CN112646831A - 一种穿梭质粒及构建方法及其在集胞藻转化外源基因中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用Kana启动子分别启动Kana抗性基因和目的基因的穿梭质粒及其在集胞藻转化外源基因中的应用。该质粒利用集胞藻PCC6803的psbA2基因启始密码子ATG前510bp片段作为同源重组上游臂，以psbA2基因ORF片段为同源重组下游臂基础上，在Kana抗性基因与终止子之间再***Kana抗性基因启动子(Kana基因启始密码子ATG前174bp)以及目的基因获得穿梭质粒P5ST1T2KAN，利用Kana启动子分别启动Kana抗性基因和目的基因及在集胞藻中的表达。同时，本发明以上述穿梭质粒为载体，构建了以Kana基因启动子启动纤维素酶CelI15基因表达的集胞藻PCC6803工程藻株PSCE15，实现了利用Kana启动子分别启动Kana抗性基因和纤维素酶CelI15以及纤维素酶CelI15在集胞藻PCC6803中的异源表达。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用Kana启动子分别启动Kana抗性基因和目的基因及在集胞藻PCC 6803中表达的穿梭质粒及其构建方法，并且公开了一种利用此质粒的构建的表达纤维素内切 酶CelI15的集胞藻PCC 6803基因工程藻，属于基因工程技术领域。
背景技术
质粒(Plasmid)是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较 小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。是闭合环状的双链DNA分子，具有自主复制 能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。细菌质粒是DNA 重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞 中去进行增殖和表达的工具。
蓝藻又称蓝细菌(cyanobacteria)，是一类能进行光合作用的原核生物。其能够利用光照 产生ATP来固定大气CO2，生长条件简单，只需在光照下利用一些简单营养物质便能生长。 集胞藻(Synechocystis.sp.PCC6803)PCC6803做为一种单细胞蓝藻，具有生长速度快、培养条 件简单、不产生毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等特点，适合于利用广核 生物反应器大规模生产，是很好的蓝藻基因工程受体。
鉴于蓝藻表达的外源基因产物易纯化、不含毒素、藻细胞培养成本低且不容易污染等的 优点，随着藻类基因工程的发展，使利用蓝藻作为外源基因表达载体以生产药物等高附加值产 品成为可能。
蓝藻基因改造大体分为三个阶段：第一，外源通过基因转移***进入宿主细胞；第二， 外源DNA在宿主细胞中稳定复制并得以表达；第三，外源DNA与宿主细胞染色体或内源质 粒结合，或者在宿主细胞中进行自主复制。外源DNA进入蓝藻细胞在以下几种情况下可以 稳定存在：首先，外源基因重组进宿主染色体；其次，外源基因重组进宿主内源质粒；第三， 外源基因以质粒形式存在并且能自主复制。
同源重组分单交换形式和双交换两种类型。其中同源重组双交换载体是在外源基因两侧 均有一段与宿主细胞染色体同源的片段，当重组质粒进入宿主细胞后，载体上外源基因两端 的同源序列分别与宿主细胞内染色体的相应部位发生交换。这样，重组载体上的外源基因就 随着同源序列进而整合进宿主细胞染色体上，载体上其余片段没有进入宿主细胞染色体中。
对蓝藻进行分子生物学改造，常使用psbA2基因启始密码子ATG前510bp片段作为启动 子，将目的基因导入到psbA2基因启始密码子ATG前510bp片段的后面，通过psbA2基因启始密码子ATG前510bp片段作为目的基因的启动子启动目的基因的表达。但是该启动子有
为了克服光感启动子缺陷，进一步提高目的基因的表达量。实现外源目的基因在集胞藻 内表达不依赖于光，且高效表达。本发明考虑采用Kana启动子作为目的基因表达的启动子， 在Kana抗性基因与终止子之间***Kana抗性基因启动子和目的基因，利用Kana启动子启 动Kana抗性基因和目的基因及在集胞藻内的表达，得到可在大肠杆菌与集胞藻PCC6803中 表达的穿梭质粒载体P5ST1T2KAN。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种利用Kana启动子启动Kana抗性基因和 目的基因及在集胞藻PCC6803中表达的穿梭质粒及其构建方法。
本发明另一个目的是提供一种利用Kana抗性基因启动子启动纤维素酶CelI15在集胞藻 PCC6803表达的基因工程藻，实现了利用Kana抗性基因启动子启动纤维素酶CelI15在集胞 藻PCC6803中的异源表达。
本发明的技术方案如下：
上述一种利用Kana启动子启动Kana抗性基因和目的基因的穿梭质粒的构建方法，步骤 如下：
(1)以序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为上下游引物，以野生集胞藻PCC6803基因 组为模板，通过PCR扩增技术获得上游臂psbA2-up，通过引物在psbA2-up两端添加酶切位 点ApaI，获得序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。
(2)以PUC4K质粒为模板，以序列表中SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5为上下游引物，获取 Kana抗性基因启动子Promoter-kan，通过引物在5’端引入Nhe1酶切位点，3’端引入Hpa1 酶切位点。获得的序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。以序列表中SEQ ID NO：7和SEQID NO：8 为上下游引物，通过PCR技术获取Kana抗性基因启动子+Kana抗性基因片段，通过引物在5’ 端引入BamH1酶切位点，3’端引入Nhe1酶切位点，获得的序列如序列表中SEQ IDNO：9所 示。以序列表中SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11为上下游引物，获取Kana抗性基因终止子片 段，通过引物在5’端引入Nhe1酶切位点，3’端引入BamH1酶切位点，获得的序列如序列 表中SEQ ID NO：12所示。
(3)用限制性内切酶ApaI处理质粒载体P5ST1T2-downstream(山东农科院惠赠)(图2 所示)，将步骤(1)中获得的psbA2-up基因片段与回收所得的P5ST1T2-downstream在重组 酶的作用下同源重组。制得载体P-P5ST1T2-downstream。
(4)用限制性内切酶BamH1处理PUC18质粒，将步骤(2)中的Kana抗性基因启动子+Kana 抗性基因片段、Kana抗性基因终止子片段与回收所得的PUC18载体在重组酶的作用下同源重 组，获得PUC18NPT质粒。
(5)对质粒P-P5ST1T2-downstream和PUC18NPT进行BamH1单酶切，电泳后分别回收P-P5ST1T2-downstream载体片段和PUC18NPT中的NPT片段，如图1A所示。对载体片段去磷酸化后与NPT片段连接，得到质粒P-P5ST1T2NPT。
(6)用限制性内切酶Nhe1处理P-P5ST1T2NPT，将步骤(2)中获得的Promoter-kan片段与回收所得的P-P5ST1T2NPT在重组酶的作用下同源重组。得到穿梭质粒P5ST1T2KAN(图3所示)。
附图说明
图1为纤维素内切酶CelI15基因、NPT片段电泳图；
图2为P5ST1T2-downstream质粒结构图；
图3为P5ST1T2KAN质粒结构图；
图4为葡萄糖标准曲线图；
图5为酶活图；
本发明在Kana抗性基因与终止子之间通过酶切位点NheI***3’段含有Hpa1酶切位点 的Kana抗性基因启动子，并通过Hpa1酶切位点***目的基因获得质粒P5ST1T2KAN。获得一 种利用Kana启动子启动Kana抗性基因和目的基因及在集胞藻中的表达。本发明的另一个目 的是提供一种利用Kana启动子启动Kana抗性基因和纤维素酶CelI15以及在集胞藻PCC6803 表达的基因工程藻，实现了利用Kana启动子启动纤维素酶CelI15在集胞藻PCC6803中的高 效表达。
具体实施方式
下面结合说明书附图及实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围 不限于此。本发明实施例中使用的集胞藻PCC6803野生型藻株从武汉淡水藻种库购买， P5ST1T2-downstream质粒由山东农科院惠赠，puc4k及puc18质粒为本实验室保藏。
实施例1
P-P5ST1T2-downstream质粒的构建：
以序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为上下游引物，以野生集胞藻PCC6803基因组 为模板，通过PCR扩增技术获得上游臂psbA2-up，通过引物在psbA2-up两端添加酶切位点 ApaI与同源臂，获得序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。扩增程序为：预变性，94℃，3min； 变性，98℃，10s；退火，温度55℃，时间为15s；延伸，72℃，40s；循环，变性-退火-延伸的循环30个；72℃，5min；4℃，10min；PCR反应结束后进行电泳切胶回收。用限制性内 切酶ApaI处理质粒载体P5ST1T2-downstream，将回收获得的psbA2-up与回收的P5ST1T2-downstream在重组酶的作用下进行同源重组，获得P-P5ST1T2-downstream质粒。 重组连接体系如下：回收获得的psbA2-up基因1μL，ApaI处理后的P5ST1T2-downstream质 粒2.5μL，重组酶2μL，10×Buffer4μL，ddH2O10μL，总体系20μL，反应温度37，反应 时间2h。
实施例2
P5ST1T2KAN质粒的构建
(1)NPT的获得
以序列表中SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8为上下游引物，以PUC4K质粒为模板，通过PCR 技术获取Kana抗性基因启动子+Kana抗性基因片段，通过引物在5’端引入BamH1酶切位点 与同源臂，3’端引入Nhe1酶切位点与同源臂，获得的序列如序列表中SEQ ID NO：9所示。扩增程序为：预变性，94℃，3min；变性，98℃，10s；退火，温度55℃，时间为15s；延伸， 72℃，1min；循环，变性-退火-延伸的循环30个；72℃，5min；4℃，10min；PCR反应结束 后进行电泳切胶回收。以序列表中SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11为上下游引物，以PUC4K 质粒为模板，获取Kana抗性基因终止子片段，通过引物在5’端引入Nhe1酶切位点与同源 臂，3’端引入BamH1酶切位点与同源臂，获得的序列如序列表中SEQ ID NO：12所示。扩增 程序为：预变性，94℃，3min；变性，98℃，20s；退火，温度55℃，时间为15s；延伸，72℃， 40s；循环，变性-退火-延伸的循环30个；72℃，5min；4℃，10min；PCR反应结束后进行 电泳切胶回收。
(2)PUC18NPT质粒构建
用限制性内切酶BamH1处理PUC18质粒，将(1)中电泳切胶回收的Kana抗性基因启动 子+Kana抗性基因片段、Kana抗性基因终止子片段与回收所得的PUC18载体在重组酶的作用 下同源重组，获得PUC18NPT质粒。重组连接体系如下：回收获得的psbA2基因1μL，ApaI处 理后的P5ST1T2-downstream质粒2.5μL，重组酶2μL，10×Buffer4μL，ddH2O10μL，总 体系20μL，反应温度37，反应时间2h。
对质粒P-P5ST1T2-downstream和PUC18NPT进行BamH1单酶切，电泳后分别回收 P-P5ST1T2-downstream载体片段和PUC18NPT中的NPT片段。对载体片段去磷酸化后与NPT 片段在T4连接酶的作用下连接，得到质粒P-P5ST1T2NPT。连接体系如下：回收获得的NPT基 因片段0.5μL，内切酶处理后的P-P5ST1T2-downstream片段2.5μL，T4连接酶1μL，10 ×Buffer1μL，ddH2O 5μL，总体系10μL，反应温度为16℃，连接10h得到同源重组质粒 P-P5ST1T2NPT。
以PUC4K质粒为模板，以序列表中SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5为上下游引物，获取Kana 抗性基因启动子Promoter-kan，通过引物在5’端引入Nhe1酶切位点与同源臂，3’端引入 Hpa1酶切位点。获得的序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。扩增程序为：预变性，94℃，3min；变性，98℃，10s；退火，温度55℃，时间为15s；延伸，72℃，20s；循环，变性- 退火-延伸的循环30个；72℃，5min；4℃，10min；PCR反应结束后进行电泳切胶回收。用 限制性内切酶Nhe1处理质粒载体P-P5ST1T2NPT，将回收获得的Promoter-kan与回收的 P-P5ST1T2NPT在重组酶的作用下进行同源重组，获得穿梭质粒P5ST1T2KAN。重组连接体系如 下：回收获得的Promoter-kan基因1μL，Nhe1处理后的P-P5ST1T2NPT质粒2.5μL，重组酶 2μL，10×Buffer4μL，ddH2O10μL，总体系20μL，反应温度37，反应时间2h。
实施例3
PSCE15表达载体的构建
以序列表中SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14为上下游引物，以GenBank数据库中枯草芽 孢杆菌(AY044252，Z73234，X04689)的基因序列为模板，通过PCR扩增技术获得纤维素内切酶 CelI15基因片段(图1B所示)，通过引物在两端引入Hpa1酶切位点与同源臂，序列如序列表 中SEQ ID NO：15所示。扩增程序为：预变性，94℃，3min；变性，98℃，10s；退火，温度55℃，时间为15s；延伸，72℃，1min；循环，变性-退火-延伸的循环30个；72℃，5min； 4℃，10min；PCR反应结束后进行电泳切胶回收。用限制性内切酶Hpa1处理质粒载体P5ST1T2KAN，将回收获得的CelI15与回收的P5ST1T2KAN在重组酶的作用下进行同源重组，获得表达载体PSCE15。重组连接体系如下：回收获得的CelI15基因1μL，Nhe1处理后的P5ST1T2KAN质粒2.5μL，重组酶2μL，10×Buffer4μL，ddH2O10μL，总体系20μL，反应 温度37，反应时间2h。
实施例4
可生产纤维素酶的集胞藻PCC6803工程藻株PSCE15的获得与粗酶液制备
取对数培养期(OD730＝0.6)的集胞藻于室温，4500r/min离心10min，弃上清；加新鲜BG11 液体培养基洗涤一次后，加新鲜BG11液体培养基至终浓度OD730＝4.8，并立刻用来向藻中转化。 将收集的藻液分装到1.5mlEP管中(每管400ul)，每管加10ug PSCE15质粒，弱光条件下光 照温育6小时，期间摇晃一次。将混合物涂到含有卡那霉素(12μg·mL-1)的BG11平板培养基上， 约10天可见转化子。将长出的藻落转移至含有相同浓度Kana霉素的20mLBG11小瓶培养基中 培养，待长至对数期后转接。制得含表达载体PSCE15的集胞藻PCC6803。
将野生型集胞藻PCC6803和工程藻株PSCE15接种于50mlBG-11液体培养基中，调节OD730＝0.2，于30℃，1400Lux持续光照条件下振荡培养(180r/min)至对数生长期，取30mL处于 对数期的藻液，6000r/min离心10min，去上清，用20mL50mmol·L-1pH5.0的醋酸钠缓冲液重悬藻泥，6000r/min离心10min，去上清，收集藻细胞，收集的藻细胞经液氮研磨、超声破碎后制备成粗酶液。
实施例5
野生藻株与工程藻株PSCE15的纤维素内切酶活测定
本发明用羧甲基纤维素(CMC)糖化力法测定纤维素内切酶活力。以1ml粗酶液在40℃、 pH＝4.6条件下，每分钟水解羧甲基纤维素，产生1.0ug的葡萄糖，即为1个酶活单位，以u/g表示。
(1)标准曲线绘制
取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0mg/ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、 2.0ml，加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml，加DNS试剂1.5ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐 标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线，如图4所示。
(2)酶活力测定
取25ml具塞刻度试管2支，分别加入野生粗酶液、工程藻株粗酶液0.5ml，加1.5ml1％ CMC溶液，40℃水浴保温30min后立即加1.5mlDNS显色剂，沸水浴煮沸5min，取出立即冷却， 用水定容25ml，在540nm测吸光度A1。
空白样：先加1.5mlDNS试剂，后加0.5ml待测酶液，与1.5ml1％CMC溶液，于25ml试管 中，沸水浴煮沸5min，冷却后用水定容25ml，在540nm测吸光度A2。根据ΔA＝A1-A2，从标准曲线上查得葡萄糖含量P。
酶活力计算：酶活力(u/g)＝P*K*1000/0.5*30K为稀释倍数如图5所示。
由图5可以看出，集胞藻工程藻株PSCE15的酶活明显高于野生集胞藻藻株酶活，此结果 证明本发明中一种利用kana抗性基因启动子启动目的基因在集胞藻PCC6803中表达的穿梭质 粒可在集胞藻中表达目的基因，并且本发明以此质粒获得一株可产生纤维素酶的集胞藻藻株。
Claims (11)
1.本发明涉及一种利用Kana启动子分别启动Kana抗性基因和目的基因的穿梭质粒及其利用此质粒的构建的表达纤维素内切酶CelI15的集胞藻PCC 6803基因工程藻PSCE15。
2.根据权利要求1所述的穿梭质粒，其特征在于，可在大肠杆菌与集胞藻PCC6803中穿梭表达。利用集胞藻PCC6803的psbA2基因启始密码子ATG前510bp片段作为同源重组载体启动子兼做上游臂，以psbA2基因ORF片段为下游臂，可将Kana抗性基因启动子、目的基因及Kana抗性基因导入到集胞藻PCC6803并整合到基因组中，在Kana抗性基因与终止子之间***Kana抗性基因启动子和目的基因，利用Kana启动子启动Kana抗性基因和目的基因在集胞藻内的表达，得到可在大肠杆菌与集胞藻PCC6803中穿梭表达，利用Kana启动子启动Kana抗性基因和目的基因表达的穿梭质粒载体P5ST1T2KAN，实现外源基因在集胞藻中的表达。
3.根据权利要求1所述的一种利用Kana启动子启动Kana抗性基因和目的基因的穿梭质粒构建方法，其特征在于，步骤如下：
(1)PCR扩增野生集胞藻PCC6803的psbA2-up片段作为上游臂，PUC4K质粒的Kana抗性基因启动子Promoter-kan片段、Kana抗性基因启动子+Kana抗性基因片段、Kana抗性基因终止子片段。
(2)用限制性内切酶ApaI处理质粒载体P5ST1T2-downstream，将步骤(1)中获得的psbA2-up基因片段与回收所得的P5ST1T2-downstream在重组酶的作用下同源重组。获得载体P-P5ST1T2-downstream。
(3)用限制性内切酶BamH1处理PUC18质粒，将步骤(1)中的Kana抗性基因启动子+Kana抗性基因片段、Kana抗性基因终止子片段与回收所得的PUC18载体在重组酶的作用下同源重组，获得PUC18NPT质粒。
(4)对步骤(2)获得的质粒P-P5ST1T2-downstream和步骤(3)获得的质粒PUC18NPT进行BamH1单酶切，电泳后分别回收P-P5ST1T2-downstream载体片段和PUC18NPT中的NPT片段。对载体片段去磷酸化后与NPT片段连接，得到质粒P-P5ST1T2NPT。
(5)用限制性内切酶Nhe1处理P-P5ST1T2NPT，将步骤(1)中获得的Promoter-kan片段与回收所得的P-P5ST1T2NPT在重组酶的作用下同源重组。得到穿梭质粒P5ST1T2KAN。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增集胞藻PCC6803的psbA2-up片段，在其两端添加ApaI酶切位点，序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。所用引物为：
PsbA2-up-f：GGCGAATTGGGTACCGGGCCCGCTTTAGCGTTCCAGTGGATATTTGC
PsbA2-up-r：GTCGACCTCGAGGGGGGGCCCTTGGTTATAATTCCTTATGTATTTGTCGATGTTCAG
扩增程序如下：预变性，94℃，3min；变性，98℃，10s；退火，温度55℃，时间为15s；延伸，72℃，40s；循环，变性-退火-延伸的循环30个；72℃，5min；4℃，10min。
5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增Kana抗性基因启动子Promoter-kan片段，在其5’端引入Nhe1酶切位点，3’端引入Hpa1酶切位点，序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。所用引物为：
P-k-f：GATGAGTTTTTCTAAGCTAGCCAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC
P-k-r：ATTAACCAATTCTGAGCTAGCGTTAACAACACCCCTTGTATTACTGTTTATG
扩增程序如下：预变性，94℃，3min；变性，98℃，10s；退火，温度55℃，时间为15s；延伸，72℃，20s；循环，变性-退火-延伸的循环30个；72℃，5min；4℃，10min。
6.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增Kana抗性基因启动子+Kana抗性基因片段，在其5’端引入BamH1酶切位点，3’端引入Nhe1酶切位点，序列如序列表中SEQ ID NO：9所示。所用引物为：
Pro-kan-f：CAGGTCGACTCTAGAGGATCCAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG
Pro-kan-r：CCAATTCTGAGGCTAGCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACT
扩增程序如下：预变性，94℃，3min；变性，98℃，10s；退火，温度55℃，时间为15s；延伸，72℃，1min；循环，变性-退火-延伸的循环30个；72℃，5min；4℃，10min。
7.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增Kana抗性基因终止子片段，在其5’端引入Nhe1酶切位点，3’端引入BamH1酶切位点，序列如序列表中SEQID NO：12所示。所用引物为：
kan-f：GAGTTTTTCTAAGCTAGCTCAGAATTGGTTAATTGGT
kan-r：GAGCTCGGTACCCGGGGATCCAAAACGACGGCCAGTGAATT
扩增程序如下：预变性，94℃，3min；变性，98℃，10s；退火，温度55℃，时间为15s；延伸，72℃，40s；循环，变性-退火-延伸的循环30个；72℃，5min；4℃，10min。
8.根据权利要求1-5所述的穿梭质粒在集胞藻中表达外源基因中的应用。
9.如权利要求1所述的表达纤维素内切酶CelI15的集胞藻基因工程藻株PSCE15，其特征在于，构建步骤如下：
PCR扩增GenBank数据库中枯草芽孢杆菌(AY044252，Z73234，X04689)的基因序列的纤维素内切酶CelI15基因片段，用限制性内切酶Hpa1处理权利要求1-5所述的P5ST1T2KAN，将获得的CelI15片段与回收所得的P5ST1T2KAN在重组酶的作用下同源重组，得到重组表达质粒PSCE15，通过自然转化法将重组表达载体质粒PSCE15转化至集胞藻PCC6803中，得到集胞藻工程藻株PSCE15。CelI15基因序列如序列表中SEQ ID NO：15所示。所用引物为：
CelI15-f：AATACAAGGGGTGTTGTTAACATGAAGCGCAGCATTAGCATTTTCATCA
CelI15-r：CAATTCTGAGCTAGCGTTAACTTAATGATGATGATGATGATGCGAGGC
扩增程序如下：预变性，94℃，3min；变性，98℃，10s；退火，温度55℃，时间为15s；延伸，72℃，1min；循环，变性-退火-延伸的循环30个；72℃，5min；4℃，10min。
10.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，载体为P5ST1T2-downstream(山东农科院惠赠)。
11.如权利要求1所述的质粒，其特征在于，用于构建生产纤维素酶CelI15的集胞藻PCC6803工程藻株。
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