CN115261395B - 一种新型冠状病毒n蛋白高效可溶性表达的方法 - Google Patents

一种新型冠状病毒n蛋白高效可溶性表达的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒N蛋白高效可溶性表达的方法。本发明将原始的SARS‑COV‑2N蛋白基因序列进行优化，并手动调整部分碱基，获得如SEQ ID NO.1所示的基因序列。采用本发明提供的优化后的SARS‑COV‑2N蛋白序列在大肠杆菌中诱导表达时，仅产生极少量的包涵体蛋白。因此，本发明提供的新型冠状病毒N蛋白高效可溶性表达的方法，可以实现低成本、高表达量的效果。

Description

一种新型冠状病毒N蛋白高效可溶性表达的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒N蛋白 高效可溶性表达的方法。
背景技术
基于血清学的检测技术具有成本低、速度快、灵敏度高及易操作 等特点，适合新型冠状病毒感染人群及疫苗接种人群的快速、大规模 检测，目前利用特异蛋白建立快速检测血清技术已经成为一种重要确 诊依据。
SARS-COV-2N蛋白是冠状病毒中一种具有高度免疫原性的磷 蛋白，与病毒基因组复制和调节细胞信号通路有关(Lancet,2020 (10224):565-74)。SARS-COV-2N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白 中所占比例最大，感染早期机体就能产生抗SARS-COV-2N蛋白的高水平抗体，因此可以利用SARS-COV-2N蛋白建立快速检测新型冠状病毒的血清抗体方法。而提高该蛋白的可溶性表达水平对新型冠状病 毒检测试剂盒制备和大幅降低成本具有重要意义。
目前在SARS-COV-2N蛋白表达中，比较常用的是大肠杆菌表达 ***，其目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强，操作简 单便捷，易于放大，适合低成本大量表达目的蛋白。大肠杆菌的最适 生长温度在37～39℃之间，但此温度下极易生成包涵体蛋白。
发明内容
本发明在研究中发现，基于SARS-COV-2N蛋白原始序列获得高 水平可溶性SARS-COV-2N蛋白表达需要在适当条件下诱导，对实验 设备条件要求高且实验周期长。
本发明的目的是提供一种优化的SARS-COV-2N蛋白基因序列， 并建立基于该序列利用大肠杆菌获得SARS-COV-2N蛋白的方法，可 以实现SARS-COV-2N蛋白在常规条件下的可溶性高效表达，解决生产成本高、生产周期长的问题，为免疫学快速诊断、制备单抗、开展解析蛋白结构研究等提供基础。
第一方面，本发明请求保护一种新型冠状病毒N蛋白基因序列， 所述新型冠状病毒N蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示。
使用在线密码子优化工具(ExpOptimizer)进行密码子优化，原 始序列为NCBI上下载的编码SARS-CoV-2N蛋白的全长序列。本发明通过对***打分靠前的几个备选序列进行改造，手动修改部分碱基， 获得了如SEQ ID NO.1所示的新型冠状病毒N蛋白基因序列，SEQ ID NO.1所示的新型冠状病毒N蛋白基因序列的可溶性蛋白表达水平可 达菌体总可溶蛋白的80％以上，明显高于同样条件下原始菌株的表达 量。
第二方面，本发明请求保护含有SEQ ID NO.1所示新型冠状病毒 N蛋白基因序列的表达载体。
第三方面，本发明请求保护含有SEQ ID NO.1所示新型冠状病毒 N蛋白基因序列的重组菌。
第四方面，本发明提供一种新型冠状病毒N蛋白表达的方法， 采用如SEQ ID NO.1所示的新型冠状病毒N蛋白基因序列构建表达 载体，并将所述表达载体转化至大肠杆菌中。
在本发明提供的方法中，成功转化表达载体的大肠杆菌菌液 OD600达到0.6-0.8时，进行新型冠状病毒N蛋白诱导表达。
在本发明提供的方法中，诱导表达的条件是向成功转化表达载体 的大肠杆菌中，加入终浓度为0.4-0.5mM的IPTG；37-39℃诱导3-4h。
具体地，作为本发明的一个具体实施方式，本发明提供的新型冠 状病毒N蛋白表达的方法，包括：
(1)将如SEQ ID NO.1所示的基因序列，连入表达载体pET28a， 转化至大肠杆菌BL21(DE3)中；
(2)取表达菌单克隆接种至含有100μg/ml Kan+抗生素的LB 液体培养基中，培养过夜；
(3)将过夜菌液加到新鲜LB液体培养基中，至OD600达到0.6-0.8， 加入IPTG至终浓度为0.4-0.5mM，37-39℃诱导3-4h。
本发明还提供了一种新型冠状病毒N蛋白，所述新型冠状病毒N 蛋白采用上述方法诱导表达得到。
根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护上述新型冠状病 毒N蛋白基因序列或上述的方法，在提高可溶性新型冠状病毒N蛋 白表达量中的应用。
以及上述新型冠状病毒N蛋白基因序列或上述的新型冠状病毒 N蛋白，在提高新型冠状病毒血清检测准确度中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明获得一种优化后的新型冠状病毒N蛋白基因序列，采用优 化后的新型冠状病毒N蛋白基因序列可以实现，在常规条件下，高效 表达可溶性新型冠状病毒(SARS-COV-2)N蛋白。
具体地，本发明利用优化后的SARS-COV-2N蛋白基因序列建立 的蛋白表达方法，明显提高常规条件下可溶SARS-COV-2N蛋白的表 达。
本发明所述方法获得的可溶性蛋白表达水平可达菌体总可溶蛋 白的80％以上，明显高于同样条件下原始菌株的表达量。
本发明提供的方法，克服了现有技术中，需要在最适条件下对包 涵体进行变性复性来使蛋白具有活性；本发明提供的方法操作简单、 实验周期短并且能够降低成本，满足大规模生产需求。
附图说明
图1为本发明SARS-COV-2N蛋白原始序列与优化序列比对。
图2为本发明SARS-COV-2N蛋白优化前与优化后37℃4h条件 下诱导表达结果图，其中(a)为优化前表达结果，1为诱导表达沉淀， 2为诱导表达上清；(b)为优化后表达结果，1为诱导表达沉淀，2为 诱导表达上清。
图3为本发明SARS-COV-2N蛋白鉴定结果，其中(a)为蛋白纯 化后结果图；(b)为His标签抗体的WB结果；(c)为N蛋白鼠单抗的 WB结果。
图4为本发明两个不同优化后SARS-COV-2N蛋白37℃4h条件 下诱导表达结果图，其中1为未诱导表达蛋白对照；2为优化后序列2 的可溶表达蛋白；3为优化后序列1的可溶表达蛋白。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1SARS-COV-2N蛋白基因序列优化
使用在线密码子优化工具(ExpOptimizer)进行密码子优化。
原始序列为NCBI上下载的编码SARS-COV-2N蛋白的全长序列， 打开在线密码子优化工具(ExpOptimizer)https://www.novopro.cn/tools/codon-optimization.html。选择序列类型为 DNA/RNA，输入上述SARS-COV-2N蛋白基因序列，选择表达宿主 E.coli(大肠杆菌)，选择限制性内切酶位点为BamHI和Xhol，后点击 提交。
在使用密码子优化工具进行优化后，所获得的序列信息有多套。 本发明针对***打分靠前的几个备选序列进行改造，手动修改部分碱 基后。最终得到的基因序列如SEQ IDNO.1所示：
ATGTCTGATAACGGTCCGCAGAACCAGCGTAATGCTCCGCG CATTACCTTTGGTGGTCCTAGCGATTCCACCGGTAGCAACCAGA ACGGCGAACGTTCCGGTGCACGCTCTAAACAGCGCCGTCCGCAAGGTCTGCCGAACAACACGGCTTCTTGGTTCACCGCGCTGACT CAGCACGGTAAAGAGGACCTGAAATTTCCGCGTGGCCAGGGCG TGCCAATCAATACTAACTCCTCTCCGGATGACCAGATCGGCTACTATCGTCGCGCCACTCGTCGTATTCGTGGTGGCGACGGCAAAATG AAAGATCTGTCCCCGCGTTGGTACTTTTATTACCTGGGTACTGGTCCGGAAGCAGGTCTGCCGTATGGTGCAAACAAAGATGGCATCA TTTGGGTCGCGACTGAAGGCGCTCTGAACACCCCAAAAGATCACATCGGCACTCGTAACCCGGCTAACAACGCAGCAATTGTTCTGC AGCTGCCACAGGGTACCACTCTGCCGAAGGGTTTTTACGCTGA AGGTTCTCGTGGCGGTTCCCAGGCAAGCTCCCGTTCTTCTTCCCGTTCTCGCAACAGCTCTCGCAACTCTACCCCGGGTTCTTCTCGC GGTACTTCCCCGGCTCGTATGGCTGGTAACGGTGGTGATGCGGCTCTGGCTCTGCTGCTGCTGGATCGTCTGAACCAACTGGAATCTA AAATGTCTGGTAAAGGCCAGCAGCAGCAGGGTCAGACTGTAAC CAAAAAAAGCGCTGCTGAAGCGTCCAAGAAACCGCGTCAGAAACGCACTGCCACTAAAGCATACAACGTTACCCAAGCGTTTGGTC GTCGTGGTCCAGAACAGACCCAGGGCAACTTCGGTGACCAGGAACTGATTCGTCAAGGTACCGACTACAAACACTGGCCGCAAAT CGCGCAGTTCGCACCGTCCGCTTCCGCTTTCTTTGGCATGTCCCGTATTGGTATGGAAGTTACTCCGTCCGGCACTTGGCTGACCTATA CGGGTGCGATTAAACTGGACGACAAAGATCCTAACTTCAAAGACCAGGTTATTCTGCTGAACAAGCACATCGACGCTTATAAAACTT TCCCGCCGACCGAACCGAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAGCGGATGAAACTCAGGCTCTGCCGCAGCGTCAGAAAAAACAGCAGA CCGTTACTCTGCTGCCAGCCGCTGATCTGGACGATTTCTCTAAA CAGCTGCAGCAGTCTATGAGCTCCGCGGACTCCACCCAGGCA。
SEQ ID NO.1与原始序列进行比对，Identity＝75.32％，如图1所示。
SEQ ID NO.1的序列分析(密码子偏好参数分析)，使用CodonW
1.4.2软件进行密码子偏好参数分析(见表1)。
表1密码子偏好性参数分析结果
实施例2 SARS-COV-2N蛋白表达质粒构建及诱导表达
将实施例1得到的SARS-COV-2N蛋白基因序列，连接至pET28a 表达质粒上，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。
挑取阳性单克隆菌接种于2ml含有100μg/ml Kan+抗生素的LB液 体培养基中，在37℃，180rpm的摇床内培养过夜；过夜菌液按1:100 接种于200ml含有100μg/ml Kan+抗生素的新鲜LB培养基中，37℃， 180rpm培养到OD600为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃， 180rpm继续诱导4h。诱导表达后的200ml大肠杆菌菌液进行离心， 8000rpm,15min，收集菌体，PBS洗两次。将菌体悬于裂解缓冲液(20 mM Tris-HCl,pH 7.5)中，60W，超声6s，间歇12s，处理30min。 12000rpm离心30min收集上清，用0.2μm滤膜过滤。对表达上清进行SDS-PAGE实验，结果如图2所示，与原始序列相比，优化后表达的 可溶性SARS-COV-2N蛋白含量明显增加。
实施例3 SARS-COV-2N蛋白的Western Blot鉴定
在完成实施例2的SDS-PAGE蛋白电泳后，进行转膜。甲醇活化PVDF膜2-4分钟，海绵、滤纸和胶用转膜液浸泡。湿转电泳仪转膜条 件为：350mA，30min。用含0.1％Tween20的tris缓冲液(TBST)洗 膜3次，每次10min；加入封闭液(1×TBS+0.5％脱脂奶粉+0.05％的tween20)，常温封闭4小时后，用TBST洗膜3次，每次10min；分别加 入1:3000的鼠抗His一抗和鼠抗N蛋白一抗稀释液，4℃过夜。TBST洗 膜3次，每次10min，加入1:5000的二抗反应液(辣根过氧化酶标记羊 抗鼠二抗)，室温1h，TBST洗膜3次，每次10min。A液和B液1：1混 合，滴在PVDF膜上，拍照。结果如图3所示。图3的结果显示，本发 明优化后的SARS-COV-2N蛋白基因序列能够得到高特异性的 SARS-COV-2N蛋白。
对比例1可溶性SARS-COV-2N蛋白表达量对比
本对比例提供优化后的SARS-COV-2N蛋白基因序列和原始序列， 在可溶性SARS-COV-2N蛋白表达量上的对比，如图4所示。
本对比例中优化后的SARS-COV-2N蛋白基因序列包括，SEQ ID NO.1及SEQ IDNO.2，其中SEQ ID NO.2的优化方法与实施例1中提供 的优化方法相同，SEQ ID NO.2的碱基没有经过手动调整。
SEQ ID NO.2基因：
ATGTCAGATAATGGACCCCAAAACCAGAGGAACGCTCCTC GCATCACCTTCGGCGGTCCATCCGATAGCACCGGTAGCAACCAAAACGGTGAACGTTCCGGTGCACGTTCGAAACAGCGTCGCCCGC AGGGTCTGCCAAACAACACGGCGAGCTGGTTTACCGCGCTGACCCAACATGGCAAAGAAGATCTGAAATTTCCGCGTGGTCAGGGC GTACCGATTAATACCAATTCCTCTCCGGATGATCAAATCGGTTACTACCGCCGCGCAACACGTAGAATCCGTGGTGGCGACGGCAAGA TGAAAGACCTGAGCCCGCGCTGGTACTTCTACTACCTGGGCACT GGCCCTGAGGCAGGTTTGCCGTACGGAGCGAACAAAGACGGTATTATCTGGGTTGCTACTGAGGGGGCGTTGAACACGCCCAAAGA CCACATTGGTACCCGTAACCCGGCGAATAACGCTGCTATTGTTC TGCAACTGCCGCAGGGCACCACCCTGCCGAAAGGTTTTTATGCTGAAGGTTCGCGCGGTGGTAGCCAGGCATCTTCTCGTAGCTCAA GCCGTTCCCGTAACAGCAGCCGTAATTCTACGCCGGGTAGTTCC AGAGGTACCAGCCCGGCGCGTATGGCAGGCAACGGCGGCGATGCCGCGCTGGCATTACTGCTCCTGGATCGTCTGAATCAGTTGGAG AGCAAGATGAGCGGCAAAGGTCAACAGCAACAGGGTCAAACGGTGACCAAGAAGAGCGCTGCGGAAGCGTCCAAGAAGCCGCGT CAAAAGCGTACCGCCACCAAGGCGTATAACGTGACTCAAGCCT TCGGTCGTCGCGGCCCGGAGCAGACCCAGGGTAATTTTGGCGATCAAGAGCTGATCCGCCAGGGCACGGATTATAAACATTGGCCGC AGATCGCCCAGTTCGCTCCGTCTGCGAGCGCGTTCTTCGGCATGAGCAGGATCGGCATGGAAGTTACCCCGTCTGGTACGTGGCTTAC CTATACCGGCGCTATTAAGCTGGACGACAAGGACCCGAATTTTAAGGACCAGGTCATCCTGCTGAACAAGCACATTGATGCATATAAA ACGTTTCCGCCGACCGAGCCGAAGAAAGACAAAAAAAAAAAGGCGGACGAAACCCAGGCGCTGCCGCAACGTCAGAAAAAGCAG CAGACCGTGACCCTTTTGCCGGCGGCGGACCTCGACGACTTCAGCAAACAATTGCAGCAATCAATGTCTTCGGCGGATAGCACCCA AGCGTAA。
将SEQ ID NO.2所示的SARS-COV-2N蛋白基因序列进行表达载 体构建，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。表达质粒构建及诱导表达 的方法与实施例2相同。
对可溶性SARS-COV-2N蛋白表达量进行检测，采用SEQ ID NO.1所示SARS-COV-2N蛋白基因序列时，可溶性SARS-COV-2N蛋 白表达量为5mg/L。
采用SEQ ID NO.2所示SARS-COV-2N蛋白基因序列时，可溶性SARS-COV-2N蛋白表达量约为0.5mg/L。
采用SARS-COV-2N蛋白基因原始序列时，可溶性SARS-COV-2 N蛋白表达量约为0.5mg/L。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120> 一种新型冠状病毒N蛋白高效可溶性表达的方法
<130> KHP221110172.7
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1257
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtctgata acggtccgca gaaccagcgt aatgctccgc gcattacctt tggtggtcct 60
agcgattcca ccggtagcaa ccagaacggc gaacgttccg gtgcacgctc taaacagcgc 120
cgtccgcaag gtctgccgaa caacacggct tcttggttca ccgcgctgac tcagcacggt 180
aaagaggacc tgaaatttcc gcgtggccag ggcgtgccaa tcaatactaa ctcctctccg 240
gatgaccaga tcggctacta tcgtcgcgcc actcgtcgta ttcgtggtgg cgacggcaaa 300
atgaaagatc tgtccccgcg ttggtacttt tattacctgg gtactggtcc ggaagcaggt 360
ctgccgtatg gtgcaaacaa agatggcatc atttgggtcg cgactgaagg cgctctgaac 420
accccaaaag atcacatcgg cactcgtaac ccggctaaca acgcagcaat tgttctgcag 480
ctgccacagg gtaccactct gccgaagggt ttttacgctg aaggttctcg tggcggttcc 540
caggcaagct cccgttcttc ttcccgttct cgcaacagct ctcgcaactc taccccgggt 600
tcttctcgcg gtacttcccc ggctcgtatg gctggtaacg gtggtgatgc ggctctggct 660
ctgctgctgc tggatcgtct gaaccaactg gaatctaaaa tgtctggtaa aggccagcag 720
cagcagggtc agactgtaac caaaaaaagc gctgctgaag cgtccaagaa accgcgtcag 780
aaacgcactg ccactaaagc atacaacgtt acccaagcgt ttggtcgtcg tggtccagaa 840
cagacccagg gcaacttcgg tgaccaggaa ctgattcgtc aaggtaccga ctacaaacac 900
tggccgcaaa tcgcgcagtt cgcaccgtcc gcttccgctt tctttggcat gtcccgtatt 960
ggtatggaag ttactccgtc cggcacttgg ctgacctata cgggtgcgat taaactggac 1020
gacaaagatc ctaacttcaa agaccaggtt attctgctga acaagcacat cgacgcttat 1080
aaaactttcc cgccgaccga accgaaaaaa gacaaaaaaa aaaaagcgga tgaaactcag 1140
gctctgccgc agcgtcagaa aaaacagcag accgttactc tgctgccagc cgctgatctg 1200
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<212> DNA
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gacgacttca gcaaacaatt gcagcaatca atgtcttcgg cggatagcac ccaagcgtaa 1260

Claims (8)

1.新型冠状病毒N蛋白基因，其特征在于，所述新型冠状病毒N蛋白基因如SEQ ID NO.1所示。
2.含有权利要求1所述新型冠状病毒N蛋白基因的表达载体。
3.含有权利要求1所述新型冠状病毒N蛋白基因的重组菌。
4.一种新型冠状病毒N蛋白表达的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的新型冠状病毒N蛋白基因构建表达载体，并将所述表达载体转化至大肠杆菌中。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，成功转化表达载体的大肠杆菌菌液OD600达到0.6-0.8时，进行新型冠状病毒N蛋白诱导表达。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，诱导表达的条件是向成功转化表达载体的大肠杆菌中，加入终浓度为0.4-0.5 mM的IPTG；37-39℃诱导3-4 h。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括：
（1）将如SEQ ID NO.1所示的基因，连入表达载体pET28a，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中；
（2）取表达菌单克隆接种至含有100 μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，培养过夜；
（3）将过夜菌液加到新鲜LB液体培养基中，至OD600达到0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.4-0.5 mM，37-39℃诱导3-4 h。
8.权利要求1所述的新型冠状病毒N蛋白基因或权利要求4-7任一项所述的方法在提高可溶性新型冠状病毒N蛋白表达量中的应用。
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