CN112415205A - 检测eb病毒/hcmv的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种针对EB病毒、HCMV的核酸适配体检测试剂盒，还提供了试剂盒的制备方法和应用。此试剂盒检测时具有操作简单、反应迅速、准确性高和灵敏度高的特点，可结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等检测装置，就可以实现对于两种病毒的精确检测。试剂盒灵敏度较高、特异性好、测量范围宽、操作简单、可以同时检测两种病毒、有着良好的市场前景。

Description

检测EB病毒/HCMV的试剂盒及其应用
技术领域
本申请涉及生物体外检测，具体地说，本发明涉及同时检测EB病毒/HCMV的试剂盒，制备试剂盒的方法，以及试剂盒在同时检测EB病毒、HCMV样本中的应用。
背景技术
EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是疱疹病毒科，嗜淋巴细胞病毒属的一种病毒，是一种DNA病毒。EB病毒具有在体内外专一性地感染人类及某些灵长类B细胞的生物学特性。人类是EB病毒感染的主要宿主，主要通过唾液进行传播，无症状感染主要发生在幼儿时期，据调查显示3～5岁幼儿90％以上曾感染EB病毒，90％以上的成人都有病毒抗体。EB病毒是传染性单核细胞增多症的病原体，此外EB病毒与鼻咽癌、儿童淋巴瘤的发生有密切相关性，被列为可能致癌的人类肿瘤病毒之一。目前可以通过EB病毒抗体进行病毒检测，主要有针对病毒的衣壳抗原(CA)、早期抗原(EA)和核抗原(EBNA)。
巨细胞病毒(Cytomegalovirus)，又称为细胞包涵体病毒，是疱疹病毒科的一种病毒，是一种DNA病毒。感染巨细胞病毒的细胞会产生肿大，并具有巨大的核内包涵体。巨细胞病毒对宿主或者培养的细胞有高度的种特异性。人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是疱疹病毒家族中基因组最大的成员。巨细胞病毒分布广泛，其他动物皆可遭受感染，引起以生殖泌尿***，中枢神经***和肝脏疾患为主的各***感染，从轻微无症状感染直到严重缺陷或死亡。CMV在人群中感染非常广泛，中国成人感染率达95％以上，通常呈隐性感染，多数感染者无临床症状，但在一定条件下侵袭多个器官和***可产生严重疾病。HCMV感染的实验室诊断依赖于：①检测感染组织中HCMV细胞病理学、抗原或DNA；②检测体液中病毒DNA或抗原；③血清学转换验证；④分离来自组织或分泌物中的病毒。
对于EB病毒、HCMV的样品检测在临床检测以及实验研究中十分重要。现有的技术中对于病毒感染或者病毒蛋白的检测多采用特异性的抗体进行识别，制备比较复杂，步骤比较繁琐，成本较高，在大规模推广中有一定的缺陷。核酸适配体是一段单链核酸(一般大小在20～60个碱基左右)，能通过折叠形成特定的三维结构并与相对应的靶分子进行高亲和力、高特异性的结合。核酸适配体可以通过模拟自然进化过程的人工筛选技术-指数富集配体***进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)筛选得到，是一种具有识别功能的新型核酸分子。利用SELEX技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性的与靶物质高度亲和的核酸适配体，该技术已经成功的运用于许多靶物质的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。该技术具有库容量大、适应范围广泛、分辨率高、亲和力高，筛选过程相对简便、快速、经济，实用性高等特点。适配体对应靶标物质的高特异性和高亲和性的特点与抗体的功能类似，但是适配子的靶标范围更加的广泛，可以很好地运用于医学检测、诊断和治疗等多个方面。
核酸适配体具有特异性和高亲和力的原因是单链核酸在遇到靶标分子时可以形成例如口袋、发卡、G-四聚体等独特的三维结构，这些结构在结合靶标分子时的原理与抗体特异性识别相应抗原决定簇的原理类似，例如通过氢键、疏水结构、离子键等与靶标分子特异性的结合。基于适配体具有较高特异性地识别病原微生物或者病变细胞的生物学特性，核酸适配体能被广泛的应用于检测技术以及生物传感器的构建，能够实现对于病原体或者疾病的精准诊断。
目前市面上针对EB病毒、HCMV的抗原检测试剂盒都是单通道检测，也就是一次反应只能检测一种抗原，无法做到同一个反应中对两种或两种以上病毒抗原的检测。而且市售抗原检测试剂盒用的是抗体检测，抗体作为一种蛋白成分，具有不易表达合成、易降解、存在非特异性免疫原性等缺点。婴幼儿腹泻仅是一种症状和表现形式，其病原体有时是单一的，但也有很大比例是混合感染，快速诊断显得尤为重要。目前市面上还没有此类检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时快速检测EB病毒、HCMV的试剂盒，使用该试剂盒可同时检测样本中是否存在EB病毒、HCMV，灵敏度高，双通道同时快速检测。
本发明的再一个目的是提供制备试剂盒的方法
本发明的第三个目的是提供试剂盒在检测EB病毒、HCMV样本中的应用。
本发明公开了一种快速检测EB病毒/HCMV的试剂盒，包括以下组分：A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液，C)封闭液，D)漂洗液，E)样本前处理液，和F)带有荧光基团标记的核酸适配体，其特征是，核酸适配体含有EB病毒的核酸适配体和HCMV的核酸适配体，两种适配体的荧光基团相异。
本发明还公开了核酸适配体的核苷酸序列，本发明中EB病毒的核酸适配体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，HCMV的核酸适配体具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明公开的检测EB病毒/HCMV的试剂盒中的组分A)固定样本溶液的蛋白包被板可采用普通的ELISA板包初上阳性或待检测样品，直接使用市面上销售的具有蛋白吸附能力的ELISA酶标板。
本发明继续公开了试剂盒的组成，其中B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mMNa2CO3,pH 9.3-pH 9.9组成的，其中C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mMNa2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.1-pH 7.7组成的，其中D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.7组成的，其中E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2组成的。
在一个优先方案中，本发明还公开了A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.6组成的，C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.4组成的，D)漂洗液是由136mMNaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.4组成的，E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH8.0组成的。
本发明公开的核酸适配体序列上接有功能基团，功能基团为各种生物素标记物、发光标记物和酶标标记物，发光标记物选自FAM、VIC荧光基团中的一种，两种适配体的荧光基团相异。
本发明还公开了制备检测EB病毒/HCMV的试剂盒方法，EB病毒的核酸适配体以EB病毒靶蛋白抗原表位具有如SEQ ID No.3所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；HCMV的核酸适配体以HCMV靶蛋白抗原表位具有如SEQ ID No.4所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；再联接上的荧光基团，但要求两个核酸适配体连接的荧光基团相异，以便观察和识别。
本发明还公开了检测的试剂盒在同时检测EB病毒/HCMV中的应用
为了实现本发明中，申请人通过下列方式制备检测EB病毒/HCMV的试剂盒。
1)确定待测病毒的靶蛋白抗原表位
通过文献查阅与生物信息学分析，本发明人确定了EB病毒靶蛋白抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示以及HCMV靶蛋白抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
2)筛选特异性结合的核酸适配体序列
体外合成一个含有45个随机序列的单链DNA文库；以EB病毒、HCMV靶蛋白特定区域为筛选条件，采用SELEX技术筛选出具有高特异性、高亲和力的DNA适配体序列，EB病毒的核酸适配体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，HCMV的核酸适配体具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3)合成带有荧光基团标记的核酸适配体
直接在常规生物技术服务公司合成筛选得到的核酸适配体序列，合成时以共价键的形式在核酸适配体5’端连上荧光基团。检测EB病毒的核酸适配体具有如SEQ ID No.1所示序列，所带荧光基团为FAM；检测HCMV的核酸适配体具有如SEQ ID No.2所示序列，所带荧光基团为VIC。
4)制备试剂盒
试剂盒包括以下组分：A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液，C)封闭液，D)漂洗液，E)样本前处理液，和F)带有荧光基团标记的核酸适配体，核酸适配体含有EB病毒的核酸适配体和HCMV的核酸适配体，两种适配体的荧光基团相异。
试剂盒中试剂组分配方如下：B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH9.3-pH 9.9组成的，C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.1-pH 7.7组成的，D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.7组成的，E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2组成的，F)核酸适配体由公司合成粉剂，溶于TE缓冲液中，工作浓度为200nM。
本发明通过SELEX技术筛选到的针对EB病毒、HCMV的核酸适配体对相应的靶病毒具有较高的特异性和亲和力，并且具有无免疫原性、分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒等优点。利用本发明筛选到的核酸适配体进行的检测方法对相应的病毒进行检测时具有操作简单、反应迅速、准确性高和灵敏度高的特点，利用该核酸适配体构建分子探针或者检测试剂盒，并结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等检测装置，就可以实现对于两种病毒的精确检测。同时该试剂盒有较宽的检测范围，便于临床实用。本发明的意义在于：试剂盒灵敏度较高、特异性好、测量范围宽、操作简单、可以同时检测两种病毒、适合大规模推广，有着良好的市场前景。
本发明的优点是
1.在EB病毒、HCMV感染病人唾液样本和健康人唾液样本的检测中，EB病毒感染病人的阳性检出率，即灵敏度为96.5％；HCMV感染病人的阳性检出率，即灵敏度为96.2％；健康人群检测的阳性检出率为0％。
2.双通道同时检测两种核酸适配体标记上两种不同发射波段的荧光基团，能在同一个反应体系中同时完成两种病原体检测，相对于市面上普通的免疫检测试剂盒(如胶体金试剂盒)来说，缩短了反应时间，节省了反应试剂与待测样本用量。
3.独特的核酸适配体序列本发明所用核酸适配体序列为通过SELEX技术筛选所得，具有完全的独创性。
本试剂盒采用核酸适配体作为检测物，能有效克服以上问题，它具有分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒、无免疫原性等优点。通过在不同核酸适配体上标记不同荧光基团，能做到在同意反应中对两种及两种以上并病原的同时检测。
附图说明
图1是本发明核酸适配体中EB病毒-aptamer核苷酸序列的二级结构图；
图2是本发明核酸适配体中HCMV-aptamer核苷酸序列的二级结构图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例1确定EB病毒、HCMV的靶蛋白抗原表位
根据文献查阅与生物信息学分析，确定待测适合作为核酸适配体检测靶点的病毒蛋白以及病毒蛋白上的具体抗原表位区域。
A)选择EB病毒gp125蛋白400-857区域作为适配体筛选靶蛋白，具有如SEQ IDNo.3所示序列：
TTPTSSPPSSPSPPAPSAARGSTPAAVLRRRRRDAGNATTPVPPTAPGKSLGTLNNPATVQIQFAYDSLRRQINRMLGDLARAWCLEQKRQNMVLRELTKINPTTVMSSIYGKAVAAKRLGDVISVSQCVPVNQATVTLRKSMRVPGSETMCYSRPLVSFSFINDTKTYEGQLGTDNEIFLTKKMTEVCQATSQYYFQSGNEIHVYNDYHHFKTIELDGIATLQTFISLNTSLIENIDFASLELYSRDEQRASNVFDLEGIFREYNFQAQNIAGLRKDLDNAVSNGRNQFVDGLGELMDSLGSVGQSITNLVSTVGGLFSSLVSGFISFFKNPFGGMLILVLVAGVVILVISLTRRTRQMSQQPVQMLYPGIDELAQQHASGEGPGINPISKTELQAIMLALHEQNQEQKRAAQRAAGPSVASRALQAARDRFPGLRRRRYHDPETAAALLGEAETEF(SEQ ID No.3)
B)选择HCMV PP65蛋白全长作为适配体筛选靶蛋白，具有如SEQ ID No.4所示序列：
MESRGRRCPEMISVLGPISGHVLKAVFSRGDTPVLPHETRLLQTGIHVRVSQPSLILVSQYTPDSTPCHRGDNQLQVQHTYFTGSEVENVSVNVHNPTGRSICPSQEPMSIYVYALPLKMLNIPSINVHHYPSAAERKHRHLPVADAVIHASGKQMWQARLTVSGLAWTRQQNQWKEPDVYYTSAFVFPTKDVALRHVVCAHELVCSMENTRATKMQVIGDQYVKVYLESFCEDVPSGKLFMHVTLGSDVEEDLTMTRNPQPFMRPHERNGFTVLCPKNMIIKPGKISHIMLDVAFTSHEHFGLLCPKSIPGLSISGNLLMNGQQIFLEVQAIRETVELRQYDPVAALFFFDIDLLLQRGPQYSEHPTFTSQYRIQGKLEYRHTWDRHDEGAAQGDDDVWTSGSDSDEELVTTERKTPRVTGGGAMASASTSAGRKRKSASSATACTAGVMTRGRLKAESTVAPEEDTDEDSDNEIHNPAVFTWPPWQAGILARNLVPMVATVQGQNLKYQEFFWDANDIYRIFAELEGVWQPAAQPKRRRHRQDALPGPCIASTPKKHRG(SEQ ID No.4)
C)根据已确定的氨基酸序列，直接在公司进行核苷酸序列的合成以及原核密码子优化，将合成的基因片段***原核表达载体pET32a上。诱导表达出相应用于适配体筛选的两种病毒的靶蛋白。
实施例2构建适配体文库与引物设计
A)通过常规生物技术服务公司的基因合成服务，体外合成含有45个随机序列的单链DNA文库，其核苷酸序列如下
GATGACATTGCACAAGTCAGG-(N45)-GAGTGAATCCTGCTGTTCGA
B)针对核酸适配体5’端固定序列，设计合成的上游引物P1，具有如SEQ ID No.5所示序列：
5’-GATGACATTGCACAAGTCAGG-3’(SEQ ID No.5)
C)针对核酸适配体3’端固定序列，设计合成的下游引物P2，具有如SEQ ID No.6所示序列，同时在引物5’端连接有生物素基团：
5’-biotin-TCGAACAGCAGGATTCACTC-3’(SEQ ID No.6)
实施例3利用SELEX筛选技术，从文库中筛选得到能有效结合病毒靶蛋白的核酸适配体序列
A)将10nmol的初始单链DNA随机文库溶解在500μl的PBS溶液中，用92℃的恒温水浴锅水浴5min，之后迅速的***冰中冰浴10min，之后将经过处理的初始单链DNA随机文库与相应病毒靶蛋白在冰上孵育1h，再加入Ni-NTA Magnetic Agarose Beads，继续孵育1h。孵育完成后，使用磁性分离器吸附，去除上清，用2ml的PBS洗涤Beads。最后用10ml预冷的PBS重悬Beads，使之充分吹打混匀，之后92℃恒温水浴10min，13000g离心，收集上清，即为第一轮筛选后特异性识别病毒靶蛋白的单链DNA文库。
B)对筛选后的单链DNA文库进行PCR扩增，以制备次级文库。PCR反应的体系如下：Premix Tap Mix 25μl，筛选后的单链DNA文库8μl，上游引物2.5μl，下游引物2.5μl，ddH2O12μl，总体积为50μl。按照如下的程序进行PCR循环扩增：95℃变性3min，经过35个循环扩增程序为95℃30s，55℃30s，72℃30s，最终的延伸为72℃10min，最后维持在16℃终止反应。对经过PCR扩增后的文库进行琼脂糖凝胶回收以得到纯净的文库片段。
C)对扩增得到的次级文库进行进一步的制备。将扩增后的双链DNA文库与100μl链酶亲和素标记的磁珠常温孵育20min，利用双链DNA文库上的生物素与链酶亲和素的亲和作用将双链DNA文库结合到磁珠的表面，之后使用磁性分离器吸附，去除上清，用2ml的PBS洗涤磁珠。加入终浓度为200mM的NaOH溶液常温反应10min使得双链DNA文库变性变成单链，其中带有生物素标记的一条链会结合在磁珠上，不带生物素标记的那一条链会脱离到上清液中。收集上清液，用脱盐柱除去NaOH，最后加入500μl的PBS，收集到的溶液即为下一轮筛选所需要用到的单链DNA文库。
D)重复上述的阳性筛选过程、PCR扩增以及次级单链DNA文库的制备过程15次，最后筛选得到的单链DNA文库对于病毒靶蛋白的识别能力最强。将所得到的单链DNA文库进行克隆测序后，最终得到了本发明中所筛选出来的可用于检测EB病毒、HCMV感染的核酸适配体，其DNA序列分别为：
EB病毒-aptamer
GATGACATTGCACAAGTCAGGACACACACTTACCTCATTAATGGTTTGTGTAATTCTTCGCGATAAGAGTGAATCCTGCTGTTCGA
HCMV-aptamer
GATGACATTGCACAAGTCAGGCACTGTATCCAGTGACTCTAGTATTACAATTGCGAGGTGGCCTCCGAGTGAATCCTGCTGTTCGA
E)为了能在一个反应体系内同时进行两种反应产物的检测，给每种适配体5’端标记上不同的荧光基团(共价键结合的形式，直接在常规生物技术服务公司合成)，最终的试剂盒里的适配体信息如下：
EB病毒-aptamer，具有如SEQ ID No.1所示序列：
5’-FAM-
GATGACATTGCACAAGTCAGGACACACACTTACCTCATTAATGGTTTGTGTAATTCTTCGCGATAAGAGTGAATCCTGCTGTTCGA-3’(SEQ ID No.1)
HCMV-aptamer，具有如SEQ ID No.2所示序列：
5’-VIC-
GATGACATTGCACAAGTCAGGCACTGTATCCAGTGACTCTAGTATTACAATTGCGAGGTGGCCTCCGAGTGAATCCTGCTGTTCGA-3’(SEQ ID No.2)
实施例4适配体的验证
A)通过结构预测软件RNA Structure Program来分析预测筛选出来的核酸适配体的二级结构，结果显示所有的核酸适配体都可以形成特殊的茎环结构和发卡结构。EB病毒-aptamer可形成如图1所示的二级结构，HCMV-aptamer可形成如图2所示的二级结构。
B)使用ForteBio Octet RED96相互作用分析仪检测核酸适配体与靶蛋白的结合力，所得结果如下：
适配体 与靶蛋白的解离常数Kd(nM)
EB病毒-aptamer 8.7
HCMV-aptamer 8.4
PBS对照 无结合
C)分别采用人血白蛋白、免疫血清球蛋白、唾液淀粉酶蛋白与2种核酸适配体进行特异性检测，经过结合实验发现，2种适配体都不与这些蛋白结合。用2种病毒的靶蛋白对2种适配体进行交叉反应检测，实验结果显示，2种适配体只与对应的靶蛋白结合。
D)2种适配体各取0.2μg，分别放置于常温血清、水溶液中。4周后用RT-PCR检测，发现放置的核酸适配体结构稳定，没有发生降解。
E)分别用EB病毒、HCMV感染敏感宿主细胞，同时设置没有感染的阴性对照组。感染36h后用胰酶消化细胞，离心得到细胞沉淀并去除上清液，再用PBS重悬。对细胞进行固定与透化处理，再将对应EB病毒、HCMV的带有荧光基团标记的核酸适配体分别与感染病毒的细胞悬液以及未感染对照组细胞悬液混合处理1h，通过流式细胞仪分析计算。不同病毒的核酸适配体标记了不同的荧光基团，可以在流式细胞仪中明显区分，结果显示感染了EB病毒、HCMV的细胞样品所对应的核酸适配体标记荧光数值显著升高，说明筛选得到的适配体可用作病毒感染的检测。
实施例5，试剂盒的配方
本试剂盒包含以下配方：
1)用于固定样本溶液的96孔蛋白包被板
2)蛋白包被液
3)封闭液
4)漂洗液
5)样本前处理液
6)带有荧光基团标记的核酸适配体
实施例6，试剂盒的制备
本试剂盒所有配方的制备信息如下：
1)用于固定样本溶液的96孔蛋白包被板
直接使用市面上销售的具有蛋白吸附能力的ELISA酶标板
2)蛋白包被液
属于常规分子检测试剂，配方为35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.3-pH 9.9，使用双蒸水配置。
3)封闭液
属于常规分子检测试剂，配方为136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mMNa2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.1-pH 7.7，使用双蒸水配置。
4)漂洗液
属于常规分子检测试剂，配方为136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mMNa2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.7，使用双蒸水配置。
5)样本前处理液
属于常规分子检测试剂，配方为150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2，使用双蒸水配置。
6)带有荧光基团标记的核酸适配体
通过常规生物技术服务公司的基因合成服务，直接合成，用TE缓冲液溶解并配置到工作浓度(200nM)。
实施例7，试剂盒的应用
取20份已确认EB病毒阳性的样本、20份已确认HCMV阳性的样本与20份已确认无EB病毒、无HCMV的对照样本。由于目前市场上没有同时检测EB病毒与HCMV的抗原检测试剂盒，所以取市售某品牌EB病毒抗原检测试剂盒与市售某品牌HCMV抗原检测试剂盒与我们的核酸适配体检测试剂盒同时做平行实验。实验结果如下：
Figure BDA0002836925030000101
序列表
<110> 武汉大学
<120> 检测EB病毒/HCMV的试剂盒及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatgacattg cacaagtcag gacacacact tacctcatta atggtttgtg taattcttcg 60
cgataagagt gaatcctgct gttcga 86
<210> 2
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatgacattg cacaagtcag gcactgtatc cagtgactct agtattacaa ttgcgaggtg 60
gcctccgagt gaatcctgct gttcga 86
<210> 3
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Thr Pro Thr Ser Ser Pro Pro Ser Ser Pro Ser Pro Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ala Arg Gly Ser Thr Pro Ala Ala Val Leu Arg Arg Arg Arg
20 25 30
Arg Asp Ala Gly Asn Ala Thr Thr Pro Val Pro Pro Thr Ala Pro Gly
35 40 45
Lys Ser Leu Gly Thr Leu Asn Asn Pro Ala Thr Val Gln Ile Gln Phe
50 55 60
Ala Tyr Asp Ser Leu Arg Arg Gln Ile Asn Arg Met Leu Gly Asp Leu
65 70 75 80
Ala Arg Ala Trp Cys Leu Glu Gln Lys Arg Gln Asn Met Val Leu Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Lys Ile Asn Pro Thr Thr Val Met Ser Ser Ile Tyr Gly
100 105 110
Lys Ala Val Ala Ala Lys Arg Leu Gly Asp Val Ile Ser Val Ser Gln
115 120 125
Cys Val Pro Val Asn Gln Ala Thr Val Thr Leu Arg Lys Ser Met Arg
130 135 140
Val Pro Gly Ser Glu Thr Met Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe
145 150 155 160
Ser Phe Ile Asn Asp Thr Lys Thr Tyr Glu Gly Gln Leu Gly Thr Asp
165 170 175
Asn Glu Ile Phe Leu Thr Lys Lys Met Thr Glu Val Cys Gln Ala Thr
180 185 190
Ser Gln Tyr Tyr Phe Gln Ser Gly Asn Glu Ile His Val Tyr Asn Asp
195 200 205
Tyr His His Phe Lys Thr Ile Glu Leu Asp Gly Ile Ala Thr Leu Gln
210 215 220
Thr Phe Ile Ser Leu Asn Thr Ser Leu Ile Glu Asn Ile Asp Phe Ala
225 230 235 240
Ser Leu Glu Leu Tyr Ser Arg Asp Glu Gln Arg Ala Ser Asn Val Phe
245 250 255
Asp Leu Glu Gly Ile Phe Arg Glu Tyr Asn Phe Gln Ala Gln Asn Ile
260 265 270
Ala Gly Leu Arg Lys Asp Leu Asp Asn Ala Val Ser Asn Gly Arg Asn
275 280 285
Gln Phe Val Asp Gly Leu Gly Glu Leu Met Asp Ser Leu Gly Ser Val
290 295 300
Gly Gln Ser Ile Thr Asn Leu Val Ser Thr Val Gly Gly Leu Phe Ser
305 310 315 320
Ser Leu Val Ser Gly Phe Ile Ser Phe Phe Lys Asn Pro Phe Gly Gly
325 330 335
Met Leu Ile Leu Val Leu Val Ala Gly Val Val Ile Leu Val Ile Ser
340 345 350
Leu Thr Arg Arg Thr Arg Gln Met Ser Gln Gln Pro Val Gln Met Leu
355 360 365
Tyr Pro Gly Ile Asp Glu Leu Ala Gln Gln His Ala Ser Gly Glu Gly
370 375 380
Pro Gly Ile Asn Pro Ile Ser Lys Thr Glu Leu Gln Ala Ile Met Leu
385 390 395 400
Ala Leu His Glu Gln Asn Gln Glu Gln Lys Arg Ala Ala Gln Arg Ala
405 410 415
Ala Gly Pro Ser Val Ala Ser Arg Ala Leu Gln Ala Ala Arg Asp Arg
420 425 430
Phe Pro Gly Leu Arg Arg Arg Arg Tyr His Asp Pro Glu Thr Ala Ala
435 440 445
Ala Leu Leu Gly Glu Ala Glu Thr Glu Phe
450 455
<210> 4
<211> 561
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Glu Ser Arg Gly Arg Arg Cys Pro Glu Met Ile Ser Val Leu Gly
1 5 10 15
Pro Ile Ser Gly His Val Leu Lys Ala Val Phe Ser Arg Gly Asp Thr
20 25 30
Pro Val Leu Pro His Glu Thr Arg Leu Leu Gln Thr Gly Ile His Val
35 40 45
Arg Val Ser Gln Pro Ser Leu Ile Leu Val Ser Gln Tyr Thr Pro Asp
50 55 60
Ser Thr Pro Cys His Arg Gly Asp Asn Gln Leu Gln Val Gln His Thr
65 70 75 80
Tyr Phe Thr Gly Ser Glu Val Glu Asn Val Ser Val Asn Val His Asn
85 90 95
Pro Thr Gly Arg Ser Ile Cys Pro Ser Gln Glu Pro Met Ser Ile Tyr
100 105 110
Val Tyr Ala Leu Pro Leu Lys Met Leu Asn Ile Pro Ser Ile Asn Val
115 120 125
His His Tyr Pro Ser Ala Ala Glu Arg Lys His Arg His Leu Pro Val
130 135 140
Ala Asp Ala Val Ile His Ala Ser Gly Lys Gln Met Trp Gln Ala Arg
145 150 155 160
Leu Thr Val Ser Gly Leu Ala Trp Thr Arg Gln Gln Asn Gln Trp Lys
165 170 175
Glu Pro Asp Val Tyr Tyr Thr Ser Ala Phe Val Phe Pro Thr Lys Asp
180 185 190
Val Ala Leu Arg His Val Val Cys Ala His Glu Leu Val Cys Ser Met
195 200 205
Glu Asn Thr Arg Ala Thr Lys Met Gln Val Ile Gly Asp Gln Tyr Val
210 215 220
Lys Val Tyr Leu Glu Ser Phe Cys Glu Asp Val Pro Ser Gly Lys Leu
225 230 235 240
Phe Met His Val Thr Leu Gly Ser Asp Val Glu Glu Asp Leu Thr Met
245 250 255
Thr Arg Asn Pro Gln Pro Phe Met Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe
260 265 270
Thr Val Leu Cys Pro Lys Asn Met Ile Ile Lys Pro Gly Lys Ile Ser
275 280 285
His Ile Met Leu Asp Val Ala Phe Thr Ser His Glu His Phe Gly Leu
290 295 300
Leu Cys Pro Lys Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ile Ser Gly Asn Leu Leu
305 310 315 320
Met Asn Gly Gln Gln Ile Phe Leu Glu Val Gln Ala Ile Arg Glu Thr
325 330 335
Val Glu Leu Arg Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe Phe Phe Asp
340 345 350
Ile Asp Leu Leu Leu Gln Arg Gly Pro Gln Tyr Ser Glu His Pro Thr
355 360 365
Phe Thr Ser Gln Tyr Arg Ile Gln Gly Lys Leu Glu Tyr Arg His Thr
370 375 380
Trp Asp Arg His Asp Glu Gly Ala Ala Gln Gly Asp Asp Asp Val Trp
385 390 395 400
Thr Ser Gly Ser Asp Ser Asp Glu Glu Leu Val Thr Thr Glu Arg Lys
405 410 415
Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met Ala Ser Ala Ser Thr Ser
420 425 430
Ala Gly Arg Lys Arg Lys Ser Ala Ser Ser Ala Thr Ala Cys Thr Ala
435 440 445
Gly Val Met Thr Arg Gly Arg Leu Lys Ala Glu Ser Thr Val Ala Pro
450 455 460
Glu Glu Asp Thr Asp Glu Asp Ser Asp Asn Glu Ile His Asn Pro Ala
465 470 475 480
Val Phe Thr Trp Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu
485 490 495
Val Pro Met Val Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Glu
500 505 510
Phe Phe Trp Asp Ala Asn Asp Ile Tyr Arg Ile Phe Ala Glu Leu Glu
515 520 525
Gly Val Trp Gln Pro Ala Ala Gln Pro Lys Arg Arg Arg His Arg Gln
530 535 540
Asp Ala Leu Pro Gly Pro Cys Ile Ala Ser Thr Pro Lys Lys His Arg
545 550 555 560
Gly
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatgacattg cacaagtcag g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgaacagca ggattcactc 20

Claims (7)

1.一种快速检测EB病毒/HCMV的试剂盒，包括以下组分：A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液，C)封闭液，D)漂洗液，E)样本前处理液，和F)带有荧光基团标记的核酸适配体，其特征是，核酸适配体含有EB病毒的核酸适配体和HCMV的核酸适配体，两种适配体的荧光基团相异。
2.根据权利要求1所述的检测EB病毒/HCMV的试剂盒，其特征在于EB病毒的核酸适配体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，HCMV的核酸适配体具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的检测EB病毒/HCMV的试剂盒，其特征在于B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.3-pH 9.9组成的，C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.1-pH 7.7组成的，D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.7组成的，E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2组成的。
4.根据权利要求3所述的检测EB病毒/HCMV的试剂盒，其特征在于B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.6组成的，C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mMKH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.4组成的，D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.4组成的，E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH8.0组成的。
5.根据权利要求1所述的检测EB病毒/HCMV的试剂盒，其特征在于核酸适配体序列上接有功能基团，功能基团为各种生物素标记物、发光标记物和酶标标记物，发光标记物选自FAM、VIC荧光基团中的一种，两种适配体的荧光基团相异。功能基团通过共价键的方式连接到核酸适配体的5’端。
6.一种制备权利要求1中检测EB病毒/HCMV的试剂盒，其特征是，EB病毒的核酸适配体以EB病毒靶蛋白抗原表位具有如SEQ ID No.3所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；HCMV的核酸适配体以HCMV靶蛋白抗原表位具有如SEQ ID No.4所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；再将荧光基团以共价键的形式连接到核酸适配体的5’端。
7.权利要求1中所述检测的试剂盒在同时检测EB病毒/HCMV中的应用。
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