CN113462727B

CN113462727B - 基于调整pH预处理蛋白质废水以提高AD产甲烷效率的方法

Info

Publication number: CN113462727B
Application number: CN202110752658.8A
Authority: CN
Inventors: 花铭; 李纪彬; 鹿时雨; 吴思琪; 潘丙才; 张炜铭
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2021-07-03
Filing date: 2021-07-03
Publication date: 2023-08-18
Anticipated expiration: 2041-07-03
Also published as: CN113462727A; JP7009687B1; JP2023008726A

Abstract

本发明公开了一种基于调整pH预处理蛋白质废水以提高AD产甲烷效率的方法，包括以下步骤：步骤1：将厌氧颗粒污泥离心，并使用蒸馏水清洗得到离心颗粒污泥备用；步骤2：将蛋白质废水通过酸性或碱性预处理，调节蛋白质废水的pH值，并在空气浴摇床中摇动得到pH预处理后蛋白质废水；步骤3：将pH预处理后蛋白质废水重新调整到中性初始值，得到中性蛋白质废水；然后将中性蛋白质废水、微量元素储备液、Na₂HPO₄、NaHCO₃以及离心颗粒污泥置于反应罐内混合，随后在摇床上摇动进行厌氧消化收集产出甲烷。本发明方法通过调整pH值对蛋白质废水进行预处理，使蛋白质的构象和结构展开，从而消除了蛋白质废水在AD过程中低甲烷化率的限制。

Description

基于调整pH预处理蛋白质废水以提高AD产甲烷效率的方法

技术领域

本发明涉及废水处理技术领域，具体是涉及一种基于调整pH预处理蛋白质废水以提高AD产甲烷效率的方法

背景技术

来自屠宰场、鱼类、乳清、酪蛋白、奶酪和某些蔬菜加工过程的高浓度有机废水通常含有大量的蛋白质，其能量密度高，生物可利用价值不容忽视。例如，乳品废水中超过40％的总化学需氧量来源于蛋白质，如何高效的处理和利用这类高蛋白废水是污水处理厂当前面临的挑战。考虑到高蛋白废水富含可生物降解的有机营养成分，大量利用生物法对这类废水进行生物转化的研究已经开展。从传统角度而言，好氧生物处理法难以应对废水中的高浓度有机物，而遭受高负荷冲击，使得反应器运行稳定性变差。同时，好氧生物处理单元需要额外提供氧气，这将导致运营成本进一步提高。相比之下，厌氧生物处理法不仅规避了好氧生物处理法的缺点，而且可以有效地回收能源，使其成为处理高浓度有机废水的理想技术。与碳水化合物如葡萄糖、作物残渣和牲畜粪便相比，以化学需氧量(COD)量化废物流中的有机物数量为衡量准则，具有较高能量密度的蛋白质拥有显著的沼气生产潜力。根据Buswell方程，在标准温度和压力下每单位COD的甲烷产量理论值为0.35L，蛋白质与COD的转换系数是1.5，而碳水化合物只有1.07。因此，研究厌氧消化(AD)***中蛋白质生物转化为甲烷的过程和效率具有重要意义。

AD是在厌氧或缺氧条件下，通过多种功能菌的相互协同，形成代谢微环境，将复杂的高浓度有机废水生物转化为可替代清洁能源的过程。AD通常被概括为以下三个步骤：水解酸化、乙酸化和甲烷生成。特别地，蛋白质是由肽键(或酰胺)相互连接的氨基酸单元形成的天然聚合物。在被功能菌利用转化为甲烷之前，蛋白质首先被细胞外酶(称为蛋白酶)水解为低聚多肽和单体氨基酸。之后，氨基酸通过哪一种途径进入发酵阶段取决于单体氨基酸的性质和浓度。然而，蛋白质水解的实际速度相当迟缓，AD的甲烷产量要低的多(低于0.5L CH₄/g蛋白质)，这是由于大量高负荷蛋白质废水的直接冲击引起的***紊乱和厌氧微生物氨抑制风险的增加。最近的工作发现，蛋白质结构的稳定性和复杂性是阻碍甲烷化的另一个重要因素，这是因为蛋白质具有三维结构，多层构象使其在原生折叠中不易被蛋白酶裂解，如稳定的氢键网络。因此，采用适当的预处理手段对于解除蛋白质废水在AD甲烷化过程中的水解速率限制至关重要。

近年来，酸、碱、热、超声波和紫外线等物理和化学方法被应用于污水或污泥等富含蛋白质生物质的预处理过程，促进了污泥中胞外聚合物的溶解和细胞壁的破碎，释放了大量细胞内有机物质，这进一步促进了甲烷的产生。然而生物质组成的复杂性和水解后有机单体来源的多样性，使得在AD产甲烷性能和生物质组分之间建立直接联系变得相当困难，只能利用理论贡献值进行简单地推算。基于这种考虑，通过预处理单一的有机材料，如蛋白质，探索水解产物和产甲烷效率之间的转换关系是合乎逻辑的。众多研究表明，蛋白质水解可以通过蛋白质变性来加速，但这些报导大多偏重于强调蛋白质废水在AD***中向氢气或VFAs的转化。因此，蛋白质原生构象和结构的展开与水解和产甲烷过程的强化之间的内在关系和机制仍然存在空白。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于调整pH预处理蛋白质废水以提高AD产甲烷效率的方法。

本发明的技术方案是：一种基于调整pH预处理蛋白质废水以提高AD产甲烷效率的方法，包括以下步骤：

步骤1：微生物制备

将厌氧颗粒污泥在12000rpm下离心10min，去除可溶性有机物，并使用蒸馏水清洗2次，得到离心颗粒污泥备用；

步骤2：pH预处理

将蛋白质废水通过pH调节处理改变蛋白质废水的pH值，并在室温下的空气浴摇床中摇动6～24h，得到pH预处理后蛋白质废水；

步骤3：厌氧消化

1)将pH预处理后蛋白质废水重新调整到pH中性初始值，得到中性蛋白质废水；

2)然后按照150mL中性蛋白质废水、1mL微量元素储备液、0.3gNa₂HPO₄、1g NaHCO₃以及15g离心颗粒污泥置于反应罐内混合，同时，通入氦气排空反应罐内氧气，保证反应罐内无氧环境；

3)随后控制反应罐内温度35±1℃并在摇床上以120rpm摇动速度进行厌氧消化，收集产出甲烷。

本发明通过采用pH预处理废水，能够使蛋白质的构象和结构展开，从而消除了蛋白质废水在AD过程中低甲烷化率的限制。

进一步地，所述步骤S2中pH调节处理具体为：采用酸性预处理，即通过4M盐酸将蛋白质废水的pH调至2～6。通过酸性预处理对蛋白质废水进行预处理，使蛋白质的构象和结构展开，从而消除了蛋白质废水在AD过程中低甲烷化率的限制。

进一步地，所述步骤S2中pH调节处理具体为：采用碱性预处理，即通过4M氢氧化钠将蛋白质废水的pH调至8～12。进行碱性预处理，特别是在pH＝12时，相对于未做pH预处理的方法中甲烷产生率明显增加了35.7％，达到149.6±16.1ml/g蛋白质；这是由于酰胺I带的C＝O拉伸振动所引起的氢键网络的崩溃，使蛋白质的二级结构发生了从有序到无序的转变；然而，时间经济性评估表明，蛋白质废水的碱性预处理(pH＝12)的最佳方案需要在时间效益和甲烷产量率效益之间进行权衡。

进一步地，所述步骤S2中空气浴摇床具体为：在室温25℃下，以100rpm摇动速度进行摇动。通过上述温度以及摇动速度对蛋白质废水能够充分的进行pH预处理，保证pH预处理蛋白质废水的处理效果。

进一步地，所述步骤S2中，在蛋白质废水进行pH预处理之前，在20～30℃温度区间变动对蛋白质废水进行可变功率的微波预处理，其中，微波频率为2～3GHz。通过微波水解蛋白质可快速地水解成氨基酸，同时微波可以不同程度的促进蛋白质的二级构象变化，进而促进蛋白质的水解，当蛋白质复杂的结构简单化后，对后续的代谢分解过程如厌氧消化代谢是有益的，大大的缩短了蛋白质废水的水解酸化步骤，从而提高了蛋白质废水的资源化利用效率。

更进一步地，所述微波功率的可变参数变动满足公式(1)，具体如下：

P＝4C·f² (1)

其中，C表示蛋白质废水的温度，P表示微波预处理的微波功率，f表示微波预处理的微波频率。通过研究发现，不同的温度、微波功率以及微波频率对蛋白质废水中蛋白质的二级构象变化促进影响不同，通过随着温度环境的适应调整变化，使微波预处理效果保持较高的处理效果，从而提高后续AD产甲烷的效率。

进一步地，所述步骤S3的混合方式具体为：按照150mL中性蛋白质废水投入明胶包覆型高碳钢珠以及15g离心颗粒污泥的混合浆体，所述明胶包覆型高碳钢珠占中性蛋白质废水总体积20～30％，其中，采用明胶包覆型高碳钢珠的混合明胶层添加有1mL微量元素储备液、1g NaHCO₃以及0.3g Na₂HPO₄。通过采用明胶包含微量元素储备液以及Na₂HPO₄能够将其缓慢释放于中性蛋白质水体中，从而保持长效的厌氧发酵处理效率。

更进一步地，所述混合浆体在投入中性蛋白质废水前，需要对明胶包覆型高碳钢珠与离心颗粒污泥混合并置于磁场强度为0.1～0.2T下搅拌15min。通过加设该范围的磁场强度进行处理，对离心颗粒污泥进行磁活化以提高微生物活性，并且能够磁化明胶包覆型高碳钢珠，利用明胶包覆型高碳钢珠的高碳钢特性对磁性长时间储存，当其投入至中心蛋白质废水中不仅可以长效的促进微生物活性，而且能够磁化影响中性蛋白质废水水体，促进对于中性蛋白质废水的厌氧消化处理。

更进一步地，所述明胶包覆型高碳钢珠的制备方法具体为：选取粒径为1±0.1cm的高碳钢珠，具体为将微量元素储备液、NaHCO₃以及Na₂HPO₄与明胶混合得到混合明胶，并将混合明胶包覆于高碳钢珠表面，使其混合明胶包覆在高碳钢的厚度在0.6±0.05cm。选取上述范围的高碳钢珠可以避免粒径过小混合明胶层附着面小等问题，粒径过大磁化效率低且质量过大极易快速沉降；上述混合明胶的厚度范围能满足厌氧消化处理的整体时长的同时，避免混合明胶层过厚影响磁化效率等。

本发明的有益效果是：

(1)本发明方法通过调整pH值对蛋白质废水进行预处理，使蛋白质的构象和结构展开，从而消除了蛋白质废水在AD过程中低甲烷化率的限制。

(2)本发明提供了多种pH值调整蛋白质废水的方案，可根据时间效益和甲烷产量率效益之间进行权衡选取pH调整蛋白质废水的最佳方案。

(3)本发明提供了微波预处理的方法，并针对变化温度调整微波功率以及微波频率，从而提高对蛋白质废水中蛋白质的二级构象变化促进的效果，进而提高后续AD产甲烷的效率。

(4)本发明提供了厌氧消化各组分添加的方式，通过采用明胶包含微量元素储备液、NaHCO₃以及Na₂HPO₄能够将其缓慢释放于中性蛋白质水体中，从而保持长效的厌氧发酵处理效率，同时利用高碳钢磁化，长效的促进微生物活性，并磁化影响中性蛋白质废水水体，提高中性蛋白质废水的厌氧消化处理效果。

附图说明

图1是不同pH值预处理24h后的甲烷产生率，(A)酸性条件(B)碱性条件，(误差棒代表一式三份样品的标准偏差)；

图2是不同预处理时间下的甲烷产率:(A)pH＝3，(B)pH＝12，(误差棒代表一式三份样品的标准偏差)；

图3是预处理蛋白废水的同步荧光光谱分析结果：(A)以pH＝3为基础的预处理时间；(B)pH＝12的预处理时间(Ex＝292nm)；

图4是蛋白质二级结构的转变，(A-D)经不同pH条件预处理的蛋白质废水的远紫外-CD光谱，(a-d)基于CD光谱解码的二级结构组成变化；

图5是最佳pH值条件下，酸性和碱性预处理后蛋白质的红外光谱图(A)pH＝3预处理24h，(B)pH＝12预处理24h。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来对本发明进行更进一步详细的说明，以更好地体现本发明的优势。

实施例1

一种基于调整pH预处理蛋白质废水以提高AD产甲烷效率的方法，包括以下步骤：

步骤1：微生物制备

步骤2：pH预处理

将蛋白质废水通过pH调节处理改变蛋白质废水的pH值，并在室温下的空气浴摇床中摇动18h，得到pH预处理后蛋白质废水；所述步骤S2中pH调节处理具体为：采用酸性预处理，即通过4M盐酸将蛋白质废水的pH调至3。通过酸性预处理对蛋白质废水进行预处理，使蛋白质的构象和结构展开，从而消除了蛋白质废水在AD过程中低甲烷化率的限制；

所述步骤S2中空气浴摇床具体为：在室温25℃下，以100rpm摇动速度进行摇动。通过上述温度以及摇动速度对蛋白质废水能够充分的进行pH预处理，保证pH预处理蛋白质废水的处理效果。

步骤3：厌氧消化

3)随后控制反应罐内温度35℃并在摇床上以120rpm摇动速度进行厌氧消化，收集产出甲烷。

实施例2

本实施例与实施例1基本相同，与其不同之处在于，所述步骤S2中pH调节处理具体为：采用酸性预处理，即通过4M盐酸将蛋白质废水的pH调至2。

实施例3

本实施例与实施例1基本相同，与其不同之处在于，所述步骤S2中pH调节处理具体为：采用酸性预处理，即通过4M盐酸将蛋白质废水的pH调至6。

实施例4

本实施例与实施例1基本相同，与其不同之处在于，所述步骤S2中pH调节处理具体为：采用碱性预处理，即通过4M氢氧化钠将蛋白质废水的pH调至12。进行碱性预处理，特别是在pH＝12时，相对于未进行pH预处理的方法中甲烷产生率明显增加了35.7％，达到149.6±16.1ml/g蛋白质；这是由于酰胺I带的C＝O拉伸振动所引起的氢键网络的崩溃，使蛋白质的二级结构发生了从有序到无序的转变；然而，时间经济性评估表明，蛋白质废水的碱性预处理(pH＝12)的最佳方案需要在时间效益和甲烷产量率效益之间进行权衡。

实施例5

本实施例与实施例4基本相同，与其不同之处在于，所述步骤S2中pH调节处理具体为：采用碱性预处理，即通过4M氢氧化钠将蛋白质废水的pH调至8。

实施例6

本实施例与实施例4基本相同，与其不同之处在于，所述步骤S2中pH调节处理具体为：采用碱性预处理，即通过4M氢氧化钠将蛋白质废水的pH调至10。

实施例7

本实施例与实施例1基本相同，与其不同之处在于，步骤S2的pH预处理在空气浴摇床中摇动6h。

实施例8

本实施例与实施例1基本相同，与其不同之处在于，步骤S2的pH预处理在空气浴摇床中摇动24h。

实施例9

本实施例与实施例1基本相同，与其不同之处在于，所述步骤S2中，在蛋白质废水进行pH预处理之前，在25℃温度区间变动对蛋白质废水进行可变功率的微波预处理，其中，微波频率为2.8GHz。通过微波水解蛋白质可快速地水解成氨基酸，同时微波可以不同程度的促进蛋白质的二级构象变化，进而促进蛋白质的水解，当蛋白质复杂的结构简单化后，对后续的代谢分解过程如厌氧消化代谢是有益的，大大的缩短了蛋白质废水的水解酸化步骤，从而提高了蛋白质废水的资源化利用效率。

所述微波功率的可变参数变动满足公式(1)，具体如下：

P＝4C·f² (1)

其中，C表示蛋白质废水的温度，P表示微波预处理的微波功率，f表示微波预处理的微波频率。通过研究发现，不同的温度、微波功率以及微波频率对蛋白质废水中蛋白质的二级构象变化促进影响不同，通过随着温度环境的适应调整变化，使微波预处理效果保持较高的处理效果，从而提高后续AD产甲烷的效率；

上述C为25，f为2.8，带入式(1)，结果为P＝784W。

实施例10

本实施例与实施例9基本相同，与其不同之处在于，微波预处理的参数不同，具体为：

上述C为20，f为2，带入式(1)，结果为P＝320W。

实施例11

上述C为30，f为3，带入式(1)，结果为P＝1080W。

实施例12

本实施例与实施例1基本相同，与其不同之处在于，所述步骤S3的混合方式具体为：按照150mL中性蛋白质废水投入明胶包覆型高碳钢珠以及15g离心颗粒污泥的混合浆体，所述明胶包覆型高碳钢珠占中性蛋白质废水总体积27％，其中，采用明胶包覆型高碳钢珠的混合明胶层添加有1mL微量元素储备液、1g NaHCO₃以及0.3g Na₂HPO₄。通过采用明胶包含微量元素储备液以及Na₂HPO₄能够将其缓慢释放于中性蛋白质水体中，从而保持长效的厌氧发酵处理效率。

其中，所述混合浆体在投入中性蛋白质废水前，需要对明胶包覆型高碳钢珠与离心颗粒污泥混合并置于磁场强度为0.15T下搅拌15min。通过加设该范围的磁场强度进行处理，对离心颗粒污泥进行磁活化以提高微生物活性，并且能够磁化明胶包覆型高碳钢珠，利用明胶包覆型高碳钢珠的高碳钢特性对磁性长时间储存，当其投入至中心蛋白质废水中不仅可以长效的促进微生物活性，而且能够磁化影响中性蛋白质废水水体，促进对于中性蛋白质废水的厌氧消化处理。

所述明胶包覆型高碳钢珠的制备方法具体为：选取粒径为1cm的高碳钢珠，具体为将微量元素储备液、NaHCO₃以及Na₂HPO₄与明胶混合得到混合明胶，并将混合明胶包覆于高碳钢珠表面，使其混合明胶包覆在高碳钢的厚度在0.6cm。选取上述范围的高碳钢珠可以避免粒径过小混合明胶层附着面小等问题，粒径过大磁化效率低且质量过大极易快速沉降；上述混合明胶的厚度范围能满足厌氧消化处理的整体时长的同时，避免混合明胶层过厚影响磁化效率等。

实施例13

本实施例与实施例12基本相同，与其不同之处在于，所述明胶包覆型高碳钢珠占中性蛋白质废水总体积20％。

实施例14

本实施例与实施例12基本相同，与其不同之处在于，所述明胶包覆型高碳钢珠占中性蛋白质废水总体积30％。

实施例15

本实施例与实施例12基本相同，与其不同之处在于，所述混合浆体在投入中性蛋白质废水前，需要对明胶包覆型高碳钢珠与离心颗粒污泥混合并置于磁场强度为0.1T下搅拌15min。

实施例16

本实施例与实施例12基本相同，与其不同之处在于，所述混合浆体在投入中性蛋白质废水前，需要对明胶包覆型高碳钢珠与离心颗粒污泥混合并置于磁场强度为0.2T下搅拌15min。

蛋白质废水AD产甲烷效率实验

现以BSA(牛血清蛋白，购自于美国Equitech-Bio)为碳源制备合成蛋白废水，其COD的设定值保持在5000mg/L；同时厌氧颗粒污泥选用中国江苏某城市污水处理厂的UASB反应器中所获得的厌氧颗粒污泥；微量元素储备液选用Hunter微量元素溶液；

沼气中的甲烷含量是用气相色谱法(Scientific^TM TRACE 1310)测试的，配备了热导检测器，以氮气为载气；圆二色谱(CD)、荧光光谱和FTIR光谱被用来描述蛋白质二级结构的变化；简而言之，应用JASCO J-715自动记录分光光度计(日本东京)，由JASCO软件控制，在室温下使用0.1厘米石英池，以获得CD光谱；预处理过的样品被稀释到大约45毫克BSA/L的浓度，然后转移到具有1厘米光路长度的石英池中；在190-250nm范围内测量分子椭圆度，带宽保持在1nm，扫描速率为50nm/min；在扫描过程中，根据选择蒸馏水作为空白，对每个光谱进行自动校正。

根据以下公式(2)、(3)计算α-螺旋含量：

其中MRE是平均残基椭圆度(deg cm² dmol^-1)，CP是蛋白质的摩尔浓度，n是氨基酸残基的数量(BSA为583)，L是细胞的路径长度(mm)；

其中MRE₂₀₈是在208nm处观察到的MRE，4000是在208nm处β形式和随机线圈构象交叉的MRE，33000是在208nm处纯螺旋的MRE值。

三维激发-发射矩阵荧光光谱法和同步荧光光谱法被用于表征蛋白质样品的发光光谱法(Fluoromax-4 Spectrofluorometer，HORIBA Scientific，法国)；样品首先通过0.45mm的亲水过滤膜过滤，然后在测试前稀释到一个近似的浓度，以避免超过仪器的测量范围；为了获得同步荧光光谱，激发波长从250到450nm，步长5nm，偏移量(Δλ)恒定为60nm；傅立叶红外光谱用于检测蛋白质中官能团的特征吸收峰，扫描范围为500-4000cm^-1。

现做出如下实验探究：

一、探究酸性预处理中不同pH下对蛋白质废水AD产甲烷效率的影响

以实施例1-3作为不同pH酸性预处理的试验对比，经不同pH梯度预处理的蛋白废水的AD产甲烷性能如图1A所示。在前12h，甲烷产生率没有出现明显的改善和组间差异。这是因为厌氧颗粒污泥需要经历一个短暂的适应阶段，而这种适应并没有因为不同的预处理条件而表现出差异。如图1A所示，未经预处理的5g COD/L BSA合成废水在120h时的甲烷产生率为110.2±5.1mL/g蛋白质。而经过酸性预处理后，合成废水在120h时的最低和最高甲烷产生率为125.5±2.6mL/g蛋白质(pH＝5)和142.6±4.0mL/g蛋白质(pH＝3)。与对照组相比，甲烷产生率分别增加了13.9％(pH＝5)和29.4％(pH＝3)，其中，对照组为未进行pH预处理的。这可能是基于在低pH值的条件下，蛋白质分子会处于不稳定的中间熔融球状态，蛋白质的构象会发生变化，易受水解酶影响的活性部分会暴露出来，这将显著提高厌氧发酵的水解和酸化效率，从而获得更好的甲烷生产速率。

二、探究碱性预处理中不同pH下对蛋白质废水AD产甲烷效率的影响

以实施例4-6作为不同pH碱性预处理的试验对比，在pH＝8-12的碱性条件下进行预处理后，如图1B所示，结果显示，120h时的最低和最高甲烷产生率分别为138.4±3.8mL/g蛋白质(pH＝8)和149.6±16.1mL/g蛋白质(pH＝12)，与对照组(110.2±5.1mL/g蛋白质)相比分别增加了25.6％和35.7％，其中，对照组为未进行pH预处理的。此外，厌氧发酵功能菌对碱性预处理的蛋白质废水的适应性似乎比酸性预处理的更高。特别是在厌氧发酵进行到24h后，观察到甲烷积累的明显差异，其中pH＝12和pH＝3的预处理蛋白废水的甲烷产生率分别为47.4±1.4mL/g蛋白质和16.9±4.2mL/g蛋白质，而对照组为13.0±0.9mL/g蛋白质。碱性预处理蛋白废水的甲烷产生率的快速增加一直持续到60h，然后两种预处理的增加趋势趋于一致。

三、探究不同pH预处理中空气浴摇床摇动时间对蛋白质废水AD产甲烷效率的影响

以实施例1、7、8作为不同空气浴摇床摇动时间的试验对比，通过对合成蛋白废水进行不同的预处理时间(6h、12h、18h和24h)来获得AD的甲烷生产性能。如图2A所示，在pH＝3的预处理6h后，通过甲烷化过程，甲烷产生率可以达到134.3±1.3mL/g蛋白质，与预处理24h的实验组(142.6±4.0mL/g蛋白质)相比，完成了74.4％的甲烷增益效果。因此，在酸性预处理(pH＝3)的条件下，对合成蛋白废水进行6h的预处理是经济上可取的。同样，在pH＝12的条件下对合成蛋白废水进行碱性预处理(图2B)，表明在预处理时间为6h时，经过120h的产甲烷过程，甲烷产生率可以达到142.6±17.3mL/g蛋白质。与碱性预处理24h的甲烷产生率(149.6±16.1mL/g蛋白质)相比，甲烷增益效果达到了82.2％。因此，不管是酸性预处理还是碱性预处理，基于经济性考虑，选择6h的预处理时间是科学合理的。此外，与酸处理的合成废水相比，无论预处理时间长短，厌氧发酵功能菌对碱处理的废水有更好的适应性。

四、探究使用/未使用微波预处理下对蛋白质废水AD产甲烷效率的影响

实施例1、9分别为未使用微波预处理、使用微波预处理下的方法，分别测定其在120h后的甲烷产出率，其中实施例1在120h后甲烷产出率约为142.6±4.0mL/g蛋白质，而实施例9在120h后甲烷产出率约为151.3±8.9mL/g蛋白质；通过对比可以看出，采用了微波预处理后的实施例9相较于实施例1而言，具有更高的产甲烷效率。

五、探究使用微波预处理下不同微波预处理参数对蛋白质废水AD产甲烷效率的影响

实施例9-11分别是不同微波预处理参数下的方法，分别测定其在120h后的甲烷产出率，其中实施例9在120h后甲烷产出率约为151.3±8.9mL/g蛋白质，而实施例10在120h后甲烷产出率约为149.1±7.3mL/g蛋白质，实施例11在120h后甲烷产出率约为152.6±9.5mL/g蛋白质；可见实施例9-11的甲烷产出率差别不明显，通过公式(1)根据温度变化对微波预处理参数进行动态调整可以保持较为稳定的产甲烷效率促进效果；

同时，以实施例10、11的温度20℃、30℃作为基准，均采用实施例9的微波功率784W进行预处理，结果记作对照例1、对照例2，对照例1在120h后甲烷产出率约为141.3±9.1mL/g蛋白质，对照例2在120h后甲烷产出率约为143.7±8.8mL/g蛋白质，对比可以看出，对照例1与实施例10、对照例2与实施例11相比，其产甲烷效率均有一定降低。

六、探究厌氧消化中不同混合方式下对蛋白质废水AD产甲烷效率的影响

实施例1、12分别是直接混合、采用明胶包覆型高碳钢珠下的方法，分别测定其在120h后的甲烷产出率，其中实施例1在120h后甲烷产出率约为142.6±4.0mL/g蛋白质，而实施例12在120h后甲烷产出率约为156.5±3.7mL/g蛋白质，通过对比可以看出，采用了明胶包覆型高碳钢珠的实施例12相较于实施例1而言，具有更高的产甲烷效率；

同时，考虑到实施例12引入了明胶，以实施例1为基准加入与实施例12相同含量的明胶，记作对照例3，对照例3在120h后甲烷产出率约为145.2±5.7mL/g蛋白质，通过对比可以看出，实施例12依然优于引入相同含量明胶的对照例3。

七、探究不同明胶包覆型高碳钢珠投加量对蛋白质废水AD产甲烷效率的影响

实施例12-14分别是不同明胶包覆型高碳钢珠投加量下的方法，分别测定其在120h后的甲烷产出率，其中实施例12在120h后甲烷产出率约为156.5±3.7mL/g蛋白质，而实施例13在120h后甲烷产出率约为150.5±3.3mL/g蛋白质，实施例14在120h后甲烷产出率约为157.5±3.9mL/g蛋白质，可以看出在投加量20～27％这一区间甲烷产出率增长较为明显，而在27～30％这一区间甲烷产出率增长较为缓慢，因此，可根据实际成本等角度出发，按照实际需求进行明胶包覆型高碳钢珠投加量的选择。

八、探究不同磁场强度处理混合浆体对蛋白质废水AD产甲烷效率的影响

实施例12、15、16分别是不同磁场强度下的方法，分别测定其在120h后的甲烷产出率，其中实施例12在120h后甲烷产出率约为156.5±3.7mL/g蛋白质，而实施例13在120h后甲烷产出率约为152.7±3.5mL/g蛋白质，实施例14在120h后甲烷产出率约为157.3±4.0mL/g蛋白质，通过对比可以看出，0.1～0.15T这一区间甲烷产出率增长较为明显，而在0.15～0.2T这一区间甲烷产出率增长较为缓慢，因此，从经济性角度考虑，选用实施例12的磁场强度较为合适。

同时，为进一步探究pH预处理对蛋白质废水AD产甲烷效率的影响，探究蛋白质废水的内源性荧光特征，蛋白质二级结构特性，以及酸碱预处理后BSA的傅立叶变换红外光谱，具体如下：

一、蛋白质废水的内源性荧光特征

蛋白质的内源性荧光主要来自分子中的色氨酸(Trp)残基、酪氨酸(Tyr)残基和苯丙氨酸(Phe)残基。作为具有强荧光的蛋白质大分子，BSA每个分子中有2个Trp残基、21个Tyr残基和26个Phe残基，这三个发色团都有自己的特征荧光峰。Trp残基包括Trp 134和Trp212，它们分别位于结构域I和结构域II中，而荧光主要由212位点的Trp残基发出。仅由色氨酸残基引起的荧光可以通过在295nm附近的激发来选择性地测量，因为酪氨酸在这个波长不吸收。此外，Trp残基比Tyr和Phe残基表现出更高的环境极性灵敏度和荧光量子产率，因此在解开蛋白质构象和结构的秘密方面发挥了长期而富有成效的光学光谱作用。

在292nm的激发波长下，未处理的BSA样品中Trp残基的最大发射峰被确定为345nm，而游离的L-Trp的最大发射峰位于352nm，导致Trp残基的最大发射波长蓝移7nm。这表明BSA中的大部分Trp残基被包裹在分子内部，处于低极性的疏水微环境中，与水的自由接触受到限制。在pH＝3的24h酸性预处理后，BSA中Trp残基的荧光峰位置从345nm变为350nm，导致红移和斯托克斯位移(Δλ)的轻微增加。同时，峰位的荧光强度也明显下降，表明微环境改变为更极性的环境，因为Trp残基从分子内部原来所在的疏水空腔中暴露出来。然而，在相同条件下，其荧光峰的发射波长略小于游离的L-Trp，且峰位仍有一定程度的蓝移，表明BSA分子内的Trp残基在pH＝3的24h预处理后并没有完全暴露在水环境中，仍有一部分存在于分子内的疏水腔中。

相反，在pH＝12的碱性条件下处理24h的BSA中Trp残基的荧光峰位置从345nm变为340nm，在发射波长方面发生了蓝移，而其荧光峰的强度下降了43.8％(从122670a.u.降至689989a.u.)。蛋白质荧光强度的下降，更多的时候是由两个因素造成的，一个是芳香族残基荧光的淬灭与荧光峰位置的移动，另一个是芳香族残基的氧化。从数据中可以看出，荧光强度的降低似乎是两种淬灭途径的协同作用的结果。此外，疏水性的增加表明Trp残基位于蛋白质分子内部的疏水性区域，这也预示着蛋白质的构象可能发生了迁移。在其他pH条件下，无论是酸性还是碱性条件，荧光强度值的下降可能只是由芳香族氨基酸的氧化引起的，而不是由荧光淬灭引起的，因为没有荧光最大发射的蓝移。

如图3和表1所示，除预处理时间为24h的情况外，在酸性预处理条件下的荧光淬灭可归因于芳香族氨基酸的氧化，因为没有发现明显的峰位变化。与酸性预处理不同，碱性预处理的蛋白废水的荧光强度发生了明显的下降，这可能是由于不同预处理时间的荧光最大峰在发射波方面发生了蓝移，导致了荧光淬灭。此外，无论预处理时间如何，碱性预处理往往会明显改变蛋白质的构象和结构，这源于蓝移导致的疏水性的增加。因此，用碱性预处理(pH＝12)只需6h就能实现蛋白质变性。

二、蛋白质二级结构特性

蛋白质水解是AD的限速步骤，其原因是由于蛋白质自身的复杂构象和结构，需要在水解酶的作用下降解成肽和氨基酸，才能被甲烷功能菌利用。原生BSA的二级结构主要是由氢键介导的肽骨架折叠形成的α-螺旋和β-折叠片状结构，其变化对蛋白质的生物利用率有重大影响。如图4所示，对远紫外光-CD光谱的进一步调查显示了不同pH工作条件下预处理的蛋白质的构象和结构变化模式。结果表明，在图4(A-D)的光谱中，在大约208和222nm处有两个明显的负峰，这通常是α-螺旋结构的特征。而如图4(a-d)所示，通过相关计算得到在不同的pH工作条件下，BSA分子二级构象和结构中四个单体的含量变化。详细来说，空白组中α-螺旋、β-折叠、β-转折和无序结构的含量分别为49.0％、8.2％、14.5％和22.0％。所有在酸性条件下预处理的样品的α-螺旋含量都有所下降，其中在pH＝3条件下预处理的样品的α-螺旋含量下降到47.5％，表明酸性预处理刺激了BSA分子的肽链有序螺旋的减少，导致了蛋白质褶皱和无序结构的增加。此外，如图4C和图4c所示，对酸性预处理(pH＝3)的时间经济性的调查显示，随着预处理时间的增加，BSA分子的二级构象和结构没有发生明显的差异，因此，可以确定6h为酸处理的首选点。

相反，如图4B和图4b所示，在pH＝12时预处理的BSA的第二个结构显示出明显的从有序到无序、从折叠到无序的结构过渡。需要强调的是，α-螺旋、β-折叠、β-转折和无序结构的含量分别为26.3％、29.5％、18.9％和32.2％。与BSA的酸性预处理相比，碱性预处理(pH＝12)能更有效地破坏蛋白质的二级结构，导致蛋白质从有序到无序的过渡，尤其是β-折叠和无序结构，这与蛋白质的降解和利用呈正相关。此外，在pH值调整为中性之前，AD产甲烷过程中α-螺旋的含量减少了46.3％，表明在pH＝12的碱性条件下，蛋白质的氢键网络可能被不可逆转地破坏。此外，如图4D和图4d所示，对碱性预处理(pH＝12)的时间经济性调查表明，时间越长，蛋白质二级构象和结构的变化越明显。因此，碱性预处理(pH＝12)时蛋白质构象和结构的改变是与时间有关的。

三、酸碱预处理后BSA的傅立叶变换红外光谱

通常，在FTIR光谱中，与BSA二级结构相关的是酰胺I和酰胺II带，其中出现在1600-1700cm^-1区域的与C＝O拉伸振动相关的吸收被记为酰胺I，而以大约1550cm^-1为中心的与N-H弯曲振动和C-N拉伸振动相关的吸收被记为酰胺II。如图5所示，与空白组相比，无论用酸性或碱性条件预处理，BSA的振动频率和振动强度都有变化。就振动频率的变化而言，用酸性或碱性条件预处理的蛋白质分子在酰胺I和酰胺II波段都有红移，表明分子中的氢键被打破。特别是，酰胺I带的光谱范围内以1645cm^-1左右为中心的吸收可以归因于α-螺旋结构的暴露。而暴露的α-螺旋峰的移动表明，由于螺旋结构的展开，BSA原生结构是扭曲的，这与CD结果的观察一致。至于振动强度，碱性预处理表现出更强的振动幅度，表明在碱性预处理过程中，氢键的断裂程度比酸性预处理更大，这可以解释碱性预处理的甲烷产量性能更优。因此，酰胺I带相对于酰胺II带对BSA二级结构变化的更大敏感性表明，C＝O拉伸振动可能是α-螺旋结构展开的主要触发因素，从而导致氢键断裂。

表1 pH＝3和pH＝12不同预处理时间下的荧光光谱参数

F^*代表荧光强度。

Claims

1.一种基于调整pH预处理蛋白质废水以提高AD产甲烷效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：微生物制备

将厌氧颗粒污泥在12000 rpm下离心10 min去除可溶性有机物，并使用蒸馏水清洗2次，得到离心颗粒污泥备用；

步骤2：pH预处理

将蛋白质废水通过pH调节处理改变蛋白质废水的pH值，并在室温下的空气浴摇床中摇动6~24 h，得到pH预处理后蛋白质废水；

步骤3：厌氧消化

1）将pH预处理后蛋白质废水重新调整到pH中性初始值，得到中性蛋白质废水；

2）然后按照150 mL中性蛋白质废水、1 mL微量元素储备液、0.3 g Na₂HPO₄、1 g NaHCO₃以及15 g离心颗粒污泥置于反应罐内混合，同时，通入氦气排空反应罐内氧气，保证反应罐内无氧环境；所述微量元素储备液选用Hunter微量元素溶液；

3）随后控制反应罐内温度35±1℃并在摇床上以120 rpm摇动速度进行厌氧消化，收集产出甲烷；

所述步骤2中pH调节处理具体为：采用酸性预处理或碱性预处理，所述酸性预处理通过4M盐酸将蛋白质废水的pH调至2~6；所述碱性预处理通过4M氢氧化钠将蛋白质废水的pH调至8~12；

所述步骤3的混合方式具体为：按照150 mL中性蛋白质废水投入明胶包覆型高碳钢珠以及15 g离心颗粒污泥的混合浆体，所述明胶包覆型高碳钢珠占中性蛋白质废水总体积20~30%，其中，采用明胶包覆型高碳钢珠的混合明胶层添加有1 mL微量元素储备液、1 gNaHCO₃以及0.3 g Na₂HPO₄。

2.如权利要求1所述的一种基于调整pH预处理蛋白质废水以提高AD产甲烷效率的方法，其特征在于，所述步骤2中空气浴摇床具体为：在室温25℃下，以100 rpm摇动速度进行摇动。

3.如权利要求1所述的一种基于调整pH预处理蛋白质废水以提高AD产甲烷效率的方法，其特征在于，所述混合浆体在投入中性蛋白质废水前，需要对明胶包覆型高碳钢珠与离心颗粒污泥混合并置于磁场强度为0.1~0.2 T下搅拌15 min。

4.如权利要求1所述的一种基于调整pH预处理蛋白质废水以提高AD产甲烷效率的方法，其特征在于，所述明胶包覆型高碳钢珠的制备方法具体为：选取粒径为1±0.1 cm的高碳钢珠，将微量元素储备液、NaHCO₃以及Na₂HPO₄与明胶混合得到混合明胶，并将混合明胶包覆于高碳钢珠表面，使其混合明胶包覆在高碳钢的厚度在0.6±0.05 cm。