CN105754900B - 一株促作物抗干旱的欧文氏菌新种及其应用 - Google Patents

一株促作物抗干旱的欧文氏菌新种及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株促作物抗干旱的欧文氏菌新种及其应用,该菌种从中国新疆荒漠地区采集的骆驼刺叶部组织分离获得,代号为LTYR‑11Z,该菌种于2016年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC M 2016052,分类命名为骆驼刺欧文氏菌Erwinia alhag。本发明所述欧文氏菌新种Erwinia alhagi LTYR‑11Z具有产生植物生长激素吲哚乙酸,分泌铁载体,溶解难溶性无机磷酸盐等植物促生作用,且对植物病原真菌小麦根腐菌具有一定的抑制作用。本发明所述的欧文氏菌新种制成的活菌制剂可作为接种剂在干旱生境的农业生产中进行应用,促进农作物生长,提高农作物抗旱能力。

Description

一株促作物抗干旱的欧文氏菌新种及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域,涉及一株促作物抗干旱的欧文氏菌新种及其应用。
背景技术
众所周知,水资源短缺和土壤盐碱化是全世界农业生产面临的主要问题。随着全球气候恶化,高温、干旱、洪涝、低温冻害等极端天气频频在世界各地出现,也对全球粮食生产构成了巨大威胁。据统计,在世界范围内,适于耕种的土地不足10%,大部分土地处于干旱、盐渍、沼泽、冷土等逆境中。干旱﹑盐碱﹑高温﹑低温等逆境条件是抑制植物生长发育的非生物胁迫因素,引起一系列形态﹑生理生化变化,严重时甚至导致整个植株死亡。而且,人口的不断增长对粮食需求的压力越来越大,也迫切需要培育出适应各种逆境胁迫的经济作物。因此,如何改良作物抗逆性一直是世界各国关注的农业生态热点问题。
除了植物本身的遗传特性之外,近年来的研究表明,一些植物组织中存在的内生微生物在宿主植物抵御外界不良环境胁迫的过程中发挥着重要作用。植物内生菌能够从植物的渗透调节物质、抗氧化***、干旱相关基因、生理指标和激素平衡等方面来调节干旱胁迫下植物组织活性氧毒害和渗透平衡,从而缓解干旱胁迫对植物的伤害,使植物在缺水环境下也能生长。因此,可以开发利用植物内生菌资源作为缓解旱区作物干旱胁迫压力的一个有利的工具。一些研究结果也显示,植物内生菌赋予宿主植物的抗逆能力往往与其分离环境具有一一对应的关系。例如,从沿海、干旱以及高温生境分离的植物内生菌分别赋予宿主植物对盐、干旱和高温的抗性。因此,从自然界长期生活在干旱胁迫环境的植物组织中寻找内生菌资源,以开发能够协助作物抵御干旱胁迫的新型微生物菌剂,应用于干旱缺水地区的农业生产,是未来旱区作物抗逆性改良的新途径。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术所存在的上述不足,提供一株具有促作物抗干旱功能的欧文氏菌新种及其应用,该菌种可应用于提高作物抗干旱能力。
其技术方案为:
一株促作物抗干旱的欧文氏菌新种,从我国新疆荒漠地区采集的骆驼刺叶部组织分离获得,代号为LTYR-11Z,该菌株于2016年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国武汉武汉大学,保藏号为CCTCC M 2016052,分类命名为骆驼刺欧文氏菌(Erwinia alhagi)。
优选地,所述欧文氏菌新种形态及培养特征具体为:在LB培养基上30℃培养1d后,菌落呈现黄色半湿润凸起状;经透射电镜观察该菌种细胞为杆状,具有鞭毛结构。
优选地,所述欧文氏菌新种的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地,所述欧文氏菌新种的recA基因片段序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地,所述欧文氏菌新种的gpd基因片段序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地,所述欧文氏菌新种具有溶解难溶性无机磷的作用。
优选地,所述欧文氏菌新种能够产生吲哚乙酸(IAA)。
优选地,所述欧文氏菌新种能够产生铁载体(siderophore)。
本发明所述的欧文氏菌新种在提高作物抗旱性过程中的应用。
优选地,所述作物为小麦和白菜。
本发明所述的欧文氏菌新种在促进作物生长过程中的应用。
本发明的有益效果:
本发明所述欧文氏菌新种能够产生植物生长激素吲哚乙酸,促进植物组织生长发育。该菌种还能够分泌铁载体,溶解难溶性无机磷酸盐,促进共生宿主植物对铁、磷等无机营养元素的吸收利用从而促进其生长。
本发明所述欧文氏菌新种对植物病原真菌小麦根腐菌有一定拮抗作用,有利于提高作物抵御病原真菌病害能力。
本发明所述欧文氏菌新种从新疆极度干旱的荒漠地区生长的耐旱植物骆驼刺的叶部组织分离获得,其能够定殖于小麦和白菜等作物体内,并提高宿主植物对干旱胁迫的抗性。
附图说明
图1是Erwinia alhagi LTYR-11Z在LB培养基和R2A培养基上的菌落照片;
图2是Erwinia alhagi LTYR-11Z在LB+5%蔗糖培养基上产果聚糖的菌落照片;
图3是Erwinia alhagi LTYR-11Z与相关模式菌株依据16S rRNA基因序列构建的***发育树;
图4是Erwinia alhagi LTYR-11Z在无机磷固体培养基上溶磷的照片;
图5是Erwinia alhagi LTYR-11Z在CAS培养基上产铁载体的照片;
图6是Erwinia alhagi LTYR-11Z与小麦根腐菌的平板对峙实验照片;
图7是干旱胁迫条件下不接菌小麦幼苗(第二盆)与接种Erwinia alhagi LTYR-11Z的小麦幼苗(第三盆)生长状态的比较以及两组无干旱对照(第一盆和第四盆);
图8是干旱胁迫条件下不接菌小麦幼苗与接种Erwinia alhagi LTYR-11Z的小麦幼苗的根长和茎长比较;
图9是干旱胁迫条件下不接菌小麦幼苗与接种Erwinia alhagi LTYR-11Z的小麦幼苗的鲜重比较;
图10是干旱胁迫条件下不接菌小白菜幼苗(第一盆)与接种Erwinia alhagiLTYR-11Z的小白菜幼苗(第二盆)生长状态的比较;
图11是干旱胁迫条件下不接菌小白菜幼苗与接种Erwinia alhagi LTYR-11Z的小白菜幼苗的鲜重比较。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的方法作进一步详细地说明。
本发明涉及的欧文氏菌新种,从我国新疆荒漠地区采集的骆驼刺叶部组织分离获得,代号为LTYR-11Z,该菌株于2016年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC M 2016052,分类命名为骆驼刺欧文氏菌(Erwinia alhagi)。
1.本发明所述欧文氏菌新种的分离
从新疆荒漠地区采集骆驼刺植物样品,将其叶部植物组织进行表面消毒,用消毒的剪刀剪成碎片放置于含50μg/mL放线菌酮的R2A固体培养基上,28℃培养1周,挑取叶片周围长出的米白色菌苔,划线纯化后得到菌株LTYR-11Z,经过表型与遗传特征进行分类鉴定,确定其为欧文氏菌属(Erwinia)的新种,命名为骆驼刺欧文氏菌(Erwinia alhagi)
2.本发明所述欧文氏菌新种的形态特征
如图1所示,将骆驼刺欧文氏菌(Erwinia alhagi LTYR-11Z)划线接种于LB平板上培养24h后,形成圆形,直径2-5mm,不透明,半湿润,凸起的黄色菌落(左);将该菌株划线接种于R2A平板上培养24h后,形成圆形,直径2-4mm,不透明,半湿润,凸起的米白色菌落(右)。透射电镜显微观察结果显示该菌株的细胞呈杆状,具有鞭毛,能够运动。
3.本发明所述欧文氏菌新种的生理生化特性
欧文氏菌新种Erwinia alhagi LTYR-11Z能够在TSA、R2A、Marine Agar 2216、Nutrient Agar、MacConkey Agar、LB等多种固体培养基上生长,能够耐受0-7%NaCl,生长温度范 围7-48℃,生长pH范围为5.0-9.0;属于兼性厌氧菌,在有氧和无氧条件均生长良好;产过氧化氢酶和细胞色素氧化酶,可利用葡萄糖、***糖、甘露糖、麦芽糖等多种糖类作为唯一碳源进行生长,能够水解酪蛋白。如图2所示,将该菌种划线接种于含5%蔗糖的LB平板上,形成白色粘稠,圆顶状的大菌落,表明该菌株能够将蔗糖降解转化成果聚糖。
4.16S rRNA基因、recA基因及gpd基因序列分析
提取菌株LTYR-11Z的基因组DNA,利用16S rRNA基因通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增16S rRNA基因片段,利用recA基因通用引物RECA1(5′-GGTAAAGGGTCTATCATGCG-3′)和RECA2c(5′-CCTTCACCATACATAATTTGGA-3′)扩增recA基因片段,利用gpd基因通用引物GAP11(5′-ACGGCACTGTAGAAGTC-3′)和GAP12c(5′-CCAGTCTTTGTGAGACG-3′)扩增gpd基因片段,分别连入pMD19-T载体,转入大肠杆菌感受态细胞,挑选阳性克隆进行测序,分别获得16S rRNA基因、recA基因及gpd基因序列。
欧文氏菌新种Erwinia alhagi LTYR-11Z的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。将该16S rRNA基因序列提交GenBank数据库进行多重序列比对,与已有效发表的模式菌株进行序列相似性分析,发现其与欧文氏菌属的模式菌株Erwinia uzenensis YPPS 951T,Erwinia piriflorinigrans CFBP 5888T和Erwinia pyrifoliae DSM 12163T的序列相似性最高,分别为97.5%,97.4%和97.4%。根据著名细菌分类学家Stackebrandt等的理论,16SrRNA基因序列相似性小于98.7%的细菌应归于不同的种。菌株LTYR-11Z与欧文氏菌属已有模式菌株的16S rRNA序列相似性在97.5%以下,表明其与欧文氏菌属的已知种具有较大差异,应为欧文氏菌属的一个新种。将菌株LTYR-11Z与欧文氏菌属相关模式菌株的16S rRNA基因序列用ClustalX 1.81软件比对,然后采用邻接法构建***进化树,结果如图3所示。从***发育树(图3)可以看出,在欧文氏菌属所有模式菌株组成的分类簇内,菌株LTYR-11Z位于一个独立的分支中,表明该菌株与欧文氏菌属其它种的模式菌株在分类地位上具有较大的差异。
欧文氏菌新种Erwinia alhagi LTYR-11Z的部分recA基因片段序列如SEQ IDNO.2所示。该recA基因序列与其亲缘关系最近的模式菌株Erwinia uzenensis YPPS 951T,Erwinia piriflorinigrans CFBP 5888T和Erwinia pyrifoliae DSM 12163T的相似性仅为84.9%,85.1%和85.1%。
欧文氏菌新种Erwinia alhagi LTYR-11Z的部分gpd基因片段序列如SEQ ID NO.3所示。该gpd基因序列与模式菌株Erwinia uzenensis YPPS 951T和Erwiniapiriflorinigrans CFBP 5888T的相似性仅为81.1%和82.2%。
综上所述,16S rRNA基因序列以及recA和gpd两个保守基因的序列相似性比较及***发育分析结果均显示菌株LTYR-11Z与欧文氏菌属的相关模式菌株在遗传上具有较大的差异性,应为欧文氏菌属的一个新种,将其命名为骆驼刺欧文氏菌(Erwinia alhagi)。
5.本发明所述欧文氏菌新种产吲哚乙酸(IAA)能力测定
将欧文氏菌新种Erwinia alhagi LTYR-11Z接种于含0.5mg/ml L-色氨酸的SMS液体培养基[sucrose 10g、(NH4)2SO4 1g、K2HPO4 2g、MgSO4 0.5g、Yeast extract 0.5g、CaCO30.5g、NaCl 30g、1000mL蒸馏水,pH值7.2],30℃,180rpm摇床培养3d。用分光光度法测定菌悬液的OD600值,然后将菌悬液10000rpm离心10min,取上清液加入等体积Salkowski比色液(50mL 35%HClO4+1mL 0.5M FeCl3),避光静置30min,测定其OD530值。计算菌浓度OD600值为1时,单位体积发酵液中IAA的含量(通过IAA梯度稀释的标准曲线计算IAA的含量)。通过测定,该欧文氏菌新种的IAA产量可达17.73μg/(mL·OD600)。
6.本发明所述欧文氏菌新种溶解无机磷实验
将欧文氏菌新种Erwinia alhagi LTYR-11Z接种于难溶性无机磷固体培养基[10g葡萄糖、5.0g Ca3(PO4)2、0.5g(NH4)2SO4、0.2g NaCl、0.2g KCl、0.03g MgSO4·7H2O、0.03gMnSO4、0.003g FeSO4、0.5g酵母膏、20g琼脂、1000mL蒸馏水,pH值6.8~7.0],置于30℃培养,观察是否有降解圈出现。如图4所示,在无机磷固体培养基上培养3d后,该欧文氏菌新种的菌苔周围有透明圈出现,表明该菌种能够溶解难溶性无机磷。
7.本发明所述欧文氏菌新种产铁载体(siderophore)能力检测
取60.5mg CAS(铬天青)溶于50mL ddH2O中,与10mL铁溶液(1mmol/L FeCl3和10mmol/L HCl)溶液混合均匀,得溶液A;取72.9mg HDTMA(十六烷基三甲基溴化铵)溶于40mL ddH2O,得到溶液B;将A溶液缓慢加入B溶液中,充分混匀,即得CAS染液。CAS检测平板制备:每100mL含20%蔗糖溶液1mL,10%酸水解酪素3mL,1mmol/L CaCl2 100μL,1mmol/LMgSO4 2mL,琼脂1.8g,在约60℃时缓慢加入10×MM9盐溶液(Na2HPO4·12H2O 2.427g,NaH2PO4·2H2O 0.5905g,KH2PO4 0.075g,NH4Cl 0.250g,NaCl0.125g,100mL ddH2O,调节pH至6.8)和CAS染液各5mL,充分摇匀(但勿产生气泡),即得蓝色检测培养基。将欧文氏菌新种Erwinia alhagi LTYR-11Z接种于检测培养基中央,置于30℃培养,观察是否有变色圈出现。如图5所示,在CAS检测培养基上培养3d后,该欧文氏菌新种的菌苔周围出现明显的黄色晕圈,表明其能产铁载体。
8.本发明所述欧文氏菌新种对小麦根腐菌的抑制作用
植物病原真菌小麦根腐菌接种于PDA培养基(马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15~20g、自来水1000mL)上,30℃培养2-3d,用打孔器在上述培养平板上打取1个菌饼,然后将其转接至新鲜的1/4PDA培养平板中央处,同时将活化好的欧文氏菌新种Erwinia alhagiLTYR-11Z接于同一1/4PDA培养平板边缘处,30℃培养2-3d后观察菌株LTYR-11Z对小麦根腐菌的拮抗效果。如图6所示,该欧文氏菌新种对植物病原真菌小麦根腐菌具有一定的抑制作用。
9.接种本发明所述欧文氏菌新种提高小麦和白菜幼苗对干旱胁迫的抗性
将欧文氏菌新种Erwinia alhagi LTYR-11Z平板上的单菌落接入5mL TSB液体培养基内,30℃、200rpm摇菌12h后,转接于含200mL TSB液体培养液的三角瓶中,于30℃、200rpm摇床上震荡培养,24h后达到菌体对数生长期,6000rpm离心收集菌体。用灭菌的自来水洗涤菌体两次后,稀释到108~109CFU/mL作为生物菌剂。
将蛭石和土壤按体积比1:3混合得种植基质,装入菌种袋中,每袋450g,密封后121℃灭菌25min,然后将灭菌后的混合土壤装入塑料花盆中。
选用籽粒饱满、大小一致的晋麦47号小麦的种子和四季黄秧小白菜种子,首先用75%乙醇浸泡30s,倒掉液体,再加入0.1%HgCl2浸泡小麦种子7min(小白菜种子3min),然后用无菌水洗5~6次。将小麦种子放到灭菌的湿润的双层滤纸上,置于25℃,黑暗催芽2d,将长势相同、饱满的小麦幼芽移栽到灭菌的土壤中,每盆种3棵,浇灭菌的自来水40mL;而小白菜种子表面消毒之后直接将种子种植到灭菌的混合土壤中,每盆种一颗,三盆重复,浇灭菌的自来水20mL。
将准备好的小麦盆栽置于25℃温室中,每天光照14h,每隔一天浇灭菌的自来水30mL,一个星期之后,将准备好的欧文氏菌新种Erwinia alhagi LTYR-11Z活菌制剂40mL(按每克土壤107~108活菌数量接种)浇到小麦的根部位置,同时设置不接菌的对照组浇灭菌后的自来水40mL,每个处理3盆重复。大约一个星期,等到小麦长到两叶一心期,对接菌处理组和不接菌对照组同时进行干旱处理,停止浇水12天,恢复灌溉2天后,记录小麦幼苗的健康状态并照相,然后收获植株,测定并统计各处理的平均根长、株高、鲜重、干重等生长指标。如图7所示为小麦盆栽实验的四组处理,从左至右第一盆是未接菌也未进行干旱胁迫处理的小麦幼苗,第二盆是未接菌但干旱胁迫处理的小麦幼苗,第三盆是接种Erwiniaalhagi LTYR-11Z且干旱胁迫处理的小麦幼苗,第四盆是接种Erwinia alhagi LTYR-11Z但未经干旱胁迫处理的小麦幼苗。从图7中可以看出,同等干旱处理条件下接种了该欧文氏菌新种的小麦幼苗(第三盆)保持鲜绿、正常生长,而未接菌的小麦幼苗(第二盆)出现枯萎、矮小现 象,即干旱处理条件下接种了该欧文氏菌新种的小麦幼苗的生长发育和健康状态明显优于未接菌的对照。图8和图9中,CK和LTYR-11Z分别表示不接菌的小麦幼苗干旱处理和接种欧文氏菌新种Erwinia alhagi LTYR-11Z的小麦幼苗干旱处理。如图8所示,干旱处理时接种了该欧文氏菌新种的小麦幼苗同不接菌的对照相比根长平均增加16.2%,茎长平均增加20.2%。如图9所示,干旱处理时接种了该欧文氏菌新种的小麦幼苗与不接菌的对照相比鲜重增加86.1%。图7,8和9的结果表明在干旱胁迫条件下,施用了欧文氏菌新种Erwiniaalhagi LTYR-11Z的小麦幼苗的生物量显著增加,对干旱胁迫的抵抗能力明显提高。
将准备好的小白菜盆栽置于25℃温室中,每天光照14h,每隔一天浇灭菌的自来水20mL,三个星期之后,将准备好的欧文氏菌新种Erwinia alhagi LTYR-11Z活菌制剂20mL(按每克土壤107~108活菌数量接种)浇到小白菜的根部位置,同时设置不接菌的对照组浇灭菌的自来水20mL,每个处理3盆重复。大约三个星期之后,对小白菜的接菌处理组和不接菌对照组同时进行干旱处理,停止浇水11天,恢复灌溉2天后,记录小白菜幼苗的健康状态并照相,然后收获幼苗全株,测定并统计各处理的平均根长、株高、鲜重、干重等生长指标。如图10所示为小白菜盆栽实验的两组干旱处理,从左至右第一盆是未接菌的小白菜幼苗干旱处理,第二盆是接种欧文氏菌新种Erwinia alhagi LTYR-11Z的小白菜幼苗干旱处理。从图10可以看出,在同等干旱处理条件下接种了该欧文氏菌新种的小白菜幼苗(第二盆)保持鲜绿、正常生长,而未接菌的小白菜幼苗(第一盆)出现枯萎、矮小现象,即干旱处理条件下接种了该欧文氏菌新种的小白菜幼苗的生长发育和健康状态明显优于未接菌的对照。图11中,CK和LTYR-11Z分别表示不接菌的小白菜幼苗干旱处理和接种欧文氏菌新种Erwiniaalhagi LTYR-11Z的小白菜幼苗干旱处理。如图11所示,施加了该欧文氏菌新种活菌制剂的小白菜幼苗在干旱胁迫处理后的鲜重相比未接菌的对照增加了86.8%。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,本发明的保护范围不限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
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Figure IDA0000964501650000021
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Figure IDA0000964501650000081
Figure IDA0000964501650000091
Figure IDA0000964501650000101

Claims (4)

1.一株促作物抗干旱的欧文氏菌种,其特征在于:该菌种属于欧文氏菌属,代号为LTYR-11Z,该菌株于2016年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCCM2016052,分类命名为骆驼刺欧文氏菌Erwinia alhagi;
其形态及培养特征具体为:在LB培养基上30℃培养1d后,菌落呈现黄色半湿润凸起状;经透射电镜观察该菌株细胞呈杆状,具有鞭毛结构;
所述菌种的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示;
所述菌种的recA基因序列如SEQ ID NO.2所示;
所述菌种的gpd基因序列如SEQ ID NO.3所示;
所述菌种具有溶解难溶性无机磷的作用;
所述菌种能够产生吲哚乙酸;
所述菌种能够产生铁载体。
2.权利要求1所述的欧文氏菌种在提高作物抗旱性过程中的应用。
3.根据权利要求2所述的欧文氏菌种在提高作物抗旱性过程中的应用,其特征在于,所述作物为小麦和白菜。
4.权利要求1所述的欧文氏菌种在促进作物生长过程中的应用。
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