CN113480619A - 多肽及其在新型冠状病毒检测中的应用 - Google Patents

多肽及其在新型冠状病毒检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种多肽及其在新型冠状病毒检测中的应用。所述多肽包括如下部分：S——Linker——N——avi‑tag。通过经过优化的刚性linker序列把S蛋白和N蛋白串联起来，使得这两个蛋白即具备相对独立的空间构象，又增加了许多优势表位，很大程度上提高了灵敏度和信号值；此外，融合蛋白引入Avi‑tag，使得重组蛋白可以通过固定的位点被固相化，降低包被过程所带来的空间位阻的影响。由此，该多肽能够达到很高的灵敏度和特异性，并且不易发生漏检。

Description

多肽及其在新型冠状病毒检测中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种多肽及其在新型冠状病毒检测中的应用。
背景技术
2019新型冠状病毒，被世界卫生组织命名为“2019-nCoV”，后被国际病毒分类委员会命名为“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)”。感染新冠病毒的肺炎患者以发热、乏力、干咳等为主要症状，少数患者伴有鼻塞、流涕以及腹泻等呼吸道和消化道病症，重症患者可在1周后出现呼吸困难症状，严重者快速发展为急性呼吸窘迫综合症、脓毒休克症等，严重威胁人民生命健康，也给全球经济造成巨大损失。新冠病毒传播性强速度快，致死率高，无症状情况下依然具有很强的传染性，潜伏期长达14天，高质量的诊断试剂有助于早日发现感染人群并及时切断传播途径。
SARS-CoV-2是一种有囊膜结构的单正链RNA病毒，属于β属冠状病毒，呈椭圆形或圆形，直径60-140nm。囊膜由刺突表面蛋白(Spike protein，S)、膜蛋白(MembraneProtein，M)、包膜蛋白(Envelope Protein，E)以及核衣壳蛋白(Nucleoprotein，N)构成，其中S1和S2由两个亚基组成。S蛋白和N蛋白具有很强的抗原性，在诱导宿主免疫应答与发病机制中发挥重要作用。S蛋白是新冠病毒入侵人体细胞的关键，通过S蛋白上的受体结合域(RBD)与宿主细胞的血管紧张素转化酶2(ACE2)产生特异性结合，从而介导病毒进入宿主细胞。N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA合成过程中发挥重要作用。N蛋白氨基酸序列相对保守，在所有结构蛋白中占比大，感染早期机体能产生抗N蛋白高水平抗体。因此，新冠抗体诊断试剂主要使用的是刺突蛋白(S)和核衣壳蛋白(N)。
目前针对SARS-CoV-2的检测主要是以PCR为基础的病毒核酸检测，通过PCR实现靶基因的指数级增加，从而收集靶基因的荧光信号确认样本中含有病毒核酸。该核酸检测方法具有较高的特异性及灵敏度，已作为国家确认感染与否的金标准。但是，该检测方法依然存在明显不足，如：技术要求高、设备要求高(需要荧光PCR)、标本需特殊处理、容易出现假阴性导致漏检以及在社区、基层医院、海关等地的早期筛查比较耗时不利于普及。因此开发出一种更早期、准确、快捷、有效的新冠病毒诊断试剂迫在眉睫。
机体感染病原体后，可在体内检测出相应的抗原成分，尤其是在急性感染期病毒载量较高时，抗原检测可快速检测出阳性病例，能够快速辅助诊断疑似患者和辅助排查重点人群。但是抗原检测所需要的可信材料高灵敏度、高特异性的抗体制备周期长，且与其他SARS-CoV N蛋白存在交叉反应的干扰，灵敏度也不如核酸检测试剂，因此仅可作为现有检测方法的补充。病原体入侵机体，IgM抗体是人体免疫***中最早产生的抗体，血清中特异性IgM增高，提示有近期感染。IgG抗体产生要比IgM晚，是既往感染的指标。检查疑似患者血清中的IgM和IgG抗体有助于诊断SARS-CoV-2感染，因此血清抗体检测是诊断具有典型临床特征患者SARS-CoV-2感染的非常重要的证据。
发明内容
本发明涉及一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
根据本发明的第二方面，涉及编码如上所述的多肽的核酸。
根据本发明的第三方面，涉及含有如上所述核酸的载体。
根据本发明的第四方面，涉及宿主细胞，其含有如上所述的核酸，或被如上所述的载体所转化。
根据本发明的第五方面，涉及新冠肺炎检测试剂盒，其含有如上所述的多肽、抗抗体以及固相支持物；
所述抗抗体为抗受试样品来源种属免疫球蛋白的抗体；
所述多肽中的AviTag标签预先被生物素化，并通过该生物素化的AviTag标签缀合于所述固相支持物上。
根据本发明的第七方面，涉及如上所述的多肽在制备SARS-CoV-2抗体检测试纸条或试剂盒中的应用。
本发明的有益效果为：
通过经过优化的刚性linker序列把S蛋白和N蛋白串联起来，使得这两个蛋白即具备相对独立的空间构象，又增加了许多优势表位，很大程度上提高了灵敏度和信号值；此外，融合蛋白引入Avi-tag，使得重组蛋白可以通过固定的位点被固相化，降低包被过程所带来的空间位阻的影响。由此，该多肽能够达到很高的灵敏度和特异性，并且不易发生漏检。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中所提供多肽的结构示意图；
图2为本发明一个实施例中pCMV3L的载体图谱；
图3为本发明一个实施例中制备的SARS-CoV-2-S+N重组抗原的电泳结果图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“多肽”或“蛋白质”是指包含至少两个由肽键连接以形成多肽的氨基酸残基的分子。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指核苷酸(例如，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的多聚体，并且包括天然存在的(腺苷、胍、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷)、非天然存在的和修饰的核酸。该术语不受多聚体长度(例如，单体数目)的限制。核酸可以是单链或双链的，并且将通常含有5'-3'磷酸二酯键，尽管在一些情况下，核苷酸类似物可能具有其他键。单体一般被称为核苷酸。术语“非天然核苷酸”或“修饰的核苷酸”是指含有修饰的含氮碱基、糖或磷酸基团，或在其结构中掺入非天然部分的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括双脱氧核苷酸，生物素化的，氨基化的，脱氨基的，烷基化的，苄化的和荧光团标记的核苷酸。术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品(例如，包装或容器)，其包括如本文所述的用于特异性扩增、捕获、标记/转化或检测如本文所述的靶核酸序列的固相支持体。试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
在本申请中使用术语“检测”和类似术语来概括地指过程或发现或确定某事物的存在或不存在，以及程度、数量或水平，或发生的概率。要理解的是，表述“检测存在或不存在”、“存在或不存在的检测”和相关表述包括定性和定量检测。例如，定量检测包括确定样品中SARS-CoV-2有关的核酸序列的水平、数量或量。
本发明涉及一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
所述多肽包括如下部分：S——Linker——N——avi-tag。
通过经过优化的刚性linker序列把S蛋白和N蛋白串联起来，使得这两个蛋白即具备相对独立的空间构象，又增加了许多优势表位，很大程度上提高了灵敏度和信号值；此外，融合蛋白引入Avi-tag，使得重组蛋白可以通过固定的位点被固相化，降低包被过程所带来的空间位阻的影响。由此，该多肽能够达到很高的灵敏度和特异性，并且不易发生漏检。经验证，六个重复的刚性Linker可以更好的达到设计预期，维持蛋白在空间结构上的相对独立性。Avi-tag标签蛋白比较小，靠C端的设计可实现足够的展开空间，有利于提高固相例如磁珠的包被效率，在化学发光端的应用性更好。
在一些实施方式中，所述多肽的N端还连接有信号肽。
在一些实施方式中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一些实施方式中，所述的多肽C端还连接有标签蛋白。
在一些实施方式中，所述标签蛋白为小分子量标签蛋白，例如分子量低于1kD或者氨基酸数量小于20个(例如19、18、17、16、15、14、13、12、11或者10个)。
在一些实施方式中，所述标签蛋白选自His、HA、c-Myc、AviTag、SNAP-Tag或Flag标签。
在一些实施方式中，所述His标签为10×His、9×His、8×His、7×His或者6×His。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及编码如上所述的多肽的核酸。
所述核酸可以是DNA或者RNA。
本发明还涉及含有如上所述核酸的载体。
术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。
在一个具体的实施方式中，所述载体为pCMV3。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及宿主细胞，其含有如上所述的核酸，或如上所述的载体。
在一些实施方式中，所述宿主细胞不包含能够发育为完整植物的植物细胞，也不包含能够发育为完整动物的动物细胞(例如生殖细胞，具有全能性的干细胞如生殖干细胞和胚胎干细胞，受精卵)。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为原核细胞，例如大肠杆菌。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为真核细胞，例如真菌(酵母等)。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为动物细胞。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为啮齿类动物细胞，例如大鼠、小鼠、仓鼠。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为灵长类动物细胞，优选为人。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为原代细胞，例如肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为细胞系；
常见的细胞系例如：
来源于人的细胞系：
293、IMR-90、W1-38、A549、A431、BHL-100、BeWo、Caco-2、Chang、HCT-15、HeLa、HEK293(HEK293F)、HEp-G2、HEp-2、HT-1080、HT-29、JEG-2、MCF7、KB、Saos-2、WI-38、WISH、WS1、HUVEC、EB-3、Raji、IM-9、Daudi、H9、HL-60、Jurkat、K-562、U937、KG-1；
来源于小鼠的细胞系：
McCoy、BALB/3T3、3T6、A9、AtT-20、Clone M-3、I-10、Y-1、WEHI-3b、ES-D3、F9；
来源于仓鼠的细胞系：
BHK-21、HaK、CHO-K1；
来源于大鼠的细胞系：
AR42J、BRL3A、Clone 9、H4--Ⅱ-E-C3、GH1、GH3、IEC-6、L2、XC、LLC-WRC 256、Jensen、Rat2(TK-)、PC12、L6；
来源于其他动物的细胞系：
D-17、BT、MARC-145、CV-1、COS-1、COS-3、COS-7、Vero、B95-8、CRFK。
本发明还涉及新冠肺炎检测试剂盒，其含有如上所述的多肽、抗抗体以及固相支持物；
所述抗抗体为抗受试样品来源种属免疫球蛋白的抗体；
所述多肽中的AviTag标签预先被生物素化，并通过该生物素化的AviTag标签缀合于所述固相支持物上。
在一些实施方式中，所述固相支持物为试管、EP管、多孔板、微量反应板凹孔、小珠或小圆片。
在本发明中，术语“微粒”可以为球体、近球体、立方体、多面体或不规则形状。微球的直径优选为10nm～1mm，例如100nm、500nm、1μm、10μm、100μm、500μm。
微粒优选为磁微粒，其成分中含有磁性物质。磁性物质可以为金属(金属单质或合金)、非金属，或金属与非金属所形成的复合物。金属例如铁、铝镍钴金属等；非金属例如铁氧体非金属(优选为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子)；金属与非金属所形成的复合物例如钕铁硼橡胶磁复合材料。
多孔板优选为酶标板，其含有的孔位可以为8、16、32、48、64、96或更多。
在一些实施方式中，所述抗抗体与信号物质缀合。
在一些实施方式中，所述新冠肺炎检测试剂盒中还可以包含样品预处理试剂(如样品纯化富集试剂，裂解液等)、清洗液(如PBS等)、缓冲液、针对信号物质的显色试剂(如信号物质为辣根过氧化物酶，则显色试剂为ECL)等。
本发明还涉及新冠肺炎检测试纸条，包括样品垫、结合垫、反应膜和吸收垫，所述反应膜上设置有检测区和质检区；
所述结合垫包被有抗抗体，且所述抗抗体与信号物质缀合；所述抗抗体为抗受试样品来源种属免疫球蛋白的抗体；
所述检测区缀合有如上所述的多肽；所述多肽中的AviTag标签预先被生物素化，并通过该生物素化的AviTag标签缀合于所述检测区。
在一些实施方式中，所述免疫球蛋白为IgG、IgM或IgA中的至少任意一种。
在一些实施方式中，所述抗抗体的种属来源与被检测样品的种属来源不同，常见的可以选择以下种属来源：大鼠、小鼠、犬、山羊、绵羊、马、驴、兔、鸡。
在一些实施方式中，所述信号物质是金属粒子、荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记、放射性标记或酶。
在一些实施方式中，所述信号物质是胶体金、荧光素、荧光微球、吖啶酯、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。下面非限定部分列出这些标记：
·产生可检测信号的酶，如通过比色法、荧光和发光来检测，如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
·发色团，如荧光、量子点、荧光微球、发光化合物和染料。
·具有能被电子显微镜或通过其电特性，如传导性、电流分析、电压测量和电阻等检测的电子密度的基团。
·可检测基团，如其分子大小足以诱导在其物理和/或化学特性上可检测的修饰；这种检测可通过光学方法(如衍射、表面胞质团共振，表面变异和接触变异角度)或物理方法(如原子力谱学和隧道效应)实现。
·电子致密物质，如放射性分子(如32P，35S或125I)。
根据本发明的再一方面，还涉及如上所述的多肽在制备SARS-CoV-2抗体检测试纸条或试剂盒中的应用。
在一些实施方式中，在所述试纸条或试剂盒中，所述多肽通过AviTag标签蛋白缀合在所述试纸条上，或所述试剂盒中的固相支持物上。
在一些实施方式中，所述检测的受试样品选自生物组织或其灌洗液、细胞、体液，进一步选自血液、血清、血浆、抗凝血、细胞培养上清、唾液、***、羊水、绒毛、组织或组织裂解液、咽拭子、鼻拭子、眼结膜拭子、粪便标本、粪便、尿液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、痰液。
上述用途的受试者可以指患者或怀疑携带有SARS-CoV-2的动物，特别是哺乳动物，例如蝙蝠、果子狸；优选为灵长类动物，更优选为人。
使用本发明的重组抗原，制备新型冠状病毒抗体检测试剂盒或试纸条，可有效提高试剂的灵敏度和检出率。
本发明还涉及一种检测SARS-CoV-2抗体的方法，包括：
使用如上所述的多肽、试剂盒或试纸条检测SARS-CoV-2抗体。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1表达克隆构建SARS-CoV-2-S+N-pCMV3L
按照图1所示，选择氨基酸序列，构建新型冠状病毒S+N表达克隆，具体的，linker序列为EAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK，即刚性linker，可以一定距离上明显间隔两个蛋白，维持蛋白在空间结构上的相对独立性。Avi-tag序列为GLNDIFEAQKIEWHE，可以进行定向的生物素化修饰，有助于后期开发高灵敏度诊断试剂。分泌信号肽为新型冠状病毒S氨基酸(Uniprot：P0DTC2)序列aa1-12，S为新型冠状病毒刺突蛋白(Uniprot：P0DTC2)氨基酸序列aa13-1273，N为新型冠状病毒刺突蛋白(Uniprot：A0A6C0T6Z7)氨基酸序列aa1-419。构建表达克隆的具体氨基酸序列如下所示：
AT—MFVFLVLLPLVS—(sqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrarsvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldkveaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt—EAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK—msdngpqnqrnapritfggpsdstgsnqngersgarskqrrpqglpnntaswftaltqhgkedlkfprgqgvpintnsspddqigyyrratrrirggdgkmkdlsprwyfyylgtgpeaglpygankdgiiwvategalntpkdhigtrnpannaaivlqlpqgttlpkgfyaegsrggsqassrsssrsrnssrnstpgssrgtsparmagnggdaalalllldrlnqleskmsgkgqqqqgqtvtkksaaeaskkprqkrtatkaynvtqafgrrgpeqtqgnfgdqelirqgtdykhwpqiaqfapsasaffgmsrigmevtpsgtwltytgaiklddkdpnfkdqvillnkhidayktfpptepkkdkkkkadetqalpqrqkkqqtvtllpaadlddfskqlqqsmssadstqa—GLNDIFEAQKIEWHE)—HHHHHHHHHHH
括号内为SEQ ID NO:1。通过化学合成上述氨基酸后，克隆至表达载体pcMV3L中，获得表达克隆，其载体图谱如图2所示。
实施例2重组蛋白表达及纯化
重组质粒pCMV3L-SARS-CoV-2-S+N转化大肠杆菌Top10感受态细胞中，涂布于含有50ug/ml的抗生素Amp+的LB平板上培养，37度过夜培养后，挑选单菌落到1L含有50ug/ml的抗生素Amp+的LB培养基中进行培养。37℃、200rpm培养16-20h后，离心收集菌体，利用无内毒素质粒抽提试剂盒大量制备重组质粒，质粒要求A260/A280＝1.8-2.0。
复苏并培养细胞，转染前确保细胞健康，存活率高于90％以上。将细胞密度传至1.5-2.5×106个/ml。置于二氧化碳培养摇床内培养，培养摇床设置：温度36.9℃，二氧化碳浓度5％，转速120rpm，培养2-4h。计算好需要转染的细胞量，取一定量的质粒DNA和对应量转染试剂PEI，分别用无菌PBS缓冲液稀释到一定比例。然后将稀释好的转染试剂加入到稀释好的质粒DNA中，迅速混匀后静止10～20min，逐滴加入已准备好的细胞中，37℃，120rpm条件下悬浮培养。培养32-64h后，添加补料液并继续培养32-64h，停止培养、离心收集上清液，此即为SARS-CoV-2-S+N抗原表达产物。
将SARS-CoV-2-S+N重组抗原表达上清使用0.45μm滤膜过滤，用孔径10kda的超滤膜包进行5-10倍的浓缩，获得浓缩上清进行纯化。上样至预先平衡的Ni亲和层析柱中，完成上样后再用平衡缓冲液(pH8.0,100mM Tris-Cl，300mM NaCl)平衡层析柱50柱体积，再依次用20倍柱体积的含有20mM咪唑的平衡液进行洗杂，最后进行20倍柱体积线性洗脱(含有20-500mM咪唑的平衡液)，收集洗脱液，电泳检测(图3)，将含有目的蛋白的洗脱液收集并用10kda孔径的透析袋，透析12h后换液继续进行透析，最终获得SARS-CoV-2-S+N样品。
实施例3活性分析
将制备好的SARS-CoV-2-S+N利用Elisa方法进行灵敏度以及特异性的检测，分别包被抗原(SARS-CoV-2-S+N；SARS-CoV-2-S；SARS-CoV-2-N)，灵敏度检测一抗用新冠病毒诊断试剂嵌合抗体(自产)，特异性性检测采用阴性血清，然后二抗用鼠抗人IgG-HRP，添加底物进行显色，反应10min后，终止液终止反应。酶标仪读取波长450的吸光值：
1.将目标抗原及对照抗原用CB稀释液稀释5ug/ml和10ug/ml取100ul包板过夜(4度)；
2.将酶标板清洗，加封闭液(湖中英创稀释)150ul，室温封闭5-24h左右；
3.清洗后酶标板加嵌合抗体(一抗)，稀释梯度103,104,105倍，加100ul，37度孵育1h；
血清稀释100倍，加100ul，37度孵育1h；
4.清洗酶标板后加鼠抗人IgG(标记HRP)，稀释1万倍，加100ul，37度孵育0.5h，洗板；
5.清洗后加底物(TMD)100ul，反应10min；
6.加终止液，用酶标仪进行读数(双数值630，450)，初步判断活性情况。
灵敏度分析
Figure BDA0003232153760000121
比较Elisa数据，发现融合蛋白相同包被量的SARS-CoV-2-S+N的测试信号值明显高于单体蛋白SARS-CoV-2-N和SARS-CoV-2-S，灵敏度得到很大提升。
特异性分析
N S S+N
T1 0.441 0.236 0.214
T2 0.396 0.153 0.135
T3 1.116 0.441 0.163
T4 0.358 0.315 0.14
T5 0.295 0.272 0.171
T6 0.374 0.342 0.181
T7 0.887 0.446 0.167
T8 0.282 0.231 0.14
T9 0.333 0.285 0.299
T10 0.207 0.198 0.178
T11 0.709 0.335 0.213
T12 0.885 0.329 0.234
T13 0.446 0.213 0.104
T14 0.362 0.35 0.162
T15 0.853 0.656 0.184
T16 0.458 0.45 0.175
T17 0.308 0.27 0.177
T18 0.363 0.177 0.121
T19 0.982 0.151 0.106
T20 0.427 0.194 0.147
T21 0.311 0.228 0.18
T22 0.472 0.167 0.119
T23 0.374 0.15 0.123
T24 0.666 0.305 0.241
测试24例阴性体检血，发现SARS-CoV-2-S+N出现多例假阳性信号且总体测试值本底较高；而对于阴性体检血的信号比较，SARS-CoV-2-S+N较SARS-CoV-2-S特异性更好。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司
<120> 多肽及其在新型冠状病毒检测中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1725
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 1
Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr
1 5 10 15
Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg
20 25 30
Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser
35 40 45
Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr
50 55 60
Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe
65 70 75 80
Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr
85 90 95
Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr
100 105 110
Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe
115 120 125
Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu
130 135 140
Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser
145 150 155 160
Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn
165 170 175
Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr
180 185 190
Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe
195 200 205
Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr
210 215 220
Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly
225 230 235 240
Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly
245 250 255
Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr
260 265 270
Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys
275 280 285
Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser
290 295 300
Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile
305 310 315 320
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
325 330 335
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
340 345 350
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
355 360 365
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
370 375 380
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
385 390 395 400
Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
405 410 415
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
420 425 430
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
435 440 445
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
450 455 460
Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
465 470 475 480
Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr
485 490 495
Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
500 505 510
Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn
515 520 525
Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn
530 535 540
Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr
545 550 555 560
Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr
565 570 575
Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr
580 585 590
Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val
595 600 605
Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr
610 615 620
Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly
625 630 635 640
Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala
645 650 655
Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala
660 665 670
Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly
675 680 685
Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr
690 695 700
Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr
705 710 715 720
Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu
725 730 735
Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn
740 745 750
Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu
755 760 765
Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp
770 775 780
Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro
785 790 795 800
Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu
805 810 815
Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile
820 825 830
Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val
835 840 845
Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala
850 855 860
Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala
865 870 875 880
Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly
885 890 895
Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala
900 905 910
Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser
915 920 925
Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala
930 935 940
Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala
945 950 955 960
Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu
965 970 975
Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu
980 985 990
Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala
995 1000 1005
Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln
1010 1015 1020
Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe
1025 1030 1035 1040
Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1045 1050 1055
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp
1060 1065 1070
Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr
1075 1080 1085
His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr
1090 1095 1100
Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile
1105 1110 1115 1120
Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe
1125 1130 1135
Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val
1140 1145 1150
Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln
1155 1160 1165
Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser
1170 1175 1180
Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp
1185 1190 1195 1200
Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val
1205 1210 1215
Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu
1220 1225 1230
Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp
1235 1240 1245
Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr Glu Ala Ala
1250 1255 1260
Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
1265 1270 1275 1280
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met Ser Asp Asn Gly
1285 1290 1295
Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr Phe Gly Gly Pro Ser
1300 1305 1310
Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg Ser Gly Ala Arg Ser
1315 1320 1325
Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe
1330 1335 1340
Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro Arg Gly
1345 1350 1355 1360
Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly
1365 1370 1375
Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met
1380 1385 1390
Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro
1395 1400 1405
Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val
1410 1415 1420
Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg
1425 1430 1435 1440
Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr
1445 1450 1455
Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln
1460 1465 1470
Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser
1475 1480 1485
Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn
1490 1495 1500
Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln
1505 1510 1515 1520
Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr
1525 1530 1535
Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys
1540 1545 1550
Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg
1555 1560 1565
Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg
1570 1575 1580
Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro
1585 1590 1595 1600
Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr
1605 1610 1615
Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp
1620 1625 1630
Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile
1635 1640 1645
Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys
1650 1655 1660
Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln
1665 1670 1675 1680
Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys
1685 1690 1695
Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala Gly Leu
1700 1705 1710
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1715 1720 1725
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 2
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser
1 5 10

Claims (10)

1.多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
可选的，所述的多肽N端还连接有信号肽；
可选的，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
可选的，所述的多肽C端还连接有标签蛋白；
可选的，所述标签蛋白为His、Flag、HA、c-Myc、AviTag、SNAP或Flag标签。
2.编码权利要求1所述的多肽的核酸。
3.含有权利要求2所述核酸的载体。
4.宿主细胞，其含有权利要求2所述的核酸，或被权利要求3所述的载体所转化。
5.新冠肺炎检测试剂盒，其含有权利要求1所述的多肽、抗抗体以及固相支持物；
所述抗抗体为抗受试样品来源种属免疫球蛋白的抗体；
所述多肽中的AviTag标签预先被生物素化，并通过该生物素化的AviTag标签缀合于所述固相支持物上；
可选的，所述固相支持物为试管、EP管、多孔板、微量反应板凹孔、小珠或小圆片；
可选的，所述抗抗体与信号物质缀合。
6.新冠肺炎检测试纸条，包括样品垫、结合垫、反应膜和吸收垫，所述反应膜上设置有检测区和质检区；
所述结合垫包被有抗抗体，且所述抗抗体与信号物质缀合；所述抗抗体为抗受试样品来源种属免疫球蛋白的抗体；
所述检测区缀合有权利要求1所述的多肽；所述多肽中的AviTag标签预先被生物素化，并通过该生物素化的AviTag标签缀合于所述检测区。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，或权利要求6所述的试纸条，所述免疫球蛋白为IgG、IgM或IgA中的至少任意一种。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，或权利要求6所述的试纸条，所述信号物质是金属粒子、荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记、放射性标记或酶。
9.权利要求1所述的多肽在制备SARS-CoV-2抗体检测试纸条或试剂盒中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述检测的受试样品选自生物组织或其灌洗液、细胞、体液，进一步选自血液、血清、血浆、抗凝血、细胞培养上清、唾液、***、羊水、绒毛、组织或组织裂解液、咽拭子、鼻拭子、眼结膜拭子、粪便标本、粪便、尿液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、痰液。
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