JP7009687B1 - pH調整に基づいてタンパク質廃水を前処理することでADメタン生成効率を改善する方法 - Google Patents
pH調整に基づいてタンパク質廃水を前処理することでADメタン生成効率を改善する方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
処理することでADメタン生成効率を改善する方法に関する。
度有機廃水は、通常、大量のタンパク質を含み、そのエネルギー密度が高く、バイオアベ
イラビリティ値を無視することはできない。例えば、乳製品の化学的酸素要求量の40%
以上がタンパク質によるものであり、このような高タンパク質廃水をどのように効率的に
処理して利用することは、現在の下水処理施設が直面している課題である。高タンパク廃
水は生分解性有機栄養素が豊富であることを考慮して、生物学的方法を使用したこのタイ
プの廃水の生体内変化に関する多くの研究が行われている。従来の観点から、好気性生物
処理法は、廃水中の高濃度の有機物を処理することが困難であり、高負荷の影響を受け、
反応器の運転の安定性を悪化させる。同時に、好気性生物処理装置は追加の酸素を供給す
る必要があり、これは運用コストのさらなる増加につながる。対照的に、嫌気性生物処理
は、好気性生物処理の欠点を回避するだけでなく、エネルギーを効果的に回収できるため
、高濃度の有機廃水の処理に理想的な技術である。ブドウ糖、作物残渣、家畜糞尿などの
炭水化物と比較して、化学的酸素要求量(COD)を使用して、廃棄物の流れの中の有機
物の量を測定基準として定量化すると、エネルギー密度の高いタンパク質は、バイオガス
の生産に大きな可能性を秘めている。バスウェルの式によると、標準温度と標準圧力での
単位CODあたりのメタン生成の理論値は0.35 L、タンパク質とCOD間の変換係
数は1.5、炭水化物はわずか1.07である。したがって、嫌気性消化(AD)システ
ムにおけるタンパク質のメタンへの生物変換のプロセスと効率を研究することは非常に重
要である。
ることにより、複雑な高濃度有機廃水を代替のクリーンエネルギーに生物学的に変換する
プロセスである。ADは一般に、加水分解酸性化、酢酸酸性化、メタン生成の3つのステ
ップとして分かれる。特に、タンパク質は、ペプチド結合(またはアミド)によって相互
接続されたアミノ酸ユニットによって形成された天然ポリマーである。機能性細菌によっ
てメタンに変換される前に、タンパク質は最初に細胞外酵素(プロテアーゼと呼ばれる)
によってオリゴマーペプチドとモノマーアミノ酸に加水分解される。その後、アミノ酸が
発酵段階に入る方法は、モノマーアミノ酸の性質と濃度に依存する。しかしながら、タン
パク質の実際の加水分解速度は非常に遅く、ADのメタン生成ははるかに低くなり(0.
5 L CH4/gタンパク質未満)、これは、大量の高負荷タンパク質廃水の直接的な
影響と嫌気性微生物によるアンモニア阻害のリスクの増加によって引き起こされるシステ
ム障害によるものである。最近の研究では、タンパク質構造の安定性と複雑さがメタン化
を妨げるもう1つの重要な要因であることがわかり、これは、タンパク質が三次元構造を
持っており、多層コンフォメーションにより、安定した水素結合ネットワークなど、ネイ
ティブフォールディングでプロテアーゼによる切断が困難になるためである。したがって
、適切な前処理方法の使用は、ADメタン化プロセスにおけるタンパク質廃水の加水分解
速度制限を取り除くために不可欠である。
ッジなどのタンパク質が豊富なバイオマスの前処理プロセスに適用され、細胞外ポリマー
のスラッジへの溶解と細胞壁の破壊を促進し、大量の細胞内有機物を放出し、これはさら
にメタンの生成を促進する。ただし、バイオマス組成の複雑さと加水分解後の有機モノマ
ーの供給源の多様性により、ADメタン生成性能とバイオマス成分の間の直接的なリンク
を確立することは非常に困難であり、理論的な寄与値を使用してのみ簡単に推定できる。
この考えに基づいて、タンパク質などの単一の有機材料を前処理することにより、加水分
解物とメタン生成効率の間の変換関係を調査することは論理的である。多くの研究は、タ
ンパク質の加水分解がタンパク質の変性によって加速される可能性があることを示してい
るが、これらのレポートのほとんどは、ADシステムでのタンパク質廃水から水素または
VFAsへの変換に重点が置かれている。したがって、タンパク質の本来のコンフォメー
ションと構造の展開と、加水分解およびメタン生成プロセスの強化との間には、本質的な
関係とメカニズムに依然として改善余地がある。
後、ADメタン生成の効率を改善できることを見出した。
効率を改善する方法を提供し、微生物調製、pH前処理および嫌気性消化などのステップ
を含む。
ステップ1:微生物調製
嫌気性粒状スラッジを12000rpmで10分間遠心分離して可溶性有機物を除去し、
蒸留水で2回洗浄して、遠心粒状スラッジを得て用意する、
ステップ2:pH前処理
pH調整処理によりタンパク質廃水のpH値を変化させ、エアバスシェーカーで室温で6
~24時間振とうし、pH前処理後のタンパク質廃水を得る、
ステップ3:嫌気性消化
1)pH前処理後のタンパク質廃水を中性pHの初期値に再調整して、中性タンパク質廃
水を取得する、
2)次に、中性タンパク質廃水150 mL、微量元素原液1 mL、Na2HPO40
.3g、NaHCO31gおよび遠心粒状スラッジ15gを反応タンクに入れ混合し、同
時に、ヘリウムガスを反応タンク内の酸素を空にするために導入し、反応タンク内の無酸
素環境を確保する、
3)次に、反応タンク内の温度を35±1℃に制御し、シェーカーで120rpmの振と
う速度で嫌気性消化を行い、生成したメタンを回収する。
本発明は、pH値を調整してタンパク質廃水を前処理し、タンパク質のコンフォメーショ
ンおよび構造を展開することによって、ADプロセスにおけるタンパク質廃水の低いメタ
ン化速度の制限を解消する。
00 rpm振とう速度で振とうする。上記温度および振とう速度でタンパク質廃水に対
するpH前処理を十分に行い、pH前処理によるタンパク質廃水の処理効果を確保する。
本発明の一側面によれば、前記ステップS2におけるpH調整処理は、具体的に、酸性前
処理を使用し、つまり4M塩酸を使用してタンパク質廃水のpHを2~6に調整する。酸
性前処理によりタンパク質廃水を前処理して、タンパク質のコンフォメーションおよび構
造を展開することによって、ADプロセスにおけるタンパク質廃水の低いメタン化速度の
制限を解消する。
カリ前処理を使用し、つまり4M水酸化ナトリウムを使用してタンパク質廃水のpHを8
~12に調整する。アルカリ前処理により、特にpH=12の場合、pH前処理されてい
ない方法におけるメタン生成率より35.7%増加し、149.6±16.1mL/gタ
ンパク質に達し、これは、アミドIバンドのC=O伸縮振動によって引き起こされる水素
結合ネットワークの破壊によるもので、タンパク質の二次構造が秩序から無秩序に変化す
るからであり、しかしながら、時間経済性の評価では、タンパク質廃水(pH=12)の
アルカリ前処理の最適な解決策には、時間の利点とメタンの収量の利点の間のトレードオ
フが必要であることが示されている。
タンパク質廃水の可変出力マイクロ波前処理が20~30℃の温度範囲で実行され、ただ
し、マイクロ波周波数は2~3gHzであり、具体的なステップは以下のとおりである。
タンパク質はマイクロ波加水分解によってアミノ酸に迅速に加水分解され、マイクロ波は
タンパク質の二次コンフォメーション変化をさまざまな程度に促進し、次にタンパク質の
加水分解を促進することができ、タンパク質の複雑な構造が単純化されると、嫌気性消化
や代謝などのその後の代謝分解プロセスに有益であり、タンパク質廃水の加水分解・酸性
化工程が大幅に短縮され、タンパク質廃水の資源利用効率を高める。
マイクロ波パワーの可変パラメータ変動は、具体的には次の式(1)を満たす。
(1)
ただし、Cはタンパク質廃水の温度を示し、Pはマイクロ波前処理のマイクロ波パワーを
示し、fはマイクロ波前処理のマイクロ波周波数を示す。研究を通じて、異なる温度、マ
イクロ波出力、およびマイクロ波周波数が、タンパク質廃水中のタンパク質の二次コンフ
ォメーション変化に異なる影響を与えることがわかり、温度環境に適応して調整すること
により、マイクロ波前処理効果がより高い処理効果で維持され、それによってその後のA
Dメタン生成の効率を高める。
タンパク質廃水を、ゼラチン被覆高炭素鋼球と15gの遠心粒状スラッジの混合スラリー
に添加し、前記ゼラチン被覆高炭素鋼球は中性タンパク質廃水総体積の20~30%を占
め、ただし、ゼラチン被覆高炭素鋼球の混合ゼラチン層に1mL微量元素原液、1gNa
HCO3および0.3gNa2HPO4が添加される。ゼラチンに微量元素原液、NaH
CO3およびNa2HPO4が含まれると中性タンパク質の水域にゆっくりと放出され、
長期の嫌気性発酵処理効率を維持することができる。
された高炭素鋼球を遠心粒状スラッジと混合し、0.1~0.2Tの磁場強度下に15分
間置く必要がある。処理のためにこの範囲の磁場強度を加えることにより、遠心粒状スラ
ッジは磁気的に活性化され、微生物の活動を改善し、また、ゼラチンコーティングされた
高炭素鋼球を磁化し、ゼラチンコーティングされた高炭素鋼球の高炭素鋼の特性を利用し
て、磁性を長期間保存することができ、中性タンパク質廃水に入れると、微生物の活動を
長時間促進するだけでなく、中性タンパク質廃水水域を磁化することができ、中性タンパ
ク質廃水の嫌気性消化処理を促進することができる。
mの高炭素鋼球を選び、微量元素原液、NaHCO3およびNa2HPO4をゼラチンと
混合して混合ゼラチンを得、高炭素鋼にコーティングされた混合ゼラチンの厚さが0.6
±0.05cmになるように、混合ゼラチンを高炭素鋼球の表面にコーティングする。上
記の範囲の高炭素鋼球を選択することで、混合ゼラチン層の粒子サイズが小さく、接着面
が小さいなどの問題を回避でき、粒子サイズが大きすぎると、磁化効率が低く、質量が大
きすぎるため、すばやく沈降しやすくなり、上記の混合ゼラチンの厚さの範囲は、嫌気性
消化処理の全長を満たすことができ、同時に厚い混合ゼラチン層による磁化効率への影響
などを避ける。
(1)本発明の方法は、pH値を調整することによってタンパク質廃水を前処理し、タン
パク質のコンフォメーションおよび構造を展開することによって、ADプロセスにおける
タンパク質廃水の低いメタン化速度の制限を解消する。
(2)本発明は、タンパク質廃水のpH値を調整するための様々な解決策を提供し、時間
のメリットとメタンの収量のメリットのトレードオフに応じてタンパク質廃水のpH調整
に最適な解決策を選択することができる。
(3)本発明は、マイクロ波前処理方法を提供し、温度の変化に応じてマイクロ波出力お
よびマイクロ波周波数を調整することにより、タンパク質廃水中のタンパク質の二次コン
フォメーション変化を促進する効果を改善し、さらに、その後のADメタン生成の効率を
改善する。
(4)本発明は、嫌気性消化の各成分を加える方法を提供し、ゼラチンに微量元素原液、
NaHCO3およびNa2HPO4が含まれると中性タンパク質の水域にゆっくりと放出
され、長期の嫌気性発酵処理効率を維持することができる同時に、高炭素鋼の磁化により
、微生物の活動を長時間促進し、中性タンパク質廃水水域を磁化し、中性タンパク質廃水
の嫌気性消化処理を促進することができる。
らに詳細に説明する。特に明記しない限り、実施例で使用される材料および試薬はすべて
、当技術分野で従来から使用されているか、または市販されている。
一種pH調整に基づいてタンパク質廃水を前処理することでADメタン生成効率を改善す
る方法、包括以下ステップ:
ステップ1:微生物調製
嫌気性粒状スラッジを12000rpmで10分間遠心分離して可溶性有機物を除去し、
蒸留水で2回洗浄して、遠心粒状スラッジを得て用意する、
ステップ2:pH前処理
pH調整処理によりタンパク質廃水のpH値を変化させ、エアバスシェーカーで室温で6
~24時間振とうし、pH前処理後のタンパク質廃水を得、前記ステップS2におけるp
H前処理は、具体的に、酸性前処理を使用し、つまり4M塩酸を使用してタンパク質廃水
のpHを3に調整する。酸性前処理によりタンパク質廃水を前処理して、タンパク質のコ
ンフォメーションおよび構造を展開することによって、ADプロセスにおけるタンパク質
廃水の低いメタン化速度の制限を解消する。
前記ステップS2中エアバスシェーカーは、具体的に、室温25℃で、100 rpm振
とう速度で振とうする。上記温度および振とう速度でタンパク質廃水に対するpH前処理
を十分に行い、pH前処理によるタンパク質廃水の処理効果を確保する。
ステップ3:嫌気性消化
1)pH前処理後のタンパク質廃水を中性pHの初期値に再調整して、中性タンパク質廃
水を取得する、
2)次に、中性タンパク質廃水150 mL、微量元素原液1 mL、Na2HPO40
.3g、NaHCO31gおよび遠心粒状スラッジ15gを反応タンクに入れ混合し、同
時に、ヘリウムガスを反応タンク内の酸素を空にするために導入し、反応タンク内の無酸
素環境を確保する、
3)次に、反応タンク内の温度を35±1℃に制御し、シェーカーで120rpmの振と
う速度で嫌気性消化を行い、生成したメタンを回収する。
本発明は、pH値を調整してタンパク質廃水を前処理し、タンパク質のコンフォメーショ
ンおよび構造を展開することによって、ADプロセスにおけるタンパク質廃水の低いメタ
ン化速度の制限を解消する。
本実施例は、以下のことを除いて実施例1と同じであり、前記ステップS2におけるpH
前処理は、具体的に、酸性前処理を使用し、つまり4M塩酸を使用してタンパク質廃水の
pHを2に調整する。
本実施例は、以下のことを除いて実施例1と同じであり、前記ステップS2におけるpH
調整処理は、具体的に、酸性前処理を使用し、つまり4M塩酸を使用してタンパク質廃水
のpHを6に調整する。
本実施例は、以下のことを除いて実施例1と同じであり、前記ステップS2におけるpH
調整処理は、具体的に、アルカリ前処理を使用し、つまり4M水酸化ナトリウムを使用し
てタンパク質廃水のpHを12に調整する。アルカリ前処理により、特にpH=12の場
合、pH前処理されていない方法におけるメタン生成率より35.7%増加し、149.
6±16.1mL/gタンパク質に達し、これは、アミドIバンドのC=O伸縮振動によ
って引き起こされる水素結合ネットワークの破壊によるもので、タンパク質の二次構造が
秩序から無秩序に変化するからであり、しかしながら、時間経済性の評価では、タンパク
質廃水(pH=12)のアルカリ前処理の最適な解決策には、時間の利点とメタンの収量
の利点の間のトレードオフが必要であることが示されている。
本実施例は、以下のことを除いて実施例4と同じであり、前記ステップS2におけるpH
調整処理は、具体的に、アルカリ前処理を使用し、つまり4M水酸化ナトリウムを使用し
てタンパク質廃水のpHを8に調整する。
本実施例は、以下のことを除いて実施例4と同じであり、前記ステップS2におけるpH
調整処理は、具体的に、アルカリ前処理を使用し、つまり4M水酸化ナトリウムを使用し
てタンパク質廃水のpHを10に調整する。
本実施例は、以下のことを除いて実施例1と同じであり、ステップS2のpH前処理はエ
アバスシェーカーで6h振とうする。
本実施例は、以下のことを除いて実施例1と同じであり、ステップS2のpH前処理はエ
アバスシェーカーで24h振とうする。
本実施例は、以下のことを除いて実施例1と同じであり、前記ステップS2では、タンパ
ク質廃水のpH前処理の前に、タンパク質廃水の可変出力マイクロ波前処理が25℃の温
度範囲で実行され、ただし、マイクロ波周波数は2.8gHzであ。タンパク質はマイク
ロ波加水分解によってアミノ酸に迅速に加水分解され、マイクロ波はタンパク質の二次コ
ンフォメーション変化をさまざまな程度に促進し、次にタンパク質の加水分解を促進する
ことができ、タンパク質の複雑な構造が単純化されると、嫌気性消化や代謝などのその後
の代謝分解プロセスに有益であり、タンパク質廃水の加水分解・酸性化工程が大幅に短縮
され、タンパク質廃水の資源利用効率を高める。
マイクロ波パワーの可変パラメータ変動は、具体的には次の式(1)を満たす。
(1)
ただし、Cはタンパク質廃水の温度を示し、Pはマイクロ波前処理のマイクロ波パワーを
示し、fはマイクロ波前処理のマイクロ波周波数を示す。研究を通じて、異なる温度、マ
イクロ波出力、およびマイクロ波周波数が、タンパク質廃水中のタンパク質の二次コンフ
ォメーション変化に異なる影響を与えることがわかり、温度環境に適応して調整すること
により、マイクロ波前処理効果がより高い処理効果で維持され、それによってその後のA
Dメタン生成の効率を高める。
上記Cは25、fは2.8であり、式(1)に代入されると、P=784Wであった。
本実施例は、以下のことを除いて実施例9と同じであり、マイクロ波前処理のパラメータ
が異なり、具体的に、
上記Cは20、fは2であり、式(1)に代入されると、P=320Wであった。
本実施例は、以下のことを除いて実施例9と同じであり、マイクロ波前処理のパラメータ
が異なり、具体的に、
上記Cは30、fは3であり、式(1)に代入されると、P=1080Wであった。
本実施例は、以下のことを除いて実施例1と同じであり、前記ステップS3の混合方法は
、具体的に、150mLの中性タンパク質廃水を、ゼラチン被覆高炭素鋼球と15gの遠
心粒状スラッジの混合スラリーに添加し、前記ゼラチン被覆高炭素鋼球は中性タンパク質
廃水総体積の20~30%を占め、ただし、ゼラチン被覆高炭素鋼球の混合ゼラチン層に
1mL微量元素原液、1gNaHCO3および0.3gNa2HPO4が添加される。ゼ
ラチンに微量元素原液、NaHCO3およびNa2HPO4が含まれると中性タンパク質
の水域にゆっくりと放出され、長期の嫌気性発酵処理効率を維持することができる。
ただし、前記混合スラリーに中性タンパク質廃水を投入する前に、ゼラチンコーティング
された高炭素鋼球を遠心粒状スラッジと混合し、0.15Tの磁場強度下に15分間置く
必要がある。処理のためにこの範囲の磁場強度を加えることにより、遠心粒状スラッジは
磁気的に活性化され、微生物の活動を改善し、また、ゼラチンコーティングされた高炭素
鋼球を磁化し、ゼラチンコーティングされた高炭素鋼球の高炭素鋼の特性を利用して、磁
性を長期間保存することができ、中性タンパク質廃水に入れると、微生物の活動を長時間
促進するだけでなく、中性タンパク質廃水水域を磁化することができ、中性タンパク質廃
水の嫌気性消化処理を促進することができる。
前記ゼラチン被覆高炭素鋼球の調製方法は、具体的に、粒子サイズ1cmの高炭素鋼球を
選び、微量元素原液、NaHCO3およびNa2HPO4をゼラチンと混合して混合ゼラ
チンを得、高炭素鋼にコーティングされた混合ゼラチンの厚さが0.6cmになるように
、混合ゼラチンを高炭素鋼球の表面にコーティングする。上記の範囲の高炭素鋼球を選択
することで、混合ゼラチン層の粒子サイズが小さく、接着面が小さいなどの問題を回避で
き、粒子サイズが大きすぎると、磁化効率が低く、質量が大きすぎるため、すばやく沈降
しやすくなり、上記の混合ゼラチンの厚さの範囲は、嫌気性消化処理の全長を満たすこと
ができ、同時に厚い混合ゼラチン層による磁化効率への影響などを避ける。
本実施例は、以下のことを除いて実施例12と同じであり、前記ゼラチン被覆高炭素鋼球
は中性タンパク質廃水の総体積の20%を占めている。
本実施例は、以下のことを除いて実施例12と同じであり、前記ゼラチン被覆高炭素鋼球
は中性タンパク質廃水の総体積の30%を占めている。
本実施例は、以下のことを除いて実施例12と同じであり、前記混合スラリーに中性タン
パク質廃水を投入する前に、ゼラチンコーティングされた高炭素鋼球を遠心粒状スラッジ
と混合し、0.1Tの磁場強度下に15分間置く必要がある。
本実施例は、以下のことを除いて実施例12と同じであり、前記混合スラリーに中性タン
パク質廃水を投入する前に、ゼラチンコーティングされた高炭素鋼球を遠心粒状スラッジ
と混合し、0.2Tの磁場強度下に15分間置く必要がある。
次に、BSA(ウシ血清アルブミン、米国Equitech-Bioから購入)を炭素源
として使用して、合成タンパク質廃水を調製し、CODの設定値は5000mg / L
を維持し、同時に、嫌気性粒状汚泥は、中国江蘇省の都市下水処理施設のUASBリアク
ターから得られ、微量元素原液はハンター微量元素溶液を使用する。
バイオガス中のメタン含有量は、ガスクロマトグラフィー(ScientificTM
TRACE1310)によって測定され、熱伝導度検出器を搭載し、キャリアガスとして
窒素を使用し、円二色性(CD)、蛍光分光法、およびFTIR分光法は、タンパク質の
二次構造の変化を説明するために使用され、要するに、JASCOソフトウェアによって
制御されるJASCO J-715自動記録分光光度計(東京、日本)を使用し、室温で
0.1cmの石英セルを使用してCDスペクトルを取得し、前処理されたサンプルは、約
45 mg BSA / Lの濃度に希釈され、次に、光路長1cmの石英セルに移し、
190~250 nmの範囲で分子の楕円率を測定し、帯域幅は1 nmに維持され、ス
キャン速度は50 nm / minであり、スキャンプロセスでは、ブランクとして蒸
留水を選択し、各スペクトルを自動的に修正する。
次の式(2)および(3)に従ってα-ヘリックス含有量を計算する。
(2)
ただし、MREは平均残基楕円率(
)であり、CPはタンパク質のモル濃度であり、nはアミノ酸残基の数(BSAは583
)であり、Lはセルパスの長さ(mm)である。
(3)
ただし、
は208nmで観測されたMREであり、4000は、ベータフォームとランダムコイル
コンフォメーションが208nmで交差するMREであり、33000は、208nmで
の純粋なスパイラルのMRE値である。
三次元励起発光マトリックス蛍光分光法と同期蛍光分光法は、タンパク質サンプルの発光
分光法を特徴づけるために使用され(Fluoromax-4 Spectrofluo
rometer、HORIBA Scientific、フランス)、サンプルは最初に
0.45mmの親水性フィルターメンブレンでろ過され、次に、機器の測定範囲を超えな
いように、テスト前におよその濃度に希釈され、同期蛍光スペクトルを得るために、励起
波長は5 nmステップで250~450nmであり、オフセット量(Δλ)は60nm
で一定とし、フーリエ赤外分光法は、タンパク質の官能基の特徴的な吸収ピークを検出す
るために使用され、スキャン範囲は500~4000 cm-1である。
一、タンパク質廃水中のADメタン生成の効率に対する酸性前処理の異なるpHの影響の
調査
実施例1~3異なるpHでの酸性前処理試験の比較とし、異なるpH勾配で前処理された
タンパク質廃水のADメタン生成性能を図1Aに示される。最初の12時間では、メタン
生成率に有意な改善はなく、グループ間で差はない。これは、嫌気性粒状スラッジを短期
間で適応させる必要があり、この適応では前処理条件の違いによる違いが見られないため
である。図1Aに示すように、120時間で前処理を行わなかった場合の5 g COD
/ LBSA合成廃水のメタン生成率は110.2±5.1mL / gタンパク質であ
った。酸性前処理後、120時間での合成廃水の最低および最高のメタン生成速度は12
5.5±2.6mL / gタンパク質(pH=5)および142.6±4.0mL /
gタンパク質(pH=3)であった。対照組と比較して、メタン生成率はそれぞれ13.
9%(pH=5)と29.4%(pH=3)増加し、ただし、対照組はpH前処理なしの
組である。タンパク質分子が低pH条件下で不安定な中間溶融ボール状態になり、タンパ
ク質のコンフォメーションが変化し、加水分解酵素の影響を受けやすい活性部分が露出し
、これにより、嫌気性発酵の加水分解および酸性化効率が大幅に向上し、メタン生成率を
より高める。
二、タンパク質廃水中のADメタン生成の効率に対するアルカリ前処理の異なるpHの影
響の調査
実施例4~6を異なるpHのアルカリ前処理の実験比較とし、pH=8-12のアルカリ
性条件下での前処理後、図1Bに示すように、120時間での最低および最高のメタン生
成率は、それぞれ138.4±3.8mL / gタンパク質(pH=8)および149
.6±16.1mL / gタンパク質(pH=12)であり、対照組(110.2±5
.1mL/gタンパク質)と比較すると、それぞれ25.6%および35.7%増加し、
ただし、対照組はpH前処理なしの組である。さらに、嫌気性発酵機能性細菌は、酸前処
理よりもアルカリ前処理タンパク質廃水に適応しやすいようである。特に嫌気性発酵の2
4時間後、メタン蓄積の有意差が観察され、その中で、pH=12およびpH=3の前処
理されたタンパク質廃水のメタン生成率は、それぞれ47.4±1.4mL / gタン
パク質および16.9±4.2mL / gタンパク質であるが、対照組は13.0±0
.9mL/gタンパク質であった。アルカリ前処理タンパク質廃水のメタン生成率の急激
な増加は60時間まで続き、その後、2つの前処理の増加傾向は同じである傾向がある。
三、タンパク質廃水中のADメタン生成の効率に対するさまざまなpH前処理でのエアバ
スシェーカーの振とう時間の影響の調査
実施例1、7、8を異なるエアバスシェーカー振とう時間の実験比較とし、合成タンパク
質廃水のさまざまな前処理時間(6時間、12時間、18時間、および24時間)によっ
てADのメタン生成性能を得る。図2Aに示すように、pH=3で6時間前処理した後、
メタン生成速度はメタン化プロセスを通じて134.3±1.3mL / gタンパク質
に達する可能性があり、4時間前処理した実験組(142.6±4.0mL / gタン
パク質)と比較して、74.4%のメタンゲイン効果を達成した。したがって、酸性前処
理(pH=3)では、合成タンパク質廃水を6時間前処理することを経済的である。同様
に、pH=12の条件下での合成タンパク質廃水のアルカリ前処理し(図2B)、前処理
時間が6時間の場合、120時間のメタン生成プロセスの後、メタン生成率は142.6
±17.3mL / gタンパク質に達する可能性があることを示している。24時間の
アルカリ前処理のメタン生成率(149.6±16.1mL / gタンパク質)と比較
して、メタンゲイン効果は82.2%に達した。したがって、酸性前処理であろうとアル
カリ前処理であろうと、経済的考慮に基づいて、6時間の前処理時間を選択することは科
学的かつ合理的である。さらに、酸性の前処理された合成廃水と比較して、前処理時間の
長さに関係なく、嫌気性発酵機能性細菌は、アルカリ性前処理廃水に対してより良い適応
性を持っている。
四、タンパク質廃水中のADメタン生成の効率に対するマイクロ波前処理の使用/非使用
の影響の調査
実施例1、9は、それぞれマイクロ波前処理の非使用/使用の方法であり、20時間後の
メタン生成率をそれぞれ測定し、実施例1では120時間後のメタン生成率が約142.
6±4.0mL/gタンパク質であるが、実施例9では120時間後のメタン生成率が約
151.3±8.9mL/gタンパク質であり、両者を比較すると、マイクロ波前処理さ
れた実施例9は、実施例1より高いメタン生成効率を有する。
五、マイクロ波前処理下でのタンパク質廃水ADメタン生成の効率に対するさまざまなマ
イクロ波前処理パラメーターの影響の調査
実施例9~11はそれぞれ異なるマイクロ波前処理パラメータの方法であり、120時間
後のメタン生成率をそれぞれ測定し、実施例9では120時間後のメタン生成率が約15
1.3±8.9mL/gタンパク質であり、実施例10では120時間後のメタン生成率
が約149.1±7.3mL/gタンパク質であり、実施例11では120時間後のメタ
ン生成率が約152.6±9.5mL/gタンパク質であり、実施例9~11のメタン生
成率が有意差がなく、式(1)により、温度変化に応じたマイクロ波前処理パラメータの
動的調整により、メタン生成効率の比較的安定した促進効果を維持できる。
同時に、実施例10、11の温度20℃、30℃を基準にして、実施例9のマイクロ波パ
ワー784Wで前処理を行い、結果を対照例1、対照例2とし、対照例1では120時間
後のメタン生成率が約141.3±9.1mL/gタンパク質であり、対照例2では12
0時間後のメタン生成率が約143.7±8.8mL/gタンパク質であり、比較すると
、対照例1は実施例10よりも、対照例2は実施例11よりも、メタン生成効率がある程
度低下した。
六、タンパク質廃水からのADメタン生成の効率に対する嫌気性消化のさまざまな混合方
法の影響の調査
実施例1、12では、直接混合し、ゼラチン被覆高炭素鋼球の方法を採用し、120時間
後のメタン生成率をそれぞれ測定し、実施例1では120時間後のメタン生成率が約14
2.6±4.0mL/gタンパク質であり、実施例12では120時間後のメタン生成率
が約156.5±3.7mL/gタンパク質であり、両者を比較すると、ゼラチン被覆高
炭素鋼球を採用する実施例12は実施例1よりも高いメタン生成効率を有する。
同時に、実施例12にゼラチンが導入されることを考慮して、実施例1を基に、実施例1
2と同じ含有量のゼラチンを添加して、対照例3とし、対照例3では120時間後のメタ
ン生成率が約145.2±5.7mL/gタンパク質であり、両者を比較すると、実施例
12はいぜんとして同じ量のゼラチンを含有する対照例3よりも高いメタン生成効率を有
する。
七、ンパク質廃水中のADメタン生成の効率に対するゼラチンコーティングされた高炭素
鋼球のさまざまな投与量の影響の調査
実施例12~14は異なるゼラチン被覆高炭素鋼球の投入量の方法であり、120時間後
のメタン生成率をそれぞれ測定し、実施例12では120時間後のメタン生成率が約15
6.5±3.7mL/gタンパク質であり、実施例13では120時間後のメタン生成率
が約150.5±3.3mL/gタンパク質であり、実施例14では120時間後のメタ
ン生成率が約157.5±3.9mL/gタンパク質であり、メタン生成率は投与量の2
0~27%の範囲でより明らかに増加し、メタン生成率は27~30%の範囲でゆっくり
と増加するため、ゼラチンコーティングされた高炭素鋼球の投与量は、実際のコストおよ
び他の観点に基づいて、実際のニーズに応じて選択すればよい。
八、タンパク質廃水中のADメタン生成の効率に対するさまざまな磁場強度の影響の調査
実施例12、15、16は、それぞれ異なる磁場強度の方法であり、120時間後のメタ
ン生成率をそれぞれ測定し、実施例12では120時間後のメタン生成率が約156.5
±3.7mL/gタンパク質であり、実施例13では120時間後のメタン生成率が約1
52.7±3.5mL/gタンパク質であり、実施例14では120時間後のメタン生成
率が約157.3±4.0mL/gタンパク質であり、比較すると、メタン生成率は0.
1~0.15 Tの範囲で明らかに増加するため、経済的な観点から、実施例12の磁場
強度がより適切である。
同時に、タンパク質廃水中のADメタン生成の効率に対するpH前処理の影響をさらに調
査するために、酸塩基前処理後のタンパク質廃水の内因性蛍光特性、タンパク質二次構造
特性、およびBSAのフーリエ変換赤外分光法を調べ、具体的には以下のとおりである。
タンパク質の内因性蛍光は、主に分子内のトリプトファン(Trp)残基、チロシン(T
yr)残基、およびフェニルアラニン(Phe)残基に由来する。強い蛍光を発するタン
パク質高分子として、BSAは各分子に2つのTrp残基、21のTyr残基、26のP
he残基を持ち、これらの3つの発色団には、独自の特徴的な蛍光ピークがある。Trp
残基には、それぞれドメインIおよびドメインIIに位置するTrp134およびTrp
212が含まれ、蛍光は主に212位のTrp残基から放出される。チロシンはこの波長
では吸収されないため、トリプトファン残基のみによって引き起こされる蛍光は、295
nm付近の励起によって選択的に測定できる。さらに、Trp残基は、TyrおよびPh
e残基よりも高い環境極性感度と蛍光量子収率を示し、したがって、タンパク質のコンフ
ォメーションと構造の秘密を解き明かす上で、長期的かつ実りある光学分光法の役割を果
たす。
292 nmの励起波長で、未処理のBSAサンプルのTrp残基の最大発光ピークは3
45nmであると決定され、遊離L-Trpの最大発光ピークは352nmにあり、Tr
p残基の最大発光波長は7nmだけ青方偏移する。これは、BSAのTrp残基のほとん
どが分子の内部、低極性の疎水性微小環境にカプセル化されており、水との自由な接触が
制限されていることを示す。pH=3で24時間酸性前処理した後、BSAのTrp残基
の蛍光ピークの位置が345nmから350nmに変化し、これにより、赤方偏移とスト
ークスシフト(Δλ)がわずかに増加する。同時に、ピーク位置での蛍光強度も大幅に減
少し、微小環境がより極性の高い環境に変化したことを示し、Trp残基は、分子内の元
の疎水性空洞から露出しているためである。しかしながら、同じ条件下では、蛍光ピーク
の発光波長は遊離L-Trpの発光波長よりもわずかに小さく、ピーク位置にはまだある
程度の青方偏移があり、BSA分子のTrp残基が、pH=3で24時間前処理した後、
水環境に完全にさらされておらず、それらの一部が分子の疎水性空洞にまだ存在している
ことを示す。
逆に、pH=12のアルカリ性条件下で24時間処理したBSAのTrp残基の蛍光ピー
ク位置は、345nmから340nmに変化し、発光波長に青方偏移があり、その蛍光ピ
ークの強度は43.8%減少した(122670 a.u.から689989 a.u.
に低下した)。タンパク質の蛍光強度の低下は、2つの要因によって引き起こされること
が多く、1つは芳香族残基の蛍光の消光と蛍光ピーク位置のシフトであり、もう1つは芳
香族残基の酸化である。ータから、蛍光強度の低下は、2つの消光経路の相乗効果の結果
であることが分かった。さらに、疎水性の増加は、Trp残基がタンパク質分子内の疎水
性領域に位置していることを示し、これは、タンパク質のコンフォメーションがシフトし
た可能性があることも示す。他のpH条件下では、酸性またはアルカリ性の条件にかかわ
らず、蛍光強度の低下は、蛍光の最大発光のブルーシフトがないため、蛍光消光ではなく
、芳香族アミノ酸の酸化によってのみ引き起こされる可能性がある。
図3および表1に示すように、24時間の前処理時間を除いて、酸性前処理条件下での蛍
光消光は、明らかなピーク位置の変化が見られなかったため、芳香族アミノ酸の酸化に起
因する可能性がある。酸性前処理と異なり、アルカリ前処理したタンパク質廃水の蛍光強
度が大幅に低下し、これは、異なる前処理時間での最大蛍光ピークの発光波の青方偏移が
原因で、蛍光消光が起こった可能性がある。さらに、前処理時間に関係なく、アルカリ前
処理はタンパク質のコンフォメーションと構造を大幅に変化させる傾向があり、これは、
青方偏移によって引き起こされる疎水性の増加によるものである。したがって、アルカリ
前処理(pH=12)でタンパク質の変性を達成するのに6時間しかかからない。
タンパク質分解はADの律速段階であり、その理由は、タンパク質自体の複雑なコンフォ
メーションと構造のために、メタン機能細菌が使用する前に、加水分解酵素の作用下でペ
プチドとアミノ酸に分解する必要があるためである。ネイティブBSAの二次構造は、主
に水素結合を介したペプチド骨格の折り畳みによって形成されるα-ヘリックスとβ-シー
ト構造であり、この変化はタンパク質のバイオアベイラビリティに大きな影響を与える。
図4に示すように、遠紫外線CDスペクトルのさらなる調査により、異なるpH作業条件
下での前処理されたタンパク質のコンフォメーションと構造変化パターンが明らかになる
。結果から分かるように、図4(A-D)のスペクトルでは、約208nmと222nm
に2つの明らかな負のピークがあり、通常はα-ヘリックス構造の特徴である。図4(a-
d)に示すように、BSA分子の二次コンフォメーションと構造における4つのモノマー
の含有量の変化は、さまざまなpH作業条件下での相関計算によって得られる。詳細には
、ブランク組のα-ヘリックス、β-シート、β-ターンおよび無秩序構造の含有量は、そ
れぞれ49.0%、8.2%、14.5%および22.0%であった。酸性条件下で前処
理されたすべてのサンプルのα-ヘリックス含有量は減少し、その中で、pH=3で前処
理されたサンプルのα-ヘリックス含有量は47.5%に低下し、酸性の前処理がBSA
分子のペプチド鎖の規則正しいらせんの減少を刺激し、タンパク質のしわと無秩序な構造
の増加をもたらしたことを示した。さらに、図4Cおよび図4cに示すように、酸性前処
理(pH=3)の時間経済性の調査から分かるように、前処理時間の増加に伴い、BSA
分子の二次コンフォメーションと構造に明らかな違いがないため、酸性前処理の最初の選
択肢として6時間を決定できる。
逆に、図4Bおよび図4bに示されるように、pH=12で前処理されたBSAの第2の
構造は、秩序から無秩序へ、および折り畳みから無秩序への明確な移行を示した。なお、
αヘリックス、βシート、βターンおよび無秩序構造の含有量は、それぞれ26.3%、
29.5%、18.9%および32.2%であった。BSAの酸性前処理と比較して、ア
ルカリ前処理(pH=12)はタンパク質の二次構造をより効果的に破壊し、タンパク質
の秩序から無秩序への移行、特にβシートと無秩序構造をもたらし、これは、タンパク質
の分解と利用に積極的に関連する。さらに、pH値が中性に調整される前に、ADメタン
生成プロセス中のα-ヘリックスの含有量は46.3%減少し、pH=12のアルカリ性
条件下では、タンパク質の水素結合ネットワークが不可逆的に破壊される可能性があるこ
とを示す。さらに、図4Dおよび図4dに示すように、アルカリ前処理(pH=12)の
時間経済的調査は、時間が長くなるほど、タンパク質の二次コンフォメーションと構造の
変化がより明白になることを示す。したがって、アルカリ前処理(pH=12)中のタン
パク質のコンフォメーションと構造の変化は時間に依存する。
一般に、FTIRスペクトルでは、アミドIおよびアミドIIのバンドはBSAの二次構
造に関連し、その中で、1600~1700cm-1の領域でのC=O引張振動に関連す
る吸収をアミドIとし、約1550 cm-1を中心とするN-H曲げ振動およびC-N引張
振動に関連する吸収をアミドIIとする。図5に示すように、ブランク組と比較すると、
酸性またはアルカリ性の条件で前処理されているかどうかに関係なく、BSAの振動周波
数と振動強度は変化する。振動周波数の変化について、酸性またはアルカリ性条件で前処
理されたタンパク質分子は、アミドIおよびアミドIIバンドに赤方偏移があり、分子内
の水素結合が切断されていることを示す。特に、アミドIバンドのスペクトル範囲の約1
645 cm-1を中心とする吸収は、α-ヘリックス構造の露出に起因する可能性がある
。露出したα-ヘリックスピークの動きは、ヘリックス構造の展開によりBSAの本来の
構造が歪んでいることを示しており、CDの結果の観察と一致する。動強度については、
アルカリ前処理の方が振動振幅が大きく、アルカリ前処理中の水素結合破壊度が酸性前処
理よりも大きかったことから、アルカリ前処理のメタン生成性能が優れていると理解でき
る。したがって、アミドIIバンドと比較してBSA二次構造変化に対するアミドIバン
ドの感度が高いことは、C=O伸縮振動は、α-ヘリックス構造の展開の主なトリガーで
あり、水素結合の切断につながる可能性がある。
表1 pH=3とpH=12の異なる前処理時間での蛍光スペクトルパラメータ
Claims (6)
- ステップS1:微生物調製
嫌気性粒状スラッジを12000rpmで10分間遠心分離して可溶性有機物を除去し、
蒸留水で2回洗浄して、遠心粒状スラッジを得て用意するステップと、
ステップS2:pH前処理
pH調整処理によりタンパク質廃水のpH値を変化させ、エアバスシェーカーで室温で6
~24時間振とうし、pH前処理後のタンパク質廃水を得るステップと、
ステップS3:嫌気性消化
1)pH前処理後のタンパク質廃水を中性pHの初期値に再調整して、中性タンパク質廃
水を取得し、
2)次に、中性タンパク質廃水150mL、微量元素原液1mL、Na2HPO40.3
g、NaHCO31gおよび遠心粒状スラッジ15gを反応タンクに入れ混合し、同時に
、ヘリウムガスを反応タンク内の酸素を空にするために導入し、反応タンク内の無酸素環
境を確保し、
3)次に、反応タンク内の温度を35±1℃に制御し、シェーカーで120rpmの振と
う速度で嫌気性消化を行い、生成したメタンを回収するステップと、
を含み、
前記ステップS3の混合方法は、150mLの中性タンパク質廃水を、ゼラチン被覆高炭
素鋼球と15gの遠心粒状スラッジの混合スラリーに添加し、前記ゼラチン被覆高炭素鋼
球は中性タンパク質廃水総体積の20~30%を占め、ゼラチン被覆高炭素鋼球の混合ゼ
ラチン層に1mL微量元素原液、1gNaHCO 3 および0.3gNa 2 HPO 4 が添加
される、
ことを特徴とするpH調整に基づいてタンパク質廃水を前処理することでADメタン生成
効率を改善する方法。 - 前記ステップS2におけるpH調整処理は、酸性前処理を使用し、4M塩酸を使用してタ
ンパク質廃水のpHを2~6に調整する、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記ステップS2におけるpH調整処理は、アルカリ前処理を使用し、4M水酸化ナトリ
ウムを使用してタンパク質廃水のpHを8~12に調整する、ことを特徴とする請求項1
に記載の方法。 - 前記ステップS2におけるエアバスシェーカーは、室温25℃で、100rpm振とう速
度で振とうする、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記混合スラリーに中性タンパク質廃水を投入する前に、ゼラチンコーティングされた高
炭素鋼球を遠心粒状スラッジと混合し、0.1~0.2Tの磁場強度下に15分間置く、
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記ゼラチン被覆高炭素鋼球の調製方法は、粒子サイズ1±0.1cmの高炭素鋼球を選
び、微量元素原液、NaHCO3およびNa2HPO4をゼラチンと混合して混合ゼラチ
ンを得、高炭素鋼にコーティングされた混合ゼラチンの厚さが0.6±0.05cmにな
るように、混合ゼラチンを高炭素鋼球の表面にコーティングする、ことを特徴とする請求
項1に記載の方法。
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