CN113322250B - 一种MTSase固定化酶和MTHase固定化酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用 - Google Patents

一种MTSase固定化酶和MTHase固定化酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113322250B
CN113322250B CN202110204735.6A CN202110204735A CN113322250B CN 113322250 B CN113322250 B CN 113322250B CN 202110204735 A CN202110204735 A CN 202110204735A CN 113322250 B CN113322250 B CN 113322250B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cbm
spycatcher
spytag
pht
mtsase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110204735.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113322250A (zh
Inventor
王腾飞
宋龙祥
刘洪玲
王冲
张慧敏
郑涵文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qilu University of Technology
Original Assignee
Qilu University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qilu University of Technology filed Critical Qilu University of Technology
Priority to CN202110204735.6A priority Critical patent/CN113322250B/zh
Publication of CN113322250A publication Critical patent/CN113322250A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113322250B publication Critical patent/CN113322250B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C12N11/12—Cellulose or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01141—4-Alpha-D-{(1->4)-alpha-D-glucano} trehalose trehalohydrolase (3.2.1.141)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
    • C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
    • C12Y504/99015—(1->4)-Alpha-D-glucan 1-alpha-D-glucosylmutase (5.4.99.15)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种MTSase固定化酶和MTHase固定化酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用，本发明以相互作用多肽对spyTag/spyCatcher为介导，利用spyTag/spyCatcher可以在体外特异性自组装形成共价键的相互作用短肽的特性，对麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase进行一步回收和固定化，并进行双酶转化生产海藻糖实验，通过实验发现以相互作用多肽对spyCatcher‑CBM为介导的固定化载体对细胞破碎液中重组酶进行固定化，发现通过固定化对重组酶的回收率达到80.3％，本发明涉及的固定化酶提高了酶温度稳定性，酶的活性以及酶的重复利用率。

Description

一种MTSase固定化酶和MTHase固定化酶的制备方法及其在海 藻糖生产中的应用
技术领域
本发明属于基因工程和发酵工程技术领域，具体涉及一种MTSase固定化酶和MTHase 固定化酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用。
背景技术
海藻糖是一种由葡萄糖残基通过1,1-糖苷键连接的非还原性双糖，在自然界中广泛存在。 其甜味爽口，适口，具有低吸湿性、保水性、耐热性和耐酸性等优良特性；对生物细胞和活 性生物大分子具有非特异性保护作用，能提高生物细胞和大分子对高温、干燥、冷冻等恶劣 条件的抗性，被广泛用于抗体药物、疫苗、诊断试剂、活体细胞在冷冻和干燥时的生物活性 保护剂。海藻糖特殊的生物学特性使其在食品、化妆品、医药和农业领域得到广泛应用，市 场需求量逐年增加。
酶转化法生产海藻糖是目前工业化生产的主要途径，主要有磷酸化酶法、海藻糖合成酶 法和双酶法这三种方法，目前双酶法中以麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海 藻糖水解酶MTHase协同催化液化淀粉或麦芽糊精生产海藻糖已实现工业化生产，该方法利 用麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase作用于麦芽低聚糖还原性末端，将还原端两个葡萄糖分 子间的α-1,4-糖苷键异构成α-1,1-糖苷键，形成一个麦芽糖低糖基海藻糖；然后利用麦芽寡糖 基海藻糖水解酶MTHase特异性切割邻近海藻糖基的α-1,4-糖苷键，获得游离海藻糖和少一个 海藻糖分子的麦芽低聚糖。但由于酶法转化一般采用游离的酶进行转化，游离的酶的操作稳 定性和储存稳定差，转化后酶与产物难以分离，难以重复利用，同时也增加产物分离提取的 成本。
中国专利文献CN105838704A(申请号：201610320569.5)公开了一种纳米纤维生物膜固 定化双酶***及其催化合成海藻糖的方法，该方法是利用多肽标签spyCatcher/spyTag特异性 共价结合，以及将多肽标签spyTag连接在CsgA基因的碳端，将β-淀粉酶固定化于大肠杆菌 细胞表面；以可溶性淀粉为底物，将可溶性淀粉在胞外表面被催化为麦芽糖，麦芽糖进入表 达了海藻糖合成酶的大肠杆菌胞内，经海藻糖合成酶催化形成海藻糖；但是并未涉及胞外 MTSase和MTHase固定化酶的制备。
中国专利文献CN111218467A(申请号：202010106831.2)公开了一种同步分泌MTHase 和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用；中国专利文献CN111647615A(申请号：202010519285.5)公开一种构建自组装表达双酶菌株的方法及应用；虽然上述专利中公开了 结构域spyCatcher-spyTag与MTSase和MTHase多酶体系的构建，解决的技术问题是在不同 菌体中构建不同比例的MTSase-MTHase多酶复合体，但是并未涉及胞外MTSase和MTHase固定化酶的制备。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种MTSase固定化酶和MTHase固定化酶的制备 方法及其在海藻糖生产中的应用。
本发明的技术方案如下：
一种MTSase固定化酶和MTHase固定化酶的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、重组纤维素结合域蛋白spyCatcher-CBM菌株构建
a、以枯草芽孢杆菌B.subtilis 168基因组为模板，PCR扩增P43启动子基因片段；
b、以pUC57-spyCatcher质粒为模板扩增spyCatcher基因片段；
c、以pUC57-CBM质粒为模板，PCR扩增纤维素结合域蛋白CBM基因片段；
d、以pHT01质粒为模板，反向PCR扩增获得不含有启动子的线性化pHT载体；
e、利用无缝克隆将步骤a中获得的P43启动子基因片段、步骤b中获得的spyCatcher基 因片段、步骤c中获得的纤维素结合域蛋白CBM基因片段连接到步骤d获得的线性化pHT质粒上，获得pHT-P43-spyCatcher-CBM质粒；
f、将步骤e获得的表达型质粒pHT-P43-spyCatcher-CBM转化进入B.subtilisWB800n中即 得重组B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyCatcher-CBM；
g、将步骤f中的重组菌进行发酵，利用高压匀浆机进行细胞破碎，制得细胞破碎液。
步骤2、固定化载体的制备
Ⅰ、将再生纤维素微球加入步骤g的细胞破碎液中，对重组纤维素结合域蛋白 CBM-spyCatcher进行纯化回收。
Ⅱ、将步骤Ⅰ中纯化回收重组纤维素结合域蛋白spyCatcher-CBM，利用交联剂将重组纤 维素结合域蛋白spyCatcher-CBM固定在再生纤维素微球上，获得spyCatcher-CBM介导的再 生纤维素微球固定化载体。
步骤3、海藻糖生产菌株的构建，包括如下步骤：
(1)以B.subtilis 168基因组为模板，PCR扩增P43启动子基因片段；
(2)以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增 麦芽寡糖基海藻糖合成酶spyTag-MTSase基因片段、麦芽寡糖基海藻糖水解酶spyTag-MTHase 基因片段；
(3)利用多片段无缝克隆将步骤(1)获得的P43启动子基因片段和步骤(2)中获得的麦芽寡糖基海藻糖合成酶spyTag-MTSase基因片段、麦芽寡糖基海藻糖水解酶spyTag-MTHase 基因片段分别连接到步骤d获得的线性化pHT载体上，分别获得pHT-P43-spyTag-MTSase质 粒、pHT-P43-spyTag-MTHase质粒；
(4)将步骤(3)获得的表达型质粒pHT-P43-spyTag-MTSase、pHT-P43-spyTag-MTHase 分别转化进入B.subtilis WB800n中，分别得到重组菌B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyTag- MTSase、B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyTag-MTHase。
(5)将步骤(4)中的重组菌进行发酵，利用高压匀浆机进行细胞破碎，制得细胞破碎 液。
步骤4、酶的一步回收与固定化
将步骤Ⅱ中制备的spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载体分别加入步骤3制 得的细胞破碎液中，利用spyTag/spyCatcher可以特异性自发形成肽键的原理，对融合表达 spyTag的目的蛋白进行固化，然后经过滤回收含有目的蛋白的再生纤维素微球固定化载体， 即为MTSase固定化酶和MTHase固定化酶。
根据本发明优选的，所述步骤a中P43启动子基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
P43-spyCatcher-F：
CGGCCAGTGAATTCGAGCTCAGCTTCGTGCATGCAGGC SEQ ID NO.1；
P43-spyCatcher-R：
ACCATGGCCATGTGTACATTCCTCTCTTA SEQ ID NO.2。
根据本发明优选的：所述步骤b中spyCatcher基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
spyCatcher-CBM-F：
TGTACACATGGCCATGGTTGACACACTTA SEQ ID NO.3；
spyCatcher-CBM-R：
TCGGTGTCGGATCGATATGGGCATCTCCT SEQ ID NO.4。
根据本发明优选的，所述步骤c中纤维素结合域蛋白CBM基因片段的PCR扩增引物核 苷酸序列如下：
CBM-spyCatcher-F：
CCATATCGATCCGACACCGACACCGACAACACCG SEQ ID NO.5；
CBM-spyCatcher-R：TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCCAGCGGTTCTTTGC SEQ ID NO.6。
根据本发明优选的，所述步骤d中线性化的pHT载体基因片段的反向PCR扩增引物核 苷酸序列如下：
pHT-F：
TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATTCTAACTAGTATCCT SEQ ID NO.7；
pHT-R：
GAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGA SEQ ID NO.8。
根据本发明优选的，所述步骤a、b、c、d中PCR扩增体系如下：
10μmol/L上游引物2.5μl，10μmol/L下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2×PhantaMax Master Mix 25μl，加ddH2O到50μl；
扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min。
所述72℃延伸30sec/kb，是指在72℃时DNA聚合酶扩增速度30sec/kb，由于扩增的基因长度不同，所以扩增30个循环，72℃延伸的时间不同。
根据本发明优选的，利用无缝克隆将所述步骤a获得的P43启动子基因片段、步骤b中 spyCatcher基因片段、步骤c中获得纤维素结合域蛋白CBM基因片段连接到步骤d中获得的 线性化pHT载体上，获得表达型质粒pHT-P43-spyCatcherag-CBM，所述P43-Catcher-CBM的 核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
根据本发明优选的，所述步骤f中将步骤e构建的表达型质粒pHT-P43-spyCatcherag-CBM 转入B.subtilis WB800n后，得到重组菌B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyCatcherag-CBM。
进一步优选的，所述表达型质粒的重组菌株筛选：将转化子涂布于含33ug/mL氯霉素抗 性的LB平板，37℃培养12h，用牙签挑取氯霉素抗性的LB平板上的转化子，接种到含有33ug/mL氯霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养12h，分别以上述菌液为模板进行PCR扩 增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带得到整合型重组菌株即获得重组菌WB800n/pHT-P43-spyCatcherag-CBM。
根据本发明优选的，步骤Ⅰ中再生纤维素微球的制备方法为使用-15℃处理后的NaOH/ 尿素/水溶液质量比为7/2/81，处理棉短绒浆得到透明纤维素溶液，利用Span80和液体石蜡对 纤维素进行乳化制备再生纤维素微球。
进一步优选的，在25℃条件下，将4g棉短绒浆(纤维素≥95％)加入到100mL经-15℃ 处理后的NaOH/尿素/水溶液质量比为7/2/81中，然后200RPM搅拌5min，然后6000RPM 离心10min脱泡后得到透明纤维素溶液，将4g Span80溶解在160mL液体石蜡中并以 1000RPM速度搅拌1h后，加入30mL的所述纤维素溶液，所得悬浮液保持相同的1000RPM 继续搅拌乳化1h，在结束后调节pH值至pH 7.0，悬浮液固化形成再生纤维素微球，静置， 下层水相用蒸馏水漂洗三次后用丙酮洗涤三次获得再生纤维素微球。
根据本发明优选的，步骤Ⅰ中将再生纤维素微球加入步骤g中的细胞破碎液中，在pH 5.0-7.0的细胞破碎液10-60℃条件下，50-300RPM混合搅拌10-60nim对重组纤维素结合蛋 白spyCatcherag-CBM进行固回收。
进一步优选的，在pH 5.5的细胞破碎液25℃条件下，100RPM混合搅拌30nim对重组纤维素结合蛋白spyCatcherag-CBM进行固回收。
根据本发明优选的，步骤Ⅱ中的交联剂为戊二醛。
进一步优选的，将步骤Ⅰ回收的重组纤维素结合域蛋白spyCatcherag-CBM蛋白，在质 量浓度为10-30％的戊二醛中10-100RPM缓慢搅拌反应1-10h，将重组纤维素结合域蛋白spyCatcherag-CBM蛋白固定在再生纤维素微球上，获得的spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载体。
更优选的，在质量浓度为25％的戊二醛中50RPM搅拌反应1h，将重组纤维素结合域蛋白spyCatcherag-CBM蛋白固定在再生纤维素微球上，获得的spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载体。
根据本发明优选的：所述步骤(1)中P43启动子基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如 下：
P43-spyTag-F：
CGGCCAGTGAATTCGAGCTCAGCTTCGTGCATGCAGGC SEQ ID NO.9；
P43-spyTag-R：TATATGCATCAACCATAACAATATGTGCCATGTGTACATTCCTCTCTTA SEQ IDNO.10。
根据本发明优选的：所述步骤(2)中麦芽寡糖基海藻糖合成酶spyTag-MTSase基因片段 的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
MTSase-spyTag-F：
TGTTATGGTTGATGCATATAAACCGACAAAAATATCAGCAACCTACAG SEQ ID NO.11；
MTSase-spyTag-R：TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATTCTAACTAGTATCCT SEQ ID NO.12。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中麦芽寡糖基海藻糖水解酶spyTag-MTHase基因片 段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
spyTag-MTHase-F：
TGTTATGGTTGATGCATATAAACCGACAAAATTTTCGTTCGGTGGAAAT SEQ ID NO.13；
spyTag-MTHase-R：
TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCTAATTGATATACCCC SEQ ID NO.14。
根据本发明优选的，所述步骤(1)和(2)中PCR扩增体系如下：
10μmol/L上游引物2.5μl，10μmol/L下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2×PhantaMax Master Mix 25μl，加ddH2O到50μl；
扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min。
所述72℃延伸30ec/kb，是指在72℃时DNA聚合酶扩增速度30sec/kb，由于扩增的基 因长度不同，所以扩增30个循环，72℃延伸的时间不同。
根据本发明优选的，利用无缝克隆将所述步骤(1)所获得的P43启动子基因片段分别与 步骤(2)所获得的麦芽寡糖基海藻糖合成酶spyTag-MTSase基因片段、麦芽寡糖基海藻糖水 解酶spyTag-MTHase基因片段分别连接到步骤d中获得的线性化pHT载体上，分别获得表达 型质粒pHT-P43-spyTag-MTSase、pHT-P43-spyTag-MTHase，所述P43-spyTag-MTSase的核苷酸 序列如SEQ ID NO.16所示，所述P43-spyTag-MHSase的核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中重组菌株筛选：将转化子涂布于含33ug/mL氯霉 素抗性的LB平板，37℃培养12h，用牙签挑取氯霉素抗性的LB平板上的转化子，接种到含有33ug/mL氯霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养12h，分别以上述菌液为模板进行 PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带得到整合型重组菌株即获得重组菌WB800n/pHT-P43-spyTag-MTSase、B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyTag-MTHase。
根据本发明优选的，按照步骤4，将步骤(5)重组菌发酵后进行细胞破碎后，分别加入 步骤2中获得的spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载体，在温度25℃，pH5.5， 转速100RPM条件下孵育30min，利用过滤的方式截留回收再生纤维素微球固定化载体，获 得含有目的蛋白的再生纤维素微球固定化载体，即为MTSase固定化酶和MTHase固定化酶。
上述MTSase固定化酶和MTHase固定化酶在海藻糖生产中的应用。
有益效果
1、本发明以相互作用多肽对spyTag/spyCatcher为介导，利用spyTag/spyCatcher可以在 体外特异性自组装形成共价键的相互作用短肽的特性，对麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase 和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase进行一步回收和固定化，并进行双酶转化生产海藻糖实 验，通过实验发现以相互作用多肽对spyCatcher-CBM为介导的固定化载体对细胞破碎液中重 组酶进行固定化，发现通过固定化对重组酶的回收率达到80.3％。
2、本发明涉及的固定化酶提高了酶温度稳定性，酶的活性以及酶的重复利用率。
附图说明
图1为P43-spyCatcher-CBM电泳图。
图2为P43-spyTag-MTSase电泳图。
图3为P43-spyTag-MTHase电泳图。
图4为蛋白电泳图；
图中：第1泳道为蛋白Marker，第2泳道为SpyCatcher-CBM，第3泳道为SpyTag-MTHase， 第4泳道为SpyTag-MTSase。
图5为spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载体。
图6为含有MTSase、MTHase的再生纤维素微球固定化载体电镜图；
图中6-1、图6-2分别为含有MTSase、MTHase的再生纤维素微球固定化载体电镜图。
图7为实施例和对比例1、对比例2重组酶固定化率柱状图。
图8为实施例和对比例1、对比例2固定化重组酶酶活图。
图9为实施例和对比例1、对比例2固定化重组酶温度的稳定性图。
图10为实施例和对比例1、对比例2固定化重组酶pH的稳定性图。
图11为实施例和对比例1、对比例2固定化重组酶的海藻糖转化率。
图12为spyTag/spyCatcher介导的固定化载体固定回收酶示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例中未详加说明的内容均按本领域现有技术。
实施例1
构建重组质粒
1、pHT-P43-spyCatcher-CBM质粒构建
(1)克隆得到P43启动子基因片段
以B.subtilis 168基因组为模板，设计引物进行PCR扩增P43启动子基因片段。
所述P43启动子基因片段的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：
P43-spyCatcher-F：
CGGCCAGTGAATTCGAGCTCAGCTTCGTGCATGCAGGC SEQ ID NO.1；
P43-spyCatcher-R：
ACCATGGCCATGTGTACATTCCTCTCTTA SEQ ID NO.2。
所述PCR反应体系如下：
10μmol/L上游引物P43-spyCatcher-F 2.5μL，10μmol/L下游引物P43-spyCatcher-R 2.5μL， 基因模板2.5μL，2×PhantaMax Master Mix 25μL，加ddH2O到50μl；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环； 72℃延伸5min。
(2)克隆得到spyCatcher基因片段
以pUC57-spyCatcher为模板，设计引物进行PCR扩增spyCatcher基因片段。
所述spyCatcher基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
spyCatcher-CBM-F：
TGTACACATGGCCATGGTTGACACACTTA SEQ ID NO.3；
spyCatcher-CBM-R：
TCGGTGTCGGATCGATATGGGCATCTCCT SEQ ID NO.4。
所述PCR反应体系如下：
10μmol/L上游引物spyCatcher-CBM-F 2.5μL，10μmol/L下游引物spyCatcher-CBM-R 2.5 μL，基因模板2.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，加ddH2O到50μl；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环； 72℃延伸5min。
(3)克隆得到纤维素结合域蛋白CBM基因片段
CBM-spyCatcher-F：
CCATATCGATCCGACACCGACACCGACAACACCG SEQ ID NO.5；
CBM-spyCatcher-R：
TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCCAGCGGTTCTTTGC SEQ ID NO.6。
所述PCR反应体系如下：
10μmol/L上游引物CBM-spyCatcher-F 2.5μL，10μmol/L下游引物CBM-spyCatcher-R 2.5 μL，模板2.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，加ddH2O到50μl；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环； 72℃延伸5min。
(4)克隆得到线性化的pHT载体基因片段
以pHT01质粒为模板，设计反向引物进行PCR扩增线性化的pHT载体基因片段。
所述线性化的pHT载体基因片段的反向PCR扩增，引物核苷酸序列如下：
pHT-F：
TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATTCTAACTAGTATCCT SEQ ID NO.7；
pHT-R：
GAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGA SEQ ID NO.8。
所述PCR反应体系如下：
10μmol/L上游引物pHT-F 2.5μL，10μmol/L下游引物pHT-R 2.5μL，模板2.5μL， 2×Phanta Max Master Mix 25μL，加ddH2O到50μl；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3min 20sec，30个循环；72℃延伸5min。
(5)PCR结束后通过质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段 大小切下目的条带，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶产物。
(6)利用诺唯赞公司多片段段无缝克隆试剂盒将步骤(1)获得的P43启动子基因片段、 步骤(2)获得的spyCatcher基因片段、步骤(3)纤维素结合域蛋白CBM，分别连接到步骤(2)获得的线性化的pHT载体上。
所述多片段段无缝克隆连接体系为：
线性化pHT载体130ng；P43基因片段10ng；spyCatcher基因片段10ng；CBM基因片段10ng；ExnaseII 2μL；5×CE buffer 4μL；加ddH2O到20μL；
反应条件：37℃反应30min。
将无缝克隆连接产物分别转化导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得 pHT-P43-spyCatcher-CBM。经上海工程测序检测所述P43-spyCatcher-CBM的核苷酸序列如 SEQ IDNO.15所示。
2、pHT-P43-spyTag-MTSase和pHT-P43-spyTag-MTHase质粒构建
(1)克隆得到P43启动子基因片段
以B.subtilis 168基因组为模板，设计引物进行PCR扩增P43启动子基因片段。
所述P43启动子基因片段的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：
P43-spyTag-F：
CGGCCAGTGAATTCGAGCTCAGCTTCGTGCATGCAGGC SEQ ID NO.9；
P43-spyTag-R：TATATGCATCAACCATAACAATATGTGCCATGTGTACATTCCTCTCTTA SEQ IDNO.10。
所述PCR反应体系如下：
10μmol/L上游引物P43-spyTag-F 2.5μL，10μmol/L下游引物P43-spyTag-R 2.5μL，模板 2.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，加ddH2O到50μl；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环； 72℃延伸5min。
(2)克隆得到麦芽寡糖基海藻糖合成酶spyTag-MTSase基因片段
以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，设计引物进行 PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶spyTag-MTSase基因片段。
所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶spyTag-MTSase基因片段的PCR扩增，引物核苷酸序列如 下：
MTSase-spyTag-F：
TGTTATGGTTGATGCATATAAACCGACAAAAATATCAGCAACCTACAG SEQ ID NO.11；
MTSase-spyTag-R：
TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATTCTAACTAGTATCCT SEQ ID NO.12。
所述PCR反应体系如下：
10μmol/L上游引物MTSase-spyTag-F 2.5μL，10μmol/L下游引物MTSase-spyTag-R2.5 μL，模板2.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，加ddH2O到50μl；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min 10sec，30个循环；72℃延伸5min。
(3)克隆得到麦芽寡糖基海藻糖合水解酶spyTag-MTHase基因片段
以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，设计引物进行 PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶spyTag-MTHase基因片段。
所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶spyTag-MTHase基因片段的PCR扩增，引物核苷酸序列如 下：
spyTag-MTHase-F：
TGTTATGGTTGATGCATATAAACCGACAAAATTTTCGTTCGGTGGAAAT SEQ ID NO.13；
spyTag-MTHase-R：
TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCTAATTGATATACCCC SEQ ID NO.14。
所述PCR反应体系如下：
10μmol/L上游引物spyTag-MTHase-F2.5μL，10μmol/L下游引物spyTag-MTHase-R2.5 μL，模板2.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，加ddH2O到50μl；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min 10sec，30个循环；72℃延伸5min。
(4)PCR结束后通过质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段 大小切下目的条带，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶产物。
(5)利用诺唯赞公司多片段段无缝克隆试剂盒将步骤(1)获得的P43启动子基因片段和 步骤(2)获得的麦芽寡糖基海藻糖合成酶spyTag-MTSase基因片段、步骤(3)获得的麦芽 寡糖基海藻糖水解酶spyTag-MTHase基因片段，分别连接到线性化的pHT载体上。
所述多片段无缝克隆连接体系为：
线性化pHT载体130ng；P43基因片段10ng；spyTag-MTSase基因片段92ng；ExnaseII2μL；5×CE buffer 4μL；加ddH2O到20μL；
线性化pHT载体130ng；P43基因片段10ng；spyTag-MTHase基因片段90ng；ExnaseII2μL；5×CE buffer 4μL；加ddH2O到20μL；
反应条件：37℃反应30min。
将无缝克隆连接产物分别转化导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得 pHT-P43-spyTag-MTSase和pHT-P43-spyTag-MHSase质粒。经上海工程测序检测所述 P43-spyTag-MTSase的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，P43-spyTag-MTHase的核苷酸序列如 SEQ IDNO.17所示。
实施例2
B.subtilis WB800n电转感受态细胞的制备
挑取新鲜LB固体培养基表面的B.subtilis WB800n单菌落于5mL LB液体培养基中，培 养12h；取1mL培养12h培养物接入50mL GM培养基(GM培养基：LB+0.5M山梨醇) 中，37℃振荡培养至OD600为1.0。将菌液冰水浴10min，5000RPM，4℃离心8min，收集 菌体；用20mL预冷的ETM培养基(ETM培养基：0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+质量浓度为 10％甘油)重悬菌体，5000RPM，4℃离心8min，去上清，如此洗涤3次；将洗涤后的菌 体重悬于500μL ETM培养基中，分装于EP管中，每管分装60μL。
实施例3
将实施例1制备的重组质粒转入实施例2制备的B.subtilis WB800n中
分别将6μL pHT-P43-spyCatcher-CBM、6μL pHT-P43-spyTag-MTSase质粒和6μLpHT-P43-spyTag-MTHase质粒分别加入到60μL B.subtilis WB800n感受态细胞中，冰上孵育5 min，加入预冷的电转杯(2mm)中，在2500V、5ms条件下进行电转化，电击完毕后，立 即在电转杯中加入1mL 37℃预热的RM培养基(RM培养基：LB+0.5M山梨醇+0.38M甘 露醇)，37℃振荡复苏培养3h，涂布于含33ug/mL氯霉素的LB平板上，3℃倒置培养，筛 选含有抗33ug/mL氯霉素的菌株为阳性重组菌B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyCatcher-CBM、 B.subtilisWB800n/pHT-P43-spyTag-MTSase和B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyTag-MTHase。
实施例4
实施例3制备的阳性重组菌的鉴定
将上述阳性重组菌落接种到LB液体培养基中培养过夜，利用上海生物工程有限公司提 供的试剂盒提取基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，分别对应的P43-spyCatcher-F/ CBM-spyCatcher-R、P43-spyTag-F/MTSase-spyTag-R和P43-spyTag-F/spyTag-MTHase-R为引物 进行PCR扩增。
所述菌落PCR扩增体系为20μL：
10μmol/L上游引物1μL；10μmol/L下游引物1μL；基因模板1μL；2×Phanta MaxMaster Mix 10μL；用ddH2O补足至20μL；
所述菌落PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环；72℃延伸5min。
琼脂糖凝胶电泳证明外源质粒pHT-P43-spyCatcher-CBM(如图1所示)、pHT-P43-spyTag -MTSase(如图2所示)和pHT-P43-spyTag-MTHase(如图3所示)已转入B.subtilisWB800n 中，将重组菌命名为B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyCatcher-CBM、B.subtilisWB800n/pHT-P43 -spyTag-MTSase和B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyTag-MTHase。
实施例5
上述实施例4验证后的阳性重组菌的发酵
a、将重组菌接种于LB固体培养基中，37℃恒温摇床培养12h；
b、将LB固体培养基中重组菌接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min恒温摇床培养 12h，制得初始种子液；
c、将步骤b制得的种子液按体积百分比1％的比例转接到TB液体培养基中，37℃、200 r/min恒温摇床培养10h，制得接种种子液；
d、将步骤c制得的接种种子液按体积百分比10％的比例转接到50L发酵培养基中，在 转速500RPM，温度37℃，发酵48h。
培养基
LB固体培养基：蛋白胨1g/L，酵母浸粉0.5g/L，NaCl 1g/L，琼脂粉2g/L，余量水；
LB液体培养基：蛋白胨1g/L，酵母浸粉0.5g/L，NaCl 1g/L，余量水，pH 7.0；
TB发酵培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，甘油4ml/L，KH2PO42.4 g/L，K2HPO4 16.5g/L，余量水；
发酵培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，蔗糖12g/L，KH2PO40.6 g/L，K2HPO44g/L，余量水。
发酵结束后进行蛋白纯化，蛋白电泳图如图4所示，图中：第1泳道为蛋白Marker，第 2泳道为SpyCatcher-CBM，第3泳道为SpyTag-MTHase，第4泳道为SpyTag-MTSase。
实施例6
再生纤维素微球固定化载体的制备
在25℃条件下，将4g棉短绒浆(纤维素≥95％)加入到100mL经-15℃处理后的NaOH/ 尿素/水溶液(质量比为7/2/81)中，然后200RPM搅拌5min，然后6000RPM离心10min脱泡后得到透明纤维素溶液。
将4g Span80溶解在160mL液体石蜡中并以1000RPM速度搅拌1h后，加入30mL的 上述纤维素溶液。所得悬浮液保持相同的1000RPM速度继续搅拌乳化1h。在结束后调节值 至pH 7.0，悬浮液固化形成再生纤维素微球。静置，下层水相用蒸馏水多次漂洗后用丙酮洗涤三次得到再生纤维素微球。
实施例7
spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载体的制备。
将实施例5中发酵后的B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyCatcher-CBM发酵液利用高压匀浆 机进行细胞破碎，破碎后调节破碎液pH 5.5，加入实施例6中制备的再生纤维素微球，在25 ℃条件下100RPM混合搅拌30nim对重组纤维素结合蛋白spyCatcherag-CBM进行固回收， 利用超纯水洗脱除去未结合的蛋白，获得spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载 体。
实施例8
由于实施例7中制备的spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载体是不稳定的， 即纤维素结合域蛋白CBM与再生纤维素结合是可逆的，为了获得稳定固定化载体，将实施 例7中制备的spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载体加入25％的戊二醛50RPM 搅拌反应1h，将重组纤维素结合域蛋白spyCatcher-CBM通过戊二醛交联剂固定到再生纤维 素微球载体上，然后用pH 5.5的磷酸盐缓冲液洗脱3次，除去未结合的蛋白，经真空干燥后 4℃储存备用，spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载体，如图5所示；图5为 spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载体。
实施例9
将实施例8中制备的5mg spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载体分别加入 100mL实施例5中发酵后经过高压匀浆机破碎的B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyTag-MTSase 和B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyTag-MTHase菌液中，在25℃，pH 5.5，100RPM搅拌条件 下孵育30min，对发酵液中的重组酶spyTag-MTSase和spyTag-MTHase进行一步回收和固定 化，然后用pH 5.5的磷酸盐缓冲液洗脱3次去除杂蛋白，利用过滤的方式截留回收再生纤维 素微球固定化载体，获得含有目的蛋白的再生纤维素微球固定化载体，即MTSase固定化酶 和MTHase固定化酶，电镜图如图6中的图6-1、6-2所示。
对比例1
将pHT-P43-MTSase质粒和pHT-P43-MTHase质粒分别转入B.subtilis WB800n菌中，获得 阳性重组菌，命名为B.subtilis WB800n/pHT-P43-MTSase和B.subtilis WB800n/pHT-P43- MTHase；
所述阳性重组菌采用实施例5的发酵方法对阳性重组菌进行发酵，分别对麦芽寡糖基海 藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase进行纯化，分别将纯化后的MTSase 和MTHase在质量浓度为25％的戊二醛中50RPM搅拌反应1h的条件下，将MTSase和MTHase分别固定到再生纤维素微球载体上，并与相互作用多肽对spyTag/spyCatcher介导的 再生纤维素微球载体进行对照实验。
对比例2
将pHT-P43-MTSase-CBM质粒和pHT-P43-MTHase-CBM质粒分别转入B.subtilisWB800n 菌中，获得阳性重组菌，命名为B.subtilis WB800n/pHT-P43-MTSase-CBM和B.subtilis WB800n/pHT-P43-MTHase-CBM；
所述阳性重组菌采用实施例5的发酵方法对阳性重组菌进行发酵，分别对麦芽寡糖基海 藻糖合成酶MTSase-CBM和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase-CBM进行纯化，分别将纯化 后的MTSase-CBM和MTHase-CBM在质量浓度为25％的戊二醛中50RPM搅拌反应1h的 条件下，将MTSase-CBM和MTHase-CBM分别固定到再生纤维素微球载体上，并与相互作 用多肽对spyTag/spyCatcher介导的再生纤维素微球载体进行对照实验。
效果例1
检测实施例9和对比例1、对比例2对重组酶固定化效率
分别加入总浓度为2mg/mL的实施例7、对比例1、对比例2的涉及的重组酶，并按照实施例9、对比例1、对比例2的方法对重组酶进行固定化，并检测各种方法固定化的效果，结果见图7所示。
检测方法：将实施例9和对比例1、对比例2按照各自方法进行固定化后，然后6000RPM 离心10min，吸取上清液，利用Bradford法测定蛋白质含量，以牛血清蛋白(BAS)为标准 蛋白。
重组酶固定化率公式：
Figure BDA0002949379060000141
其中2为固定化开始时的蛋白浓度(mg/mL)；C上为固定化结束后上清液中蛋白浓度(mg/mL)。
本发明涉及的固定化方法对重组酶的回收率达到80.3％。
效果例2
检测实施例9和对比例1、对比例2的固定化方法载体对重组酶酶活的影响
检测方法：分别用取0.1mM实施例9和对比例1、对比例2中制备重组麦芽寡糖基海藻
糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶，在55℃pH 5.5的条件下进行酶活测定，结果见图8所示，图8为实施例和对比例1、对比例2固定化重组酶酶活。
重组麦芽寡糖基海藻糖合成酶的酶活的测定：
标准曲线测定：麦芽六糖浓度标准曲线测定用20mmol·L-1pH 5.5的磷酸盐缓冲液配制 10g/L的麦芽六糖溶液，DNS比色法测定和记录在OD540处的吸光值，绘制麦芽六糖标准曲 线。
重组麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活力的测定：用20mmol·L-1pH 5.5的磷酸盐缓冲液，将 麦芽六糖配成10g/L的溶液，取200μL的麦芽六糖溶液置于60℃水浴锅中预热，分别加入 摩尔浓度为0.1mM实施例9中的MTSase固定化酶和对比例1中固定到再生纤维素微球载体 上的MTSase、对比例2中固定到再生纤维素微球载体上的MTSase-CBM重组酶，精确反应 10min，煮沸灭酶。取100μL反应液于具塞试管中，加入900μL水和1mLDNS，沸水煮沸7min，冷却后加入8mL去离子水，混匀。于540nm测定吸光值。
重组麦芽寡糖基海藻糖合成酶的酶活单位定义为每分钟消耗1μmol麦芽六糖所有酶量。
酶活公式：
Figure RE-GDA0003051281870000152
其中ΔA＝Δ540(空白对照)-Δ540(样品)；990.85为麦芽六糖相对分子质量；1.0548为 DNS测定麦芽六糖标准曲线的斜率；N为稀释倍数。
重组麦芽寡糖基海藻糖水解酶的酶活的测定：
标准曲线测定：麦芽四糖浓度标准曲线测定用20mmol·L-1pH 5.5的磷酸盐缓冲液配制 10g/L的麦芽四糖溶液，DNS比色法测定和记录在OD540处的吸光值，绘制麦芽四糖标准曲 线。
重组麦芽寡糖基海藻糖水解酶酶活力的测定：10μLMTSase浓缩酶液加到490μL10g·L-1的麦芽四糖溶液中(20mmol·L-1p H 5.5的磷酸盐缓冲液配制)，60℃反应2h，100℃沸水中 煮10min终止反应。待溶液冷却后，分别加入摩尔浓度为0.1mM实施例9中的MTHase固 定化酶和对比例1中固定到再生纤维素微球载体上的MTHase、对比例2中固定到再生纤维 素微球载体上的MTHase-CB重组酶，60℃反应10min，沸水浴内煮10min终止反应，取 100μL反应液，加入900μL水和1mLDNS溶液，沸水中煮7min，加水补至10mL，最后 测定A540值。
重组麦芽寡糖基海藻糖水解酶的酶活单位定义为：每分钟转化生成1μmol麦芽四糖所需 的酶量。
酶活公式：
Figure RE-GDA0003051281870000161
其中ΔA540为样品在OD540处的吸光度；666.58为麦芽四糖相对分子质量；1.1024为DNS 测定麦芽四糖标准曲线的斜率；N为稀释倍数。
效果例3
检测实施例9和对比例1、对比例2的固定化重组酶的稳定性
(1)实施例9和对比例1、对比例2重组酶的温度稳定性
将实施例9和对比例1、对比例2的固定化重组酶在pH 5.5的条件下60℃保温，分别在1d、2d、3d、4d、5d、7d、8d取样测定残留酶活，定义0h酶活为100％，结果如图9 所示。
重组麦芽寡糖基海藻糖合成酶、重组麦芽寡糖基海藻糖水解酶的酶活的测定方法同效果 例2。
(2)实施例9和对比例1、对比例2重组酶的pH稳定性
将实施例9和对比例1、对比例2的固定化重组酶在pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH6.0、 pH 7.0、pH 8.0、pH 9.0、pH 10.0、pH 11.0的条件下4℃保温，24h后取样测定残留酶活，定义0h酶活为100％，结果如图10所示。
重组麦芽寡糖基海藻糖合成酶、重组麦芽寡糖基海藻糖水解酶的酶活的测定方法同效果 例2。
效果例4
检测实施例9和对比例1、对比例2的固定化重组酶的海藻糖转化率
将实施例9和对比例1、对比例2的固定化重组酶，按照麦芽寡糖基海藻糖合成酶90U·g-1麦芽糊精和麦芽寡糖基海藻糖水解酶30U·g-1麦芽糊精，在pH 5.5，60℃，100RPM，麦芽糊 精的质量浓度为20％的条件下反应，同时添加质量浓度为5％的环糊精葡萄糖基转移酶，转 化2h后过滤取出固定化酶加入新的反应体系中，滤液100℃处理10min，使酶失活，检测反 应液(糖化液)中海藻糖的含量，共进行5次连续转化，结果如图11所示。
海藻糖含量检测方法如下：
通过高效液相色谱测定反应液(糖化液)中所生成的海藻糖的浓度，测定过程中采用氨 基柱；柱温为40℃；流动相采用乙腈与水的混合溶液，二者体积比为3:1；流速为1mL/min； 检测器为示差检测器；检测时间为20min。
Figure RE-GDA0003051281870000171
结果分析
通过实施例9和对比例1、对比例2的对比实验，发现实施例9能有效减少固定化对酶 活的损失，明显优于传统方法对酶的固定化，这是由于避免了重组酶纯化过程中对酶的浪费 和酶活的损失，同时避免重组酶在固定化的过程中与交联剂的接触，减少了酶活的损失。虽 然实施例9对酶的固定化率低于传统的戊二醛固定化酶的效率，但是戊二醛固定化的酶需要 经过纯化，不能直接从细胞破碎液中进行回收和固定化。
本发明涉及的固定化方法虽然对酶的pH稳定性影响不大，但提高了酶的温度稳定性， 提高了酶活性，通过5次循环转化海藻糖的转化率测定发现，该方法将纤维素结合域蛋白通 过戊二醛固定在再生纤维素微球上能够有效提高酶的回收率有利于提高酶的使用寿命； spyTag/spyCatcher介导的固定化载体可以作为通用型固定化载体，只要对重组酶进行改造， 在其C-端或N-端融合表达39个碱基(即13个氨基酸)相互作用多肽spyTag即可特异性的 从发酵液或细胞破碎液中对重组酶进行回收和固定化，可广泛利用到其他重组酶的回收和固 定化，有利于提高重组酶重复利用效率。
SEQUENCE LISTING
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种MTSase固定化酶和MTHase固定化酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应
用
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cggccagtga attcgagctc agcttcgtgc atgcaggc 38
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
accatggcca tgtgtacatt cctctctta 29
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtacacatg gccatggttg acacactta 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcggtgtcgg atcgatatgg gcatctcct 29
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccatatcgat ccgacaccga caccgacaac accg 34
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttagtggtgg tggtggtggt gttccagcgg ttctttgc 38
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttagtggtgg tggtggtggt gcattctaac tagtatcct 39
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gagctcgaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtga 39
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cggccagtga attcgagctc agcttcgtgc atgcaggc 38
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tatatgcatc aaccataaca atatgtgcca tgtgtacatt cctctctta 49
<210> 11
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgttatggtt gatgcatata aaccgacaaa aatatcagca acctacag 48
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttagtggtgg tggtggtggt gcattctaac tagtatcct 39
<210> 13
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgttatggtt gatgcatata aaccgacaaa attttcgttc ggtggaaat 49
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ttagtggtgg tggtggtggt gttctaattg atatacccc 39
<210> 15
<211> 1351
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
agcttcgtgc atgcaggccg gggcatatgg gaaacagcgc ggacggagcg gaatttccaa 60
tttcatgccg cagccgcctg cgctgttctc atttgcggct tccttgtaga gctcagcatt 120
attgagtgga tgattatatt ccttttgata ggtggtatgt tttcgcttga acttttaaat 180
acagccattg aacatacggt tgatttaata actgacaaac atcaccctct tgctaaagcg 240
gccaaggacg ctgccgccgg ggctgtttgc gtttttgccg tgatttcgtg tatcattggt 300
ttacttattt ttttgccaaa gctgtaatgg ctgaaaattc ttacatttat tttacatttt 360
tagaaatggg cgtgaaaaaa agcgcgcgat tatgtaaaat ataaagtgat agcggtacca 420
ttataggtaa gagaggaatg tacacatggc catggttgac acacttagcg gccttagctc 480
cgaacaaggc cagagcggcg atatgacgat cgaagaagac tccgccacgc acatcaagtt 540
cagcaaacgc gacgaggatg gcaaggaact ggccggcgcc acaatggaac ttcgcgacag 600
cagcggcaaa acgatcagca catggatcag cgatggccaa gttaaggact tctatcttta 660
tccgggcaag tacacgttcg tcgaaacagc cgccccagat ggctatgagg ttgccacagc 720
catcacgttt acggtcaacg aacaaggcca agttacggtt aatggcaagg ccacgaaagg 780
agatgcccat atcgatccga caccgacacc gacaacaccg acgccgacgc cgacaacacc 840
gacaccgacg ccgacaagca atctgaaagt tgaattttat aatagcaatc cgagcgatac 900
aacaaattca attaatccgc aatttaaagt tacaaataca ggcagcagcg caattgatct 960
gagcaaactg acacttagat attattatac agttgatggc caaaaagatc aaacattctg 1020
gtgcgatcat gcagcaatta ttggcagcaa tggctcatat aatggcatta caagcaatgt 1080
taaaggcaca tttgttaaaa tgtcatcatc aacaaataat gccgatacat atctggaaat 1140
ttcatttaca ggcggaacac tggaaccggg cgcacacgtt caaattcaag gcagatttgc 1200
aaaaaatgat tggtcaaatt atacacaaag caatgattat agctttaaaa gcgcgtcaca 1260
atttgttgaa tgggatcagg tgacggcgta tctgaacggc gtgctggttt ggggcaaaga 1320
accgctggaa caccaccacc accaccacta a 1351
<210> 16
<211> 2665
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
agcttcgtgc atgcaggccg gggcatatgg gaaacagcgc ggacggagcg gaatttccaa 60
tttcatgccg cagccgcctg cgctgttctc atttgcggct tccttgtaga gctcagcatt 120
attgagtgga tgattatatt ccttttgata ggtggtatgt tttcgcttga acttttaaat 180
acagccattg aacatacggt tgatttaata actgacaaac atcaccctct tgctaaagcg 240
gccaaggacg ctgccgccgg ggctgtttgc gtttttgccg tgatttcgtg tatcattggt 300
ttacttattt ttttgccaaa gctgtaatgg ctgaaaattc ttacatttat tttacatttt 360
tagaaatggg cgtgaaaaaa agcgcgcgat tatgtaaaat ataaagtgat agcggtacca 420
ttataggtaa gagaggaatg tacacatggc acatattgtt atggttgatg catataaacc 480
gacaaaaata tcagcaacct acagattaca gttaaataag aattttaatt ttggtgacgt 540
aatcgataac ctatggtatt ttaaggattt aggagtttcc catctctacc tctctcctgt 600
cttaatggct tcgccaggaa gtaaccatgg gtacgatgta atagatcatt caaggataaa 660
cgatgaactt ggaggagaga aagaatacag gagattaata gagacagctc atactattgg 720
attaggtatt atacaggaca tagtaccaaa tcacatggct gtaaattctc taaattggcg 780
actaatggat gtattaaaaa tgggtaaaaa gagtaaatat tatacgtact ttgacttttt 840
cccagaagat gataagatac gattacccat attaggagaa gatttagata cagtgataag 900
taaaggttta ttaaagatag taaaagatgg agatgaatat ttcctagaat atttcaaatg 960
gaaacttcct ctaacagagg ttggaaatga tatatacgac actttacaaa aacagaatta 1020
taccctaatg tcttggaaaa atcctcctag ctatagacga ttcttcgatg ttaatacttt 1080
aataggagta aatgtcgaaa aagatcacgt atttcaagag tcccattcaa agatcttaga 1140
tttagatgtt gatggctata gaattgatca tattgatgga ttatatgatc ctgagaaata 1200
tattaatgac ctgaggtcaa taattaaaaa taaaataatt attgtagaaa aaattctggg 1260
atttcaggag gaattaaaat taaattcaga tggaactaca ggatatgact tcttaaatta 1320
ctccaactta ctgtttaatt ttaatcaaga gataatggac agtatatatg agaatttcac 1380
agcggagaaa atatctataa gtgaaagtat aaagaaaata aaagcgcaaa taattgatga 1440
gctatttagt tatgaagtta aaagattagc atcacaacta ggaattagct acgatatatt 1500
gagagattac ctttcttgta tagatgtgta cagaacttat gctaatcaga ttgtaaaaga 1560
gtgtgataag accaatgaga tagaggaagc aaccaaaaga aatccagagg cttatactaa 1620
attacaacaa tatatgccag cagtatacgc taaagcttat gaagatactt tcctctttag 1680
atacaataga ttaatatcca taaatgaggt tggaagcgat ttacgatatt ataagatatc 1740
gcctgatcag tttcatgtat ttaatcaaaa acgaagagga aaaatcacac taaatgccac 1800
tagcacacat gatactaagt ttagtgaaga tgtaaggatg aaaataagtg tattaagtga 1860
atttcctgaa gaatggaaaa ataaggtcga ggaatggcat agtatcataa atccaaaggt 1920
atcaagaaat gatgaatata gatattatca ggttttagtg ggaagttttt atgagggatt 1980
ctctaatgat tttaaggaga gaataaagca acatatgata aaaagtgtca gagaagctaa 2040
gataaatacc tcatggagaa atcaaataaa agaatatgaa aatagagtaa tggaattagt 2100
ggaagaaact tttaccaata aggatttcat taaaagtttc atgaaatttg aaagtaagat 2160
aagaaggata gggatgatta agagcttatc cttggtcgca ttaaaaatta tgtcagccgg 2220
tatacctgat ttttatcagg gaacagaaat atggcgatat ttacttacag atccagataa 2280
cagagtccca gtggatttta agaaattaca cgaaatatta gaaaaatcca aaaaatttga 2340
aaaaaatatg ttagagtcta tggacgatgg aagaattaag atgtatttaa catataagct 2400
tttatcccta agaaaacagt tggctgagga ttttttaaag ggcgagtata agggattaga 2460
tctagaagaa ggactatgtg ggtttattag gtttaacaaa attttggtaa taataaaaac 2520
caagggaagt gttaattaca aactgaaact tgaagaggga gcaatttaca cagatgtatt 2580
gacaggagaa gaaattaaaa aagaggtaca gattaatgag ctacctagga tactagttag 2640
aatgcaccac caccaccacc actaa 2665
<210> 17
<211> 2173
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
agcttcgtgc atgcaggccg gggcatatgg gaaacagcgc ggacggagcg gaatttccaa 60
tttcatgccg cagccgcctg cgctgttctc atttgcggct tccttgtaga gctcagcatt 120
attgagtgga tgattatatt ccttttgata ggtggtatgt tttcgcttga acttttaaat 180
acagccattg aacatacggt tgatttaata actgacaaac atcaccctct tgctaaagcg 240
gccaaggacg ctgccgccgg ggctgtttgc gtttttgccg tgatttcgtg tatcattggt 300
ttacttattt ttttgccaaa gctgtaatgg ctgaaaattc ttacatttat tttacatttt 360
tagaaatggg cgtgaaaaaa agcgcgcgat tatgtaaaat ataaagtgat agcggtacca 420
ttataggtaa gagaggaatg tacacatggc acatattgtt atggttgatg catataaacc 480
gacaaaattt tcgttcggtg gaaatattga aaaaaataaa ggtatcttta agttatgggc 540
accttatgtt aatagtgtta agctgaagtt aagcaaaaaa cttattccaa tggaaaaaaa 600
cgatgaggga tttttcgaag tagaaataga cgatatcgag gaaaatttaa cctattctta 660
tattatagaa gataagagag agatacctga tcccgcatca cgatatcaac ctttaggagt 720
tcatgacaaa tcacaactta taagaacaga ttatcagatt cttgaccttg gaaaagtaaa 780
aatagaagat ctaataatat atgaactcca cgttggtact ttttcccaag aaggaaattt 840
caaaggagta atagaaaagt tagattacct caaggatcta ggaatcacag gaattgaact 900
gatgcctgtg gcacaatttc cagggaatag agattgggga tacgatggtg tttttctata 960
cgcagttcaa aatacttatg gcggaccatg ggaattggct aagctagtaa acgaggcaca 1020
taaaagggga atagccgtaa ttttggatgt tgtatataat catataggtc ctgagggaaa 1080
ttacctttta ggattaggtc cttatttttc agacagatat aaaactccat ggggattaac 1140
atttaatttt gatgataggg gatgtgatca agttagaaaa ttcattttag aaaatgtcga 1200
gtattggttt aagaccttta aaatcgatgg tctgagactg gatgcagttc atgcaatttt 1260
tgataattcg cctaagcata tcctccaaga gatagctgaa aaagcccatc aattaggaaa 1320
atttgttatt gctgaaagtg atttaaatga tccaaaaata gtaaaagatg attgtggata 1380
taaaatagat gctcaatggg ttgacgattt ccaccacgca gttcatgcat tcataacaaa 1440
agaaaaagat tattattacc aggattttgg aaggatagaa gatatagaga aaacttttaa 1500
agatgttttt gtttatgatg gaaagtattc tagatacaga ggaagaactc atggtgctcc 1560
tgtaggtgat cttccaccac gtaaatttgt agtcttcata caaaatcacg atcaagtagg 1620
aaatagagga aatggggaaa gactttccat attaaccgat aaaacgacat accttatggc 1680
agccacacta tatatactct caccgtatat accgctaata tttatgggcg aggaatatta 1740
tgagacgaat ccttttttct tcttctctga tttctcagat cccgtattaa ttaagggtgt 1800
tagagaaggt agactaaagg aaaataatca aatgatagat ccacaatctg aggaagcgtt 1860
cttaaagagt aaactttcat ggaaaattga tgaggaagtt ttagattatt ataaacaact 1920
gataaatatc agaaagagat ataataattg taaaagggta aaggaagtta ggagagaagg 1980
gaactgtatt actttgatca tggaaaaaat aggaataatt gcatcgtttg atgatattgt 2040
aattaattct aaaattacag gtaatttact tataggcata ggatttccga aaaaattgaa 2100
aaaagatgaa ttaattaagg ttaacagagg tgttggggta tatcaattag aacaccacca 2160
ccaccaccac taa 2173

Claims (23)

1.一种MTSase固定化酶和MTHase固定化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、重组纤维素结合域蛋白spyCatcher-CBM菌株构建
a、以枯草芽孢杆菌B.subtilis168基因组为模板，PCR扩增P43启动子基因片段；
b、以pUC57-spyCatcher质粒为模板扩增spyCatcher基因片段；
c、以pUC57-CBM质粒为模板，PCR扩增纤维素结合域蛋白CBM基因片段；
d、以pHT01质粒为模板，反向PCR扩增获得不含有启动子的线性化pHT载体；
e、利用无缝克隆将步骤a中获得的P43启动子基因片段、步骤b中获得的spyCatcher基因片段、步骤c中获得的纤维素结合域蛋白CBM基因片段连接到步骤d获得的线性化pHT质粒上，获得pHT-P43-spyCatcher-CBM质粒；
f、将步骤e获得的表达型质粒pHT-P43-spyCatcher-CBM转化进入B.subtilisWB800n中即得重组B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyCatcher-CBM；
g、将步骤f中的重组菌进行发酵，利用高压匀浆机进行细胞破碎，制得细胞破碎液；
步骤2、固定化载体的制备
Ⅰ、将再生纤维素微球加入步骤g的细胞破碎液中，对重组纤维素结合域蛋白CBM-spyCatcher进行纯化回收；
Ⅱ、将步骤 Ⅰ 中纯化回收重组纤维素结合域蛋白spyCatcher-CBM，利用交联剂将重组纤维素结合域蛋白spyCatcher-CBM固定在再生纤维素微球上，获得spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载体；
步骤3、海藻糖生产菌株的构建，包括如下步骤：
（1）以B.subtilis168基因组为模板，PCR扩增P43启动子基因片段；
（2）以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶spyTag-MTSase基因片段、麦芽寡糖基海藻糖水解酶spyTag-MTHase基因片段；
（3）利用多片段无缝克隆将步骤（1）获得的P43启动子基因片段和步骤（2）中获得的麦芽寡糖基海藻糖合成酶spyTag-MTSase基因片段、麦芽寡糖基海藻糖水解酶spyTag-MTHase基因片段分别连接到步骤d获得的线性化pHT载体上，分别获得pHT-P43-spyTag-MTSase质粒、pHT-P43-spyTag-MTHase质粒；
（4）将步骤（3）获得的表达型质粒pHT-P43-spyTag-MTSase、pHT-P43-spyTag-MTHase分别转化进入B.subtilis WB800n中，分别得到重组菌B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyTag-
MTSase、B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyTag-MTHase；
（5）将步骤（4）中的重组菌进行发酵，利用高压匀浆机进行细胞破碎，制得细胞破碎液；
步骤4、酶的一步回收与固定化
将步骤Ⅱ中制备的spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载体分别加入步骤3制得的细胞破碎液中，利用spyTag/spyCatcher可以特异性自发形成肽键的原理，对融合表达spyTag的目的蛋白进行固化，然后经过滤回收含有目的蛋白的再生纤维素微球固定化载体，即为MTSase固定化酶和MTHase固定化酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a中P43启动子基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b中spyCatcher基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c中纤维素结合域蛋白CBM基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d中线性化的pHT载体基因片段的反向PCR扩增引物核苷酸序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a、b、c、d中PCR扩增体系如下：
10 μmol/L上游引物2.5 μl，10 μmol/L下游引物2.5 μl，基因模板2.5 μl，2×PhantaMax Master Mix 25 μl，加ddH2O到50 μl；
扩增程序如下：
95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 sec，60 ℃退火15 sec，72 ℃延伸30 sec/kb，30个循环；72 ℃延伸5 min。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用无缝克隆将所述步骤a获得的P43启动子基因片段、步骤b中spyCatcher基因片段、步骤c中获得纤维素结合域蛋白CBM基因片段连接到步骤d中获得的线性化pHT载体上，获得表达型质粒pHT-P43-spyCatcherag-CBM，所述P43-Catcher-CBM的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
所述步骤f中将步骤e构建的表达型质粒pHT-P43-spyCatcherag-CBM转入B.subtilisWB800n后，得到重组菌B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyCatcherag-CBM。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表达型质粒的重组菌株筛选：将转化子涂布于含33 ug/mL氯霉素抗性的LB平板，37 ℃培养12 h，用牙签挑取氯霉素抗性的LB平板上的转化子，接种到含有33 ug/mL氯霉素抗性的LB液体培养基，37 ℃培养12 h，分别以上述菌液为模板进行PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带得到整合型重组菌株即获得重组菌WB800n/pHT-P43-spyCatcherag-CBM。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤 Ⅰ 中再生纤维素微球的制备方法为使用-15 ℃处理后的NaOH/尿素/水溶液质量比为7/2/81，处理棉短绒浆得到透明纤维素溶液，利用Span80和液体石蜡对纤维素进行乳化制备再生纤维素微球。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在25 ℃条件下，将4 g棉短绒浆加入到100mL经-15 ℃处理后的NaOH/尿素/水溶液中，所述棉短绒浆的纤维素≥95%，所述NaOH/尿素/水溶液的质量比为7/2/81，然后200RPM搅拌5min，然后6000 RPM离心10 min脱泡后得到透明纤维素溶液，将4 g Span80溶解在160 mL液体石蜡中并以1000RPM速度搅拌1 h后，加入30 mL的所述纤维素溶液，所得悬浮液保持相同的1000RPM继续搅拌乳化1 h，在结束后调节pH值至pH 7.0，悬浮液固化形成再生纤维素微球，静置，下层水相用蒸馏水漂洗三次后用丙酮洗涤三次获得再生纤维素微球。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤 Ⅰ 中将再生纤维素微球加入步骤g中的细胞破碎液中，在pH 5.0-7.0的细胞破碎液10-60 ºC条件下，50-300RPM混合搅拌10-60nim对重组纤维素结合蛋白spyCatcherag-CBM进行固回收。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在pH 5.5的细胞破碎液25 ºC条件下，100RPM混合搅拌30 nim对重组纤维素结合蛋白spyCatcherag-CBM进行固回收。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤Ⅱ 中的交联剂为戊二醛。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，将步骤 Ⅰ 回收的重组纤维素结合域蛋白spyCatcherag-CBM蛋白，在质量浓度为10-30 %的戊二醛中10-100RPM反应1-10 h，将重组纤维素结合域蛋白spyCatcherag-CBM蛋白固定在再生纤维素微球上，获得的spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载体。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在质量浓度为25 %的戊二醛中50RPM搅拌反应1 h，将重组纤维素结合域蛋白spyCatcherag-CBM蛋白固定在再生纤维素微球上，获得的spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载体。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中P43启动子基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中麦芽寡糖基海藻糖合成酶spyTag-MTSase基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中麦芽寡糖基海藻糖水解酶spyTag-MTHase基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）和（2）中PCR扩增体系如下：
10 μmol/L上游引物2.5 μl，10 μmol/L下游引物2.5 μl，基因模板2.5 μl，2×PhantaMax Master Mix 25 μl，加ddH2O到50 μl；
扩增程序如下：
95 ℃预变性3 min；95℃变性15 sec，60 ℃退火15 sec，72 ℃延伸30 sec/kb，30个循环；72 ℃延伸5 min。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用无缝克隆将所述步骤（1）所获得的P43启动子基因片段分别与步骤（2）所获得的麦芽寡糖基海藻糖合成酶spyTag-MTSase基因片段、麦芽寡糖基海藻糖水解酶spyTag-MTHase基因片段分别连接到步骤d中获得的线性化pHT载体上，分别获得表达型质粒pHT-P43-spyTag-MTSase、pHT-P43-spyTag-MTHase，所述P43-spyTag-MTSase的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述P43-spyTag-MHSase的核苷酸序列如 SEQ ID NO.17所示。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中重组菌株筛选：将转化子涂布于含33 ug/mL氯霉素抗性的LB平板，37 ℃培养12 h，用牙签挑取氯霉素抗性的LB平板上的转化子，接种到含有33 ug/mL氯霉素抗性的LB液体培养基，37 ℃培养12 h，分别以上述菌液为模板进行PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带得到整合型重组菌株即获得重组菌WB800n/pHT-P43-spyTag-MTSase、B.subtilis WB800n/pHT-P43-spyTag-MTHase。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，按照步骤4，将步骤（5）重组菌发酵后进行细胞破碎后，分别加入步骤2中获得的spyCatcher-CBM介导的再生纤维素微球固定化载体，在温度25 ℃，pH 5.5，转速100RPM搅拌条件下孵育30 min，利用过滤的方式截留回收再生纤维素微球固定化载体，获得含有目的蛋白的再生纤维素微球固定化载体，即为MTSase固定化酶和MTHase固定化酶。
23.权利要求1-22任一项所述方法制备的MTSase固定化酶和MTHase固定化酶在海藻糖生产中的应用。
CN202110204735.6A 2021-02-23 2021-02-23 一种MTSase固定化酶和MTHase固定化酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用 Active CN113322250B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110204735.6A CN113322250B (zh) 2021-02-23 2021-02-23 一种MTSase固定化酶和MTHase固定化酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110204735.6A CN113322250B (zh) 2021-02-23 2021-02-23 一种MTSase固定化酶和MTHase固定化酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113322250A CN113322250A (zh) 2021-08-31
CN113322250B true CN113322250B (zh) 2022-12-23

Family

ID=77414381

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110204735.6A Active CN113322250B (zh) 2021-02-23 2021-02-23 一种MTSase固定化酶和MTHase固定化酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113322250B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117417874B (zh) * 2023-12-19 2024-04-09 东北农业大学 一种工程菌株hc6-mt及其在低温生产海藻糖中的应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101250267B (zh) * 2008-04-14 2011-09-14 武汉大学 一种纤维素微球的制备方法
CN105802951B (zh) * 2014-12-30 2021-03-05 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 固定化脂肪酶及其制备方法和用途
CN109679887B (zh) * 2018-12-06 2020-12-22 齐鲁工业大学 一种利用高效分泌表达的双酶融合酶耦合发酵生产海藻糖的方法
CN111218467B (zh) * 2020-02-20 2021-12-21 齐鲁工业大学 一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113322250A (zh) 2021-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111218467B (zh) 一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用
EP4276171A1 (en) Bacillus subtilis genetically engineered bacterium for producing tagatose and method for preparing tagatose
CN111172127A (zh) 一种蔗糖磷酸化酶在制备甘油葡萄糖苷中的应用
CN105838704A (zh) 一种纳米纤维生物膜固定化双酶***及其催化合成海藻糖的方法
CN113322250B (zh) 一种MTSase固定化酶和MTHase固定化酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用
CN114107341B (zh) 真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在生产淫羊藿苷中的应用
CN112680433B (zh) 一种利用嗜盐细菌生产并分泌蛋白的方法
CN112094781B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN109694892B (zh) 制备红景天苷的方法和试剂盒
CN109593739B (zh) 重组酮酸还原酶突变体、基因、工程菌及其应用
US20220204965A1 (en) Method for constructing trehalose multi-enzyme complex in vitro mediated by artificial scaffold protein
CN114807099B (zh) 普鲁兰酶突变体、工程菌及其应用
CN114806913B (zh) 具有线粒体定位还原tca途径的高产琥珀酸酵母工程菌株及其构建方法和应用
CN116200318A (zh) 一种胞外分泌表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌
CN112646831A (zh) 一种穿梭质粒及构建方法及其在集胞藻转化外源基因中的应用
CN112430611A (zh) 一种经优化的玉米赤霉烯酮降解酶zhd-p编码基因、重组菌体、表面展示体系与应用
CN111378674A (zh) 异宗毁丝霉糖化酶MhglaA及其编码基因和在葡萄糖生产中的应用
CN111499688B (zh) 一种信号肽及其在生产α-淀粉酶中的应用
CN112795526B (zh) 合成α-熊果苷的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
CN114854807B (zh) 一种生产海藻糖六磷酸的方法
CN114540397B (zh) 增强调控蛋白表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法
CN114507656B (zh) 一种制备富含古洛糖醛酸的褐藻四糖的方法
JP4317966B2 (ja) α−グルコシダーゼ遺伝子を含有する組換えベクター、形質転換体およびそれを用いたα−グルコシダーゼの製造方法
CN117821348A (zh) 一种胞外分泌表达κ-卡拉胶酶的重组枯草芽孢杆菌
CN104830704A (zh) (r)-羰基还原酶在***滑假丝酵母中原位表达重组菌及用其高效制备(r)-苯基乙二醇的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant