CN114276950B - 一株广适pH耐盐解磷菌及其应用 - Google Patents
一株广适pH耐盐解磷菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株广适pH耐盐解磷菌及其应用,所述广适pH耐盐解磷菌为假单胞菌PSBDYJP20210001,其能够耐受pH为2~10、NaCl浓度为1~5%的环境条件,同时具有较高的解磷功能,该假单胞菌PSBDYJP20210001保藏于:中国典型培养物保藏中心,保藏地址为:中国武汉,保藏日期为:2021年09月13日,保藏编号为:CCTCC NO:M 20211169。用该假单胞菌PSBDYJP20210001的培养液浸泡盐地碱蓬的种子,可以明显提高种子的发芽率;用该假单胞菌PSBDYJP20210001的培养液浇灌种植盐地碱蓬的土壤,可以明显提高盐地碱蓬的株高、根长、根系直径和根尖数。
Description
技术领域
本发明涉及一株菌及其应用,具体涉及一株广适pH耐盐解磷菌及其应用,属于微生物技术领域。
背景技术
磷元素是植物生长发育所必需的矿物质元素之一,是植物生长的重要物质基础,植物吸收磷元素的量与其生物量和产量呈显著正相关。土壤中大部分磷以无机磷或有机磷化物状态存在,不能被植物吸收利用。解磷菌(Phosphate Solubilizing bacteria)是一类可以将难溶性磷转化成植物可吸收利用磷素从而提高植物对磷的吸收进而促进植物生长的细菌,筛选具有高效解磷特点的解磷菌已成为我国农业微生物技术领域的热点研究课题。
中国盐碱土总面积超过约14.87亿亩,占我国总可利用土壤面积的4.88%。同时,沿海地区设施农业的大面积扩张,导致地下水过度开采,进而导致海水上漾,耕作土以及灌溉水中盐度超标,严重制约着地表植被生长。利用解磷菌来溶解释放土壤中的磷,促进植物生长,对于提高土地利用效率具有积极的生态意义。
目前,已报道的解磷菌,不论是不同菌属还是同一菌属不同菌种,解磷效能高低不齐,解磷机理不同,在盐碱地中的应用效果不一。因此,筛选既能耐受酸碱又能耐受高盐环境的解磷菌,以及探究解磷菌的最佳施入量,对于促进植物生长、提高土地利用效率具有重要的生态意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种既能耐受酸碱又能耐受高盐环境的广适pH耐盐解磷菌。
本发明的第二个目的在于提供上述广适pH耐盐解磷菌在pH为2~10、NaCl的质量浓度为1~5%的环境下的应用。
为了实现上述第一个目标,本发明采用如下的技术方案:
一株广适pH耐盐解磷菌,其特征在于,所述广适pH耐盐解磷菌为假单胞菌PSBDYJP20210001,拉丁文名称为Pseudomonassp.PSBDYJP20210001,其能够耐受pH为2~10、NaCl浓度为1~5%的环境条件,同时具有较高的解磷功能,该假单胞菌PSBDYJP20210001保藏于:中国典型培养物保藏中心,保藏地址为:中国武汉,保藏日期为:2021年09月13日,保藏编号为:CCTCC NO:M 20211169。
为了实现上述第二个目标,本发明采用如下的技术方案:
1、前述的广适pH耐盐解磷菌(假单胞菌PSBDYJP20210001)在促进盐地碱蓬种子萌发中的应用,其特征在于,促进盐地碱蓬种子萌发的步骤包括:
(1)用LB富集培养基将假单胞菌PSBDYJP20210001培养至对数生长期,然后接种到NBRIP液体培养基中,之后以30℃、220r/min震荡培养24h,得到解磷菌液;
(2)将盐地碱蓬种子消毒;
(3)用步骤(1)得到定解磷菌液浸泡步骤(2)得到的消毒后的盐地碱蓬种子,浸泡时间5天。
2、前述的广适pH耐盐解磷菌(假单胞菌PSBDYJP20210001)在促进盐地碱蓬植株生长中的应用,其特征在于,促进盐地碱蓬植株生长的步骤包括:
(1)用LB富集培养基将假单胞菌PSBDYJP20210001培养至对数生长期,然后接种到NBRIP液体培养基中,之后以30℃、220r/min震荡培养24h,得到解磷菌液;
(2)将盐地碱蓬种子消毒,然后置于28℃培养箱中培养待种子发芽;
(3)用水浇灌土壤,使土壤水分含量达到最大持水量的80%,然后用步骤(1)得到的解磷菌液浇灌土壤,之后在24h内向土壤中种植步骤(2)得到的已经催芽的盐地碱蓬种子。
本发明的有益之处在于:
(1)本发明筛选得到的广适pH耐盐解磷菌——假单胞菌PSBDYJP20210001,能够耐受pH为2~10、NaCl浓度为1~5%的环境条件,同时具有较高的解磷功能;用该假单胞菌PSBDYJP20210001的培养液浸泡盐地碱蓬的种子,可以明显提高盐地碱蓬种子的发芽率;用该假单胞菌PSBDYJP20210001的培养液浇灌种植盐地碱蓬的土壤,可以明显提高盐地碱蓬的株高、根长、根系直径和根尖数。
(2)本发明筛选得到的广适pH耐盐解磷菌——假单胞菌PSBDYJP20210001,通过将土壤中的难溶性或不溶性磷转化为速效磷或可溶性磷贮存与土壤中,促进植物吸收利用,从而促进植物生长,对提高土地利用效率具有积极的生态意义。
附图说明
图1是本发明筛选得到的假单胞菌PSBDYJP20210001的溶磷圈图;
图2是本发明筛选得到的假单胞菌PSBDYJP20210001的***发育树;
图3是本发明筛选得到的假单胞菌PSBDYJP20210001在pH=2~10的范围内的解磷量图;
图4是本发明筛选得到的假单胞菌PSBDYJP20210001在NaCl的质量浓度为1~5%的范围内的解磷量图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、培养基
1、蒙金娜无机磷固体培养基
蒙金娜无机磷固体培养基的配方如下:葡萄糖10g,(NH4)2SO40.5g,NaCl 10g,KCl0.3g,MgSO4·7H2O 0.3g,FeSO4·7H20 0.036g,MnS04·4H2O 0.03g,Ca3(P04)2 5g,琼脂18g,蒸馏水1000mL,Tris-HCl调节pH为8。
2、LB富集培养基
LB富集培养基的配方如下:胰蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl 10g,蒸馏水1000mL。
3、NBRIP液体培养基
NBRIP液体培养基的配方如下:葡萄糖10g,Ca3(P04)2 5g,MgCl25g,MgSO40.25g,KCl0.2g,(NH 4)2SO4 0.1g,蒸馏水1000mL,调节pH为7.0。
二、广适pH耐盐解磷菌——假单胞菌PSBDYJP20210001的分离、纯化和鉴定
1、假单胞菌PSBDYJP20210001的分离、纯化
土样取自山东东营黄河口盐碱地,将10g土样置于装有90mL蒸馏水的500mL锥形瓶中,将混合液进行十倍梯度稀释,取合适的稀释度分别涂布到蒙金娜无机磷固体培养基(平板)上,30℃培养4天(图1),选取有明显溶磷圈的菌落,并将该菌落进行划线纯化,编号PSBDYJP20210001,4℃保存备用。
将菌株PSBDYJP20210001在LB富集培养基中以30℃、220r/min震荡培养,当菌液出现浑浊并且挂壁后进行保种。
2、菌株PSBDYJP20210001的鉴定
将菌株PSBDYJP20210001进行16S rDNA扩增、测序、拼接后得到基因序列,经与Genbank数据库中的微生物序列进行BLAST分析,发现该菌株的16S rDNA序列与假单胞菌的同源性为99%以上,已将该菌株的序列上传GenBank数据库,得到登录号为OL305679。
利用MEGA邻接法构建***发育树,结果见图2。图2表明:菌株PSBDYJP20210001与假单胞菌聚为一支。
三、假单胞菌PSBDYJP20210001的解磷活性的测定
采用LB富集培养基对假单胞菌PSBDYJP20210001进行活化,30℃培养至对数生长期,然后按10%的接种量接种到装有100mL NBRIP液体培养基的锥形瓶中,最后30℃摇床220r/min振荡培养24h。
以0mg、0.2mg、0.4mg、0.6mg、0.8mg和1.0mg磷标准系列溶液与空白对照在波长700nm下同时比色,记录数值。以测得的吸光度为纵坐标,磷浓度为纵坐标,绘制成磷标准曲线。
为了对假单胞菌PSBDYJP20210001的解磷能力进行测定,采用钼锑钪比色法测定假单胞菌PSBDYJP20210001的解磷量,磷酸钙为无机磷唯一磷源,测定假单胞菌PSBDYJP20210001解无机磷能力的大小。
假单胞菌PSBDYJP20210001与其他解磷菌的解磷能力对比见表1。
表1解磷能力对比
菌株 | PSBDYJP20210001 | QDZN-13 | DC-3-P |
解磷量(mg/L) | 182±7.5 | 175.83±1.2 | 158.24 |
由表1可知:假单胞菌PSBDYJP20210001的解磷性强于常见的解磷细菌的解磷性。
四、假单胞菌PSBDYJP20210001的耐酸碱范围的测定
为了对假单胞菌PSBDYJP20210001的耐酸碱范围进行测定,用LB富集培养基将假单胞菌PSBDYJP20210001培养至对数生长期,然后以10%的接种量接种到装有100mL NBRIP液体培养基的锥形瓶中,并利用HCl和NaOH调节酸碱度,之后以30℃、220r/min震荡培养24h,最后采用钼锑钪比色法测定假单胞菌PSBDYJP20210001的解磷量,磷酸钙为无机磷唯一磷源,测定假单胞菌PSBDYJP20210001解无机磷能力的大小。
假单胞菌PSBDYJP20210001在pH=2~10的范围内的解磷量见图3。
假单胞菌PSBDYJP20210001与其他解磷菌耐酸碱范围(pH)对比见表2。
表2耐酸碱范围(pH)对比
菌株 | PSBDYJP20210001 | QL1501 |
耐酸碱范围(pH) | 2~10 | 7~9 |
假单胞菌PSBDYJP20210001与其他解磷菌解磷量对比见表3。
表3解磷量对比
由图3以及表2和表3可知:假单胞菌PSBDYJP20210001的耐酸碱度范围和解磷量均强于常见的解磷细菌的耐酸碱度范围和解磷量。
五、不同pH的假单胞菌PSBDYJP20210001培养液(解磷菌液)对盐地碱蓬种子发芽率的影响
用LB富集培养基将假单胞菌PSBDYJP20210001培养至对数生长期,然后通过添加HCl和NaOH调节酸碱度,pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10,之后以30℃、220r/min震荡培养24h,得到不同pH的假单胞菌PSBDYJP20210001培养液(即不同pH的解磷菌液),待用。
种子消毒:先用70%的酒精对盐地碱蓬种子消毒1min,再用1%次氯酸钠对盐地碱蓬种子消毒15min,最后用无菌水冲洗盐地碱蓬种子5次。
取灭菌后的培养皿30个,分为10组,每组3个,每个培养皿中均放入50粒经消毒的盐地碱蓬种子。将前面获得的9份不同pH(pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10)的解磷菌液分别加入前9组培养皿中,保证没过盐地碱蓬种子,将蒙金娜无机磷液体培养基加入第10组培养皿中(作为对照),也保证没过盐地碱蓬种子,将全部培养皿置于28℃培养箱中,等待盐地碱蓬种子发芽。每天定时观察统计每个培养皿中被浸泡的盐地碱蓬种子的发芽率。
实验重复3次,结果取平均值。
不同pH的解磷菌液对盐地碱蓬发芽率的影响见表4。
表4不同pH的解磷菌液对盐地碱蓬种子发芽率的影响
注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
从表4可以看出:解磷菌液的pH为5、6、7时,盐地碱蓬种子的发芽率显著高于对照组;解磷菌液的pH为5时,盐地碱蓬种子的发芽率显著高于其余不同pH的解磷菌液(p<0.05)。
六、不同pH的假单胞菌PSBDYJP20210001培养液(解磷菌液)对盐地碱蓬植株性状的影响
供试土壤:取自山东东营黄河口盐碱地。
解磷菌:假单胞菌PSBDYJP20210001。
植物:盐地碱蓬。
将供试土壤装入高11cm、盆口直径13cm、盆底直径9cm的塑料盆中,每盆土干重1kg,用蒸馏水补充土壤水分,使土壤水分含量达到最大持水量的80%。
用LB富集培养基将假单胞菌PSBDYJP20210001培养至对数生长期,然后利用HCl和NaOH调节酸碱度,pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10,之后以30℃、220r/min震荡培养24h,得到不同pH的假单胞菌PSBDYJP20210001培养液(即不同pH的解磷菌液),同时设置未加入假单胞菌PSBDYJP20210001的LB富集培养基为对照组。
种子消毒:先用70%的酒精对盐地碱蓬种子消毒1min,再用1%的次氯酸钠对盐地碱蓬种子消毒15min,最后用无菌水冲洗盐地碱蓬种子5次。
取灭菌后的培养皿,将消毒后的盐地碱蓬种子放于培养皿中,置于28℃培养箱中培养待种子发芽。
将LB富集培养基和不同pH的解磷菌液分别浇灌到不同的塑料盆中,每盆100mL,在24h内向塑料盆中种植已经催芽的盐地碱蓬种子,每盆播种50粒,在播种20天后,对植株的株高进行测量统计;同时采用根系扫描仪对植株的根系进行分析,具体涉及根长、根系直径、根尖数。
实验重复3次,结果取平均值。
不同pH的解磷菌液对盐地碱蓬植株性状的影响见表5。
表5不同pH的解磷菌液对盐地碱蓬地上、地下生长的影响
注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
从表5可以看出:解磷菌液的pH为4、5、6、7时,盐地碱蓬植株的株高、根长、根系直径、根尖数均高于对照组;解磷菌液的pH为2~9时,盐地碱蓬植株的株高、根长均高于对照组;解磷菌液的pH为5时,盐地碱蓬植株的株高、根长、根系直径、根尖数均显著高于其余不同pH的解磷菌液(p<0.05)。
七、假单胞菌PSBDYJP20210001的耐盐度范围的测定
为了对假单胞菌PSBDYJP20210001d的耐盐度范围进行测定,通过添加NaCl调节盐浓度范围,采用钼锑钪比色法测定假单胞菌PSBDYJP20210001的解磷量,磷酸钙为无机磷唯一磷源,测定假单胞菌PSBDYJP20210001解无机磷能力的大小。
假单胞菌PSBDYJP20210001在不同盐浓度条件下的解磷量见图4。
假单胞菌PSBDYJP20210001与其他解磷菌在不同盐浓度条件下的解磷量对比见表6。
表6解磷量对比
由图4和表6可知:假单胞菌PSBDYJP20210001的耐盐度范围强于常见的解磷细菌。
八、不同盐浓度的假单胞菌PSBDYJP20210001培养液(解磷菌液)对盐地碱蓬种子发芽率的影响
用LB富集培养基将假单胞菌PSBDYJP20210001培养至对数生长期,然后以10%的接种量接种到装有100mL NBRIP液体培养基的三角瓶中,通过添加NaCl调节盐浓度范围,盐浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%,之后以30℃、220r/min震荡培养24h,得到不同盐浓度的假单胞菌PSBDYJP20210001培养液(即不同盐浓度的解磷菌液),待用。
种子消毒:先用70%的酒精对盐地碱蓬种子消毒1min,再用1%的次氯酸钠对盐地碱蓬种子消毒15min,最后用无菌水冲洗对盐地碱蓬种子5次。
取灭菌后的培养皿30个,分为6组,每组5个,每个培养皿中均放入50粒消毒后的盐地碱蓬种子。将以上获得的5种盐浓度(盐浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%)的解磷菌液分别加入到前5组培养皿中,保证没过盐地碱蓬种子,将蒙金娜无机磷液体培养基加入到第6组培养皿中(作为对照),也保证没过盐地碱蓬种子,将全部培养皿置于28℃培养箱中,等待种子发芽。每天定时观察统计每个培养皿中被浸泡的盐地碱蓬种子的发芽率。
实验重复3次,结果取平均值。
不同盐浓度的解磷菌液对盐地碱蓬种子发芽率的影响见表7。
表7不同盐浓度的解磷菌液对盐地碱蓬种子发芽率的影响
注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由表7可知:在浸泡种子的第2天,1%盐浓度的解磷菌液已经表现出比其他盐浓度的解磷菌液更好的催芽效果;从浸泡种子的第3天开始,2%盐浓度的解磷菌液对盐地碱蓬种子的催芽效果好于对照组的效果;在浸泡种子的第5天,浸泡种子的各解磷菌液仍保持较高的催芽效果(p<0.05)。
九、不同盐浓度的假单胞菌PSBDYJP20210001解磷菌液对盐地碱蓬植株性状的影响
供试土壤:取自山东东营黄河口盐碱地。
解磷菌:假单胞菌PSBDYJP20210001。
植物:盐地碱蓬。
将供试土壤装入高11cm、盆口直径13cm、盆底直径9cm的塑料盆中,每盆土干重1kg,用蒸馏水补充土壤水分,使土壤水分含量达到最大持水量的80%。
用LB富集培养基将假单胞菌PSBDYJP20210001培养至对数生长期,然后利用NaCl调节盐浓度范围,盐浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%,之后以30℃、220r/min震荡培养24h,得到不同盐浓度的假单胞菌PSBDYJP20210001培养液(即不同盐浓度的解磷菌液),同时设置未加入假单胞菌PSBDYJP20210001的LB富集培养基为对照组。
种子消毒:先用70%的酒精对盐地碱蓬种子消毒1min,再用1%的次氯酸钠对盐地碱蓬种子消毒15min,最后用无菌水冲洗盐地碱蓬种子5次。
取灭菌后的培养皿,将消毒后的盐地碱蓬种子放于培养皿中,置于28℃培养箱中培养待种子发芽。
将LB富集培养基和不同盐浓度的解磷菌液分别浇灌到不同的塑料盆中,每盆100mL,在24h内向塑料盆中种植已经催芽的盐地碱蓬种子,每盆播种50粒,在播种20天后,对植株的株高进行测量统计;同时采用根系扫描仪对植株的根系进行分析,具体涉及根长、根系直径、根尖数。
实验重复3次,结果取平均值。
不同盐浓度的解磷菌液对盐地碱蓬植株性状的影响见表8。
表8不同盐浓度的解磷菌液对盐地碱蓬植株性状的影响
注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
从表8可以看出:解磷菌液的盐浓度为1%、2%、3%时,盐地碱蓬植株的株高、根长、根系直径、根尖数均高于对照组;解磷菌液的盐浓度为1%时,盐地碱蓬植株的株高、根长、根系直径、根尖数均显著高于其余盐浓度的解磷菌液(p<0.05)。
综上,本发明筛选得到的广适pH耐盐解磷菌——假单胞菌PSBDYJP20210001,能够耐受pH为2~10、NaCl浓度为1~5%的环境条件,同时具有较高的解磷功能;用该假单胞菌PSBDYJP20210001的培养液浸泡盐地碱蓬的种子,可以明显提高盐地碱蓬种子的发芽率;用该假单胞菌PSBDYJP20210001的培养液浇灌种植盐地碱蓬的土壤,可以明显提高盐地碱蓬的株高、根长、根系直径和根尖数。
本发明筛选得到的广适pH耐盐解磷菌——假单胞菌PSBDYJP20210001,通过将土壤中的难溶性或不溶性磷转化为速效磷或可溶性磷贮存与土壤中,促进植物吸收利用,从而促进植物生长,对提高土地利用效率具有积极的生态意义。
需要说明的是,上述实施例不以任何形式限制本发明,凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案,均落在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一株广适pH耐盐解磷菌,其特征在于,所述广适pH耐盐解磷菌为假单胞菌PSBDYJP20210001,拉丁文名称为Pseudomonassp. PSBDYJP20210001,其能够耐受pH为2~10、NaCl浓度为1~5%的环境条件,同时具有较高的解磷功能,该假单胞菌PSBDYJP20210001保藏于:中国典型培养物保藏中心,保藏地址为:中国武汉,保藏日期为:2021年09月13日,保藏编号为:CCTCC NO:M 20211169。
2.权利要求1所述的广适pH耐盐解磷菌在促进盐地碱蓬种子萌发中的应用,其特征在于,促进盐地碱蓬种子萌发的步骤包括:
(1)用LB富集培养基将假单胞菌PSBDYJP20210001培养至对数生长期,然后接种到NBRIP液体培养基中,之后以30℃、220r/min震荡培养24h,得到解磷菌液;
(2)将盐地碱蓬种子消毒;
(3)用步骤(1)得到的解磷菌液浸泡步骤(2)得到的消毒后的盐地碱蓬种子,浸泡时间5天。
3.权利要求1所述的广适pH耐盐解磷菌在促进盐地碱蓬植株生长中的应用,其特征在于,促进盐地碱蓬植株生长的步骤包括:
(1)用LB富集培养基将假单胞菌PSBDYJP20210001培养至对数生长期,然后接种到NBRIP液体培养基中,之后以30℃、220r/min震荡培养24h,得到解磷菌液;
(2)将盐地碱蓬种子消毒,然后置于28℃培养箱中培养待种子发芽;
(3)用水浇灌土壤,使土壤水分含量达到最大持水量的80%,然后用步骤(1)得到的解磷菌液浇灌土壤,之后在24h内向土壤中种植步骤(2)得到的已经催芽的盐地碱蓬种子。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,在步骤(3)中,解磷菌液的浇灌量为100mL/kg。
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CN113373096A (zh) * | 2021-07-21 | 2021-09-10 | 盐城师范学院 | 一种蜡样芽孢杆菌及其在缓解植物盐胁迫中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
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