的250mL三角瓶中，于摇床震荡150r/min 20min后，用1mL移液器从上清液中吸取1mL加入盛有9mL无菌水的试管中充分混匀，然后用移液器从此试管中吸取1mL加入另一盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀，依此类推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释度的溶液后，各吸取0.1mL分别在含10％氯化钠的LB培养基平板上涂布均匀，倒置在30℃恒温箱中培养2-3d，挑取单菌落接于LB斜面上，待长出菌苔后在4℃冰箱保存。
LB培养基：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，固体加琼脂20g，121℃灭菌20分钟。
将分离纯化得到的菌株于LB培养基上划线，进行菌落形态观察。其中一株如图1所示，菌落小、乳白色、透明、表面光滑、边缘光滑、圆形；将其命名为KJ-1。另外一株如图2所示，菌落大、淡黄色、不透明、表面光滑、边缘光滑、不均匀；将其命名为KC-1。
对菌株KJ-1进行16S rRNA序列分析，经比对，鉴定为节杆菌属(Arthrobacterhalodurans)。
对菌株KC-1进行16S rRNA序列分析，经比对，鉴定为节杆菌属(Bacillussubtilis)。
实施例2菌株KJ-1与KC-1生长特性研究
1.不同pH对菌株KJ-1与KC-1生长影响
将菌株KJ-1与KC-1菌悬液分别以1.0％接种量接种于不同pH值(6，7，8，9，10，11)LB培养基，在30℃，150r/min振荡培养24h，以不接种的LB培养基为对照，采用722分光光度计检测光密度值(D600nm)，结果见表1、2，KJ-1耐碱性优于KC-1。
表1 不同pH对菌株KJ-1生长影响
表2 不同pH对菌株KC-1生长影响
2.不同温度对菌株KJ-1与KC-1生长影响
将菌株KJ-1、KC-1菌悬液分别以1.0％接种量接种于pH值为9的LB培养基中，在不同温度(24℃、27℃、30℃、33℃、36℃)，150r/min振荡培养24h，以不接种的LB培养基为对照，采用722分光光度计检测光密度值(D600nm)，结果见表3、4，KJ-1具有适应温度范围更广。
表3 不同温度对菌株KJ-1生长影响
表4 不同温度对菌株KC-1生长影响
3.不同盐度对菌株KJ-1与KC-1生长影响
将菌株KJ-1、KC-1菌悬液分别以1.0％接种量接种于pH值为9，并含不同氯化钠浓度(质量分数4-17％)的LB培养基，在30℃，150r/min振荡培养24h，以不接种的LB培养基为对照，采用722分光光度计检测光密度值(D600nm)，结果见表5、6，KJ-1菌株最大耐盐浓度为6％，而KC-1菌株最大耐盐浓度为5％，KJ-1具有具有更高的耐盐性。
表5 不同盐度对菌株KJ-1生长影响
表6 不同盐度对菌株KC-1生长影响
实施例3菌株KJ-1与KC-1固氮定性测定
将菌株于阿须贝培养基划线，在30℃下，培养7d，进行固氮定性测定。
阿须贝培养基：甘露醇10.0g，KH2PO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaCO35.0g，CaSO4·2H2O 0.1g，琼脂20g，去离子水1 000mL，121℃灭菌20分钟。
测得菌株KJ-1能够在该培养基生长，表明该菌株具有固氮能力。
测得菌株KC-1不能够在该培养基生长，该菌株无固氮能力。
实施例4菌株KJ-1与KC-1产吲哚乙酸(IAA)定量测定
1.IAA标准曲线配置
精确称取32.8mg的IAA于100mL容量瓶中，用甲醇定容，获得浓度为328mg/L的IAA溶液。再用甲醇依次稀释1倍，连续进行4次，配成5份浓度依次相差1倍的标准溶液，加入等体积Salkowski比色液(50mL35％HClO4+1mL0.5mol/L FeCl3)，避光静置30min，测定其OD530值，绘制的标准曲线如图3所示。
2.菌株KJ-1与KC-1分泌IAA能力测定
将菌株KJ-1按1％接种量接种于含有L-色氨酸(100mg/L)的不同含盐量(0mM NaCl与150mM NaCl)LB液体培养基，在30℃、150r/min摇床培养48h后，将菌悬液以10000r/min离心10min，取上清液，加入等体积Salkowski比色液(50mL 35％HClO4+1mL 0.5mol/L FeCl3)，避光静置30min，测定其OD530值；对照标准曲线计算单位体积培养液中IAA的含量。
经测定，菌株KJ-1在150mM NaCl条件下产IAA含量为40.36mg/L，在0mM NaCl条件下产IAA含量为36.69mg/L。
将菌株KC-1按1％接种量接种于含有L-色氨酸(100mg/L)的不同含盐量(0mM NaCl与150mM NaCl)LB液体培养基，在33℃、150r/min摇床培养48h后，将菌悬液以10000r/min离心10min，取上清液，加入等体积Salkowski比色液(50mL 35％HClO4+1mL 0.5mol/L FeCl3)，避光静置30min，测定其OD530值；对照标准曲线计算单位体积培养液中IAA的含量。
经测定，菌株KC-1在150mM NaCl条件下产IAA含量为17.03mg/L，在0mM NaCl条件下产IAA含量为9.13mg/L，KJ-1具有更高促生特性。
实施例5菌株KJ-1对非盐胁迫小麦的促生盆栽实验
设置2个处理(T1：无菌水；T2：菌悬液，菌悬液浓度为1×108cfu/mL)。每个处理设置3个重复，每个重复花盆内放置3粒小麦种子。
小麦种子先用自来水冲洗干净，用75％酒精消毒30s，再用0.1％升汞消毒7min，用无菌水冲洗5～6遍；消毒后将种子浸泡在无菌水中2h，取大小一致饱满的种子，再浸泡在各处理溶液中8h，然后均匀排列在铺有灭菌滤纸的消毒发芽盒(直径12cm)中。待小麦种子露白后，立即播种到装有等量经灭菌的营养土(营养土3：蛭石1)的花盆(上直径15cm，下直径10cm，高13cm)中，播种深度1cm左右，播种带上一次性手套均匀播种。及时等量浇水，40d后，将植株取出，清洗根部，测定幼苗鲜重、根鲜重。
结果如图4、5所示，菌株KJ-1对小麦幼苗鲜重、根鲜重有促进作用，分别提高增加50.28％、74.77％。
实施例6菌株KJ-1对盐胁迫小麦的促生盆栽实验
设置2个处理(T1：150mM NaCl溶液；T2：150mM NaCl+菌悬液，菌悬液浓度为1×108cfu/mL)。每个处理设置3个重复，每个重复花盆内放置3粒小麦种子。
小麦种子先用自来水冲洗干净，用75％酒精消毒30s，再用0.1％升汞消毒7min，用无菌水冲洗5～6遍；消毒后将种子浸泡在无菌水中2h，再浸泡在各处理溶液中8h，取大小一致饱满的种子，然后均匀排列在铺有灭菌滤纸的消毒发芽盒(直径12cm)中。待小麦种子露白后，立即播种到装有等量经灭菌的营养土(营养土3：蛭石1)的花盆(上直径15cm，下直径10cm，高13cm)中，播种深度1cm左右，播种带上一次性手套均匀播种。及时等量浇水，40d后将植株取出，清洗根部，测定小麦根长、根鲜重、幼苗鲜重。
结果如6、7、8所示，菌株KJ-1对小麦根长、幼苗鲜重、根鲜重有促进作用，分别提高11.41％、12.64％、158.33％。
实施例7小麦接种菌株KJ-1发芽实验
设置4个处理(T1：水；T2：菌株菌悬液；T3：150mM NaCl溶液；T4：150mM NaCl+菌悬液，菌悬液浓度为1×108cfu/mL)每个处理设置3个重复，每个重复发芽盒内放置48粒小麦种子。
小麦种子先用自来水冲洗干净，用75％酒精消毒30s，再用0.1％升汞消毒7min，用无菌水冲洗5～6遍；消毒后将种子浸泡在无菌水中2h，再浸泡在各处理溶液中8h，取大小一致饱满的种子，然后均匀排列在铺有灭菌滤纸的消毒发芽盒(直径12cm)中，7天后计算发芽率。
结果如图9所示，小麦种子在非盐胁迫下与盐胁迫下接种KJ-1，发芽率分别提高7.18％，20.35％。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ-1，其特征在于，所述菌株KJ-1为节杆菌属Arthrobacter halodurans，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021332。
2.权利要求1所述的一种耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ-1在作物栽培中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，
所述作物栽培的环境包括盐碱地和非盐碱地。
4.权利要求1所述的一种耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ-1在固氮中的应用。
5.权利要求1所述的一种耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ-1在合成吲哚乙酸中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，
所述菌株利用色氨酸合成吲哚乙酸。
7.权利要求1所述的一种耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ-1在促进作物生长中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，
所述菌株促进盐胁迫或非盐胁迫的小麦生长。
9.权利要求1所述的一种耐盐碱产吲哚乙酸的菌株KJ-1在促进作物种子萌发中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，
所述菌株促进盐胁迫或非盐胁迫的小麦种子萌发。
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