CN112795526B

CN112795526B - 合成α-熊果苷的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN112795526B
Application number: CN202110156063.6A
Authority: CN
Inventors: 刘龙; 陈坚; 吕雪芹; 堵国成; 李江华; 刘延峰; 周祺
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2041-02-04
Also published as: CN112795526A

Abstract

本发明涉及一种合成α‑熊果苷的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，本发明提供了能稳定且高效生产α‑熊果苷的基因工程菌株的构建方法，通过引入蔗糖磷酸化酶的优化的RBS^opt序列，并将蔗糖磷酸化酶的表达框整合至基因组上，显著提高了α‑熊果苷在胞外的积累量，最高浓度可达119.44g/L，底物HQ的摩尔转化率为96.56％，为实现α‑熊果苷的工业化生产奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌的构建方法简便易行，菌株构建完成后生产性能稳定，具有很好的应用前景。

Description

合成α-熊果苷的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种合成α-熊果苷的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

α-熊果苷(α-arbutin)的化学名为4-羟苯基-α-D吡喃葡萄糖苷，是目前国际上公认的安全有效的美白物质，由葡萄糖与氢醌通过α-糖苷键连接而成。由此可以看出，α-熊果苷的分子结构由两部分功能团组成：亲水性的葡萄糖残基和能够抑制黑色素合成酶活性的酚基。α-熊果苷与其异构体β-熊果苷相比，具有更优越的美白效果和更高的人体安全性；此外，α-熊果苷的稳定性更强，可以较为方便地添加至多种类型的美容用品中。因此，α-熊果苷具有广阔的应用前景和市场，极具工业化价值。

α-熊果苷的合成可以通过化学合成法、植物提取法和生物转化法这三类方法实现，其中，生物转化法又可细分为酶催化法和全细胞催化法两种。生物转化法与前两种方法相比，虽然具有反应温和、操作简便、绿色环保等突出的优势，但普遍面临着转化率低、产量不稳定等问题。目前，应用于美容用品中的α-熊果苷主要是由日本的江琦格力高公司通过酶转化的方法获得；而国内对于α-熊果苷制备的研究较少，面对巨大的市场需求，亟待实现α-熊果苷的工业化生产。

目前被研究可用于催化合成α-熊果苷的酶主要有α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖异构酶、淀粉蔗糖酶、环糊精葡萄糖基转移酶。这些酶利用不同的底物进行转糖基化反应生产α-熊果苷，但不同酶的产物转化能力各不相同。其中，蔗糖磷酸化酶(EC2.4.1.7)发生转糖基化作用时，对于糖基供体底物有着严格的特异性要求：仅能以蔗糖、葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-1-氟化物作为底物；另一方面，蔗糖磷酸化酶对受体底物的特异性要求很低：糖、糖醇、酚类物质、羟基化合物及某些羧酸化合物均可作为受体底物。

在过去的研究中，为了大量获得蔗糖磷酸化酶，研究人员往往采用高拷贝质粒游离表达目的基因。但由于高拷贝质粒在细胞内容易丢失，导致细胞的生产性能不稳定，难以实现工业化应用。而后，有研究尝试将蔗糖磷酸化酶整合表达，以稳定细胞的生产性能。但α-熊果苷的产量及底物利用率仍有较大的提升空间。

发明内容

为了稳定且高效地生产α-熊果苷，我们对蔗糖磷酸化酶基因smut的RBS序列进行了优化，提高了枯草芽孢杆菌生产α-熊果苷的能力，具有重要的经济价值和工业化意义。

本发明的第一个目的是提供一种合成α-熊果苷的枯草芽孢杆菌，其是在枯草芽孢杆菌宿主中整合表达蔗糖磷酸化酶，并采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的RBS调控蔗糖磷酸化酶基因表达。

进一步地，所述的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的整合表达是在枯草芽孢杆菌宿主的yqhB位点、yitR位点和ymzB位点中的一个或多个位点整合包含蔗糖磷酸化酶基因的表达框。

进一步地，所述的枯草芽孢杆菌宿主为枯草芽孢杆菌WB800ΔnprB-ΔaprE-Δepr-Δbpr-ΔnprE-Δmpr-Δvpr-ΔwprA。是在WB800基础上敲除中性蛋白酶nprE、碱性蛋白酶aprE、胞外蛋白酶epr、金属蛋白酶mpr、杆菌肽酶bpr、中性蛋白酶nprB、细胞壁结合蛋白wprA及vpr基因。

本发明的第二个目的是提供所述的枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：

S1、构建表达框：将蔗糖磷酸化酶基因连接到表达载体上，并***SEQ ID NO.1所述的RBS序列；

S2、整合表达：将S1步骤构建的表达框整合至枯草芽孢杆菌宿主中，消除抗性得到所述的枯草芽孢杆菌。

进一步地，所述的整合是将所述的表达框整合至枯草芽孢杆菌宿主的yqhB位点、yitR位点和ymzB位点中的一个或多个位点。

本发明的第三个目的是提供所述的枯草芽孢杆菌在全细胞催化合成α-熊果苷中的应用。

进一步地，所述的应用是将所述的枯草芽孢杆菌作为催化剂，在25-35℃催化蔗糖和对苯二酚反应生产α-熊果苷。

进一步地，催化反应的反应液包括OD₆₀₀＝30-60的枯草芽孢杆菌细胞，300-450g/L蔗糖，50-70g/L对苯二酚。

进一步地，所述的枯草芽孢杆菌细胞是通过将所述的枯草芽孢杆菌接种至TB培养基中35-38℃培养10-15h得到。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明提供了能稳定且高效生产α-熊果苷的基因工程菌株的构建方法，通过引入蔗糖磷酸化酶的优化的RBS^opt序列，并将蔗糖磷酸化酶的表达框整合至基因组上，显著提高了α-熊果苷在胞外的积累量，最高浓度可达119.44g/L，底物HQ的摩尔转化率为96.56％，为实现α-熊果苷的工业化生产奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌的构建方法简便易行，菌株构建完成后生产性能稳定，具有很好的应用前景。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细说明如后。

附图说明

图1为yqhB位点的整合表达框；

图2为温敏型质粒pDG-Cre图谱；

图3为整合不同拷贝数菌株转化合成α-熊果苷的产量图。

具体实施方式

涉及的检测方法：

α-熊果苷的检测方法：

仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪，检测器：UV，色谱柱：Agilent Carbohydratecolumn(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：10mmol/L稀磷酸：甲醇＝8:2，流速：0.6ml/min，柱温：35℃，进样量：10μL

种子活化培养基液体(LB)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，装液量20ml每250ml三角瓶。灭菌条件：121℃，20min。

种子活化培养基固体(LB固体)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，琼脂粉15.0-20.0。灭菌条件：121℃，20min。

发酵培养基(TB)(g/L)：蛋白胨12.0，酵母粉24.0，甘油4ml，KH₂PO₄ 2.31,K₂HPO₄12.54。灭菌条件：115℃，20min。

PB缓冲液(20mM，pH 7.0)：分别配制0.2mol/L的NaHPO₄和0.2mol/L的Na₂HPO₄，从中各取39ml和61ml，加入蒸馏水定容至1L，即获得20mmol/L，pH 7.0的PB缓冲液。

实施例1：变异链球菌来源的蔗糖磷酸化酶基因gtfA的合成

从GenBank数据库中获取gtfA原始序列(NCBI-GeneID:60233262)，交由天霖生物技术有限公司进行枯草芽孢杆菌密码子优化后合成：将基因克隆至载体pUC57-Amp上，制备成mini-scale重组质粒pUC-Smut和含有该重组质粒的穿刺菌。将mini-scale重组质粒pUC-Smut用超纯水溶解后转入E.coli JM109感受态中；将穿刺菌活化培养后加入等体积的50％甘油，冻存于-80℃冰箱长期保存。采用上海生工公司的质粒抽提试剂盒对活化菌液进行质粒pUC-Smut的提取。

实施例2：目的基因smut最优RBS^opt序列的***

***SEQ ID NO.1所述的RBS^opt序列。由于RBS^opt序列较短，我们通过将短序列添加在聚合酶链式反应(PCR)的上下游引物5’端的方法引入这段序列：加粗加下划线部分为***的RBS^opt序列。

(1)片段扩增：

启动子P43上游引物P43.FOR(SEQ ID NO.3):

5’——GATCTTCTCAAAAAATACTACCTGTCC——3’

启动子P43下游引物P43.REV(SEQ ID NO.4):

5’——AAAAAAAACCTCCTTTTGGTATCTAGCAGCTACATCGTCTATAATGGTACCGCTATCACTTTATATTTTAC——3’

smut基因上游引物smut.FOR(SEQ ID NO.5)：

5’——ACGATGTAGCTGCTAGATACCAAAAGGAGGTTTTTTTTATGCCAATCATTAACAAGACGATG——3’

smut基因下游引物smut.REV(SEQ ID NO.6)：

5’——TTATTCGAAAGATATGGTCTGATCATTCTC——3’

使用引物P43.FOR和P43.REV，以质粒pP43-NMK为模板，PCR条件为：98℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火15s；72℃延伸15s，反应34个循环；最后72℃延伸5min，PCR产物用DNA纯化试剂盒回收。

使用引物smut.FOR和smut.REV，以质粒pUC-Smut为模板，PCR条件为：98℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火15s；72℃延伸25s，反应34个循环；最后72℃延伸5min，PCR产物用DNA纯化试剂盒回收。

(2)融合过程：

a.第一轮PCR：加入等摩尔量的启动子P43片段和smut片段，使DNA总量大于1000ng，两个片段总体积为5μL，加入5μL Takara PrimerSTAR Max DNA Polymerase，PCR条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸35s，反应10个循环，最后72℃延伸5min。

b.取2μL第一轮PCR产物为模板，使用引物P43.FOR和Smut.REV进行全长扩增，PCR条件为：98℃预变性2min,98℃变性10s,55℃退火15s,72℃延伸35s,反应34个循环,最后72℃延伸5min，PCR产物用DNA纯化试剂盒回收，即得到引入RBS^opt序列的P43-RBS^opt-smut表达框。

实施例3：枯草芽孢杆菌整合表达smut基因

整合表达框的构建：

为了将smut基因整合到枯草芽孢杆菌基因组上，使用cre/lox***进行同源重组，该***由两个同源区域(***位点上下游的各1,000bp片段)、带有lox71和lox66位点的抗性基因和目标片段这4部分组成。

(1)表达框的整合方法

***位点为yqhB，yqhB位点的整合表达框见图1。所采用的引物为：

注：下划线表示同源臂序列

1)分别扩增片段

使用引物yqhB-rh-1F和yqhB-rh-1R，yqhB-rh-4F和yqhB-rh-4R，以枯草芽孢杆菌基因组作为模板，分别扩增***位点的上下游同源区yqhB-L和yqhB-R。PCR条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s；55℃退火15s；72℃延伸15s，反应34个循环；最后72℃延伸5min，PCR产物用DNA纯化试剂盒回收。

使用引物yqhB-rh-2F和yqhB-rh-2R，以实验室保存的p7S6质粒作为模板，扩增带有lox71和lox66位点的壮观霉素抗性基因片段yqhB-7S6。PCR条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s；55℃退火15s；72℃延伸15s，反应34个循环；最后72℃延伸5min，PCR产物用DNA纯化试剂盒回收。

使用引物yqhB-rh-3F和yqhB-rh-3R，以实施例2中获得的P43-RBS^opt-smut表达框为模板，扩增目标基因片段yqhB-smut。PCR条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s；55℃退火15s；72℃延伸35s，反应34个循环；最后72℃延伸5min，PCR产物用DNA纯化试剂盒回收。

2)片段融合

将上述四个片段yqhB-L,yqhB-R,yqhB-7S6和yqhB-smut按照等摩尔量加入，控制DNA总量大于1000ng，片段总体积为5μL；再加入5μL Takara PrimerSTAR Max DNAPolymerase，PCR条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火35s，72℃延伸15s，反应10个循环，最后72℃延伸5min。得到融合完成的片段。

取2μL融合完成的片段作为模板，使用引物yqhB-rh-zong-F和yqhB-rh-zong-R进行全长扩增。PCR条件为：98℃预变性2min；98℃变性10s；55℃退火15s；72℃延伸90s，反应34个循环；最后72℃延伸5min，PCR产物用DNA纯化试剂盒回收。

3)表达框整合及抗性消除

将线性片段转入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，涂布于含有壮观霉素抗性的LB平板待其长出单菌落，然后挑取单菌落进行菌落PCR以验证整合是否成功。

将实验室保藏的温敏型质粒pDG-Cre转入已成功整合的枯草芽孢杆菌感受态细胞中，温敏型质粒pDG-Cre图谱如图2。加入IPTG诱导表达Cre重组酶，用以消除壮观霉素抗性基因。

将已消除抗性基因的枯草芽孢杆菌菌株接种于LB液体培养基中，40℃培养消除温敏型质粒pDG-Cre。

如此就获得了在yqhB位点整合smut表达框的无抗性枯草芽孢杆菌BS800-1S。

目标基因在yitR和ymzB位点的整合方法同上述步骤，分别使用下表所列引物融合得到整合片段。

注：下划线表示同源臂序列

按照上述方法完成smut基因在yitR和ymzB位点的整合。分别获得菌株BS800-2S和菌株BS800-3S。

实施例4：枯草芽孢杆菌全细胞催化合成α-熊果苷

将实施例3中构建好的枯草芽孢杆菌BS800-1S、BS800-2S、BS800-3S接种于含有20ml的LB液体培养基的250ml挡板摇瓶中，37℃，220rpm振荡培养10h后，即得种子液。种子液以1％(v/v)比例转接于含有30ml TB培养基的250ml挡板摇瓶中，37℃，220rpm振荡培养11h，即得发酵液。

将发酵液低温离心(5,000rpm，10min，4℃)以收集细胞。用20mmol/L，pH7.0的PB缓冲液漂洗两次。

全细胞催化体系中加入：对苯二酚50g/L，蔗糖310.9g/L，细胞添加量为OD₆₀₀＝40，催化溶剂为20mmol/L，pH 7.0的PB缓冲液。催化反应在250ml挡板摇瓶中进行，30℃，220rpm振荡培养34h。催化结束后，低温离心(4℃，12,000rpm,10min)取上清液进行高效液相色谱分析以测定α-熊果苷的产量。结果如图3所示，在无需添加表面活性剂的情况下，α-熊果苷在胞外的积累量，最高浓度可达119.44g/L，底物HQ的摩尔转化率为96.56％。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江南大学

<120> 合成α-熊果苷的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

acgatgtagc tgctagatac caaaaggagg tttttttt 38

<210> 2

<211> 481

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 2

Met Pro Ile Ile Asn Lys Thr Met Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Leu

1 5 10 15

Gly Lys Asn Leu Lys Glu Leu Asn Glu Asn Ile Glu Asn Tyr Phe Gly

20 25 30

Asp Ala Val Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly

35 40 45

Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ile Asp Tyr His Glu Val Asp Ser Ala Phe

50 55 60

Gly Asp Trp Asp Asp Val Lys Cys Leu Gly Glu Lys Tyr Tyr Leu Met

65 70 75 80

Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Arg Gln Ser Lys Tyr Tyr Lys

85 90 95

Asp Tyr Gln Glu Lys His Glu Ala Ser Ala Tyr Lys Asp Leu Phe Leu

100 105 110

Asn Trp Asp Lys Phe Trp Pro Lys Asn Arg Pro Thr Gln Glu Asp Val

115 120 125

Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Arg Ala Pro Lys Gln Glu Ile Gln

130 135 140

Phe Ala Asp Gly Ser Val Glu His Leu Trp Asn Thr Phe Gly Glu Glu

145 150 155 160

Gln Ile Asp Leu Asp Val Thr Lys Glu Val Thr Met Asp Phe Ile Arg

165 170 175

Ser Thr Ile Glu Asn Leu Ala Ala Asn Gly Cys Asp Leu Ile Arg Leu

180 185 190

Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Val Lys Lys Leu Asp Thr Asn Asp Phe Phe

195 200 205

Val Glu Pro Glu Ile Trp Thr Leu Leu Asp Lys Val Arg Asp Ile Ala

210 215 220

Ala Val Ser Gly Ala Glu Ile Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr Thr

225 230 235 240

Ile Gln Phe Lys Ile Ala Asp His Asp Tyr Tyr Val Tyr Asp Phe Ala

245 250 255

Leu Pro Met Val Thr Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Ser Lys Val Asp Arg

260 265 270

Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe Thr Thr Leu

275 280 285

Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Val Lys Asp Ile Leu Thr

290 295 300

Asp Glu Glu Ile Thr Tyr Thr Ser Asn Glu Leu Tyr Lys Val Gly Ala

305 310 315 320

Asn Val Asn Arg Lys Tyr Ser Thr Ala Glu Tyr Asn Asn Leu Asp Ile

325 330 335

Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asp Asp Asp Gln

340 345 350

Lys Tyr Phe Leu Ala Arg Leu Ile Gln Ala Phe Ala Pro Gly Ile Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Tyr Val Gly Phe Leu Ala Gly Lys Asn Asp Leu Glu Leu

370 375 380

Leu Glu Ser Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser

385 390 395 400

Ser Glu Glu Ile Ala Lys Glu Val Lys Arg Pro Val Val Lys Ala Leu

405 410 415

Leu Asn Leu Phe Thr Tyr Arg Asn Gln Ser Ala Ala Phe Asp Leu Asp

420 425 430

Gly Arg Ile Glu Val Glu Thr Pro Asn Glu Ala Thr Ile Val Ile Glu

435 440 445

Arg Gln Asn Lys Asp Gly Ser His Ile Ala Lys Ala Glu Ile Asn Leu

450 455 460

Gln Asp Met Thr Tyr Arg Val Thr Glu Asn Asp Gln Thr Ile Ser Phe

465 470 475 480

Glu

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

gatcttctca aaaaatacta cctgtcc 27

<210> 4

<211> 71

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

aaaaaaaacc tccttttggt atctagcagc tacatcgtct ataatggtac cgctatcact 60

ttatatttta c 71

<210> 5

<211> 62

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

acgatgtagc tgctagatac caaaaggagg ttttttttat gccaatcatt aacaagacga 60

tg 62

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

ttattcgaaa gatatggtct gatcattctc 30

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 7

gatcaatttt ggatcgccgc 20

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 8

gtaccgagct cgaattccat cctatagagt ccgccttttt c 41

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 9

gcggactcta taggatggaa ttcgagctcg gtaccc 36

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 10

gtattttttg agaagatcgt cgacgattct accgttcg 38

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 11

ggtagaatcg tcgacgatct tctcaaaaaa tactacctgt cc 42

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 12

gaaaaagcgg ggcacgttat tcgaaagata tggtctgatc attctc 46

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 13

gaccatatct ttcgaataac gtgccccgct ttttc 35

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 14

cgtctctcgt atgaaggctc 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 15

cgattgaaaa ttctacggca acg 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 16

ccgcaatttc agctgtttcc 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 17

gctgacgtca tccttaaaaa cc 22

<210> 18

<211> 55

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 18

taccgagctc gaattcctac tctactaatt ttttattgac ataaataata acccc 55

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 19

aaaattagta gagtaggaat tcgagctcgg taccc 35

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 20

gtattttttg agaagatcgt cgacgattct accgttcg 38

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 21

ggtagaatcg tcgacgatct tctcaaaaaa tactacctgt cc 42

<210> 22

<211> 46

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 22

ctctgccctt ctttttttat tcgaaagata tggtctgatc attctc 46

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 23

ccatatcttt cgaataaaaa aagaagggca gagcg 35

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 24

ccattgtttg ccgacatgc 19

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 25

tggctatttc agagggagcg 20

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 26

aatcacggcc aaatgtcttg c 21

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 27

gatggacaaa cttggacaac cc 22

<210> 28

<211> 33

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 28

taccgagctc gaattcggct gtcagctgtg ctg 33

<210> 29

<211> 37

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 29

cagcacagct gacagccgaa ttcgagctcg gtacccg 37

<210> 30

<211> 38

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 30

gtattttttg agaagatcgt cgacgattct accgttcg 38

<210> 31

<211> 42

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 31

ggtagaatcg tcgacgatct tctcaaaaaa tactacctgt cc 42

<210> 32

<211> 46

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 32

ctcaaaggcg ctacgcttat tcgaaagata tggtctgatc attctc 46

<210> 33

<211> 34

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 33

ccatatcttt cgaataagcg tagcgccttt gagc 34

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 34

ggcagatccg atgcctataa aaatc 25

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 35

gagtttgcga ttggacaaac ag 22

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 36

tgccatcata acgacaggtg 20

Claims

1.一种合成α-熊果苷的枯草芽孢杆菌，其特征在于，其是在枯草芽孢杆菌宿主中整合表达蔗糖磷酸化酶，并采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的RBS调控蔗糖磷酸化酶基因表达；

所述的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的整合表达是在枯草芽孢杆菌宿主的yqhB位点、yitR位点和ymzB位点中的一个或多个位点整合包含蔗糖磷酸化酶基因的表达框；

所述的枯草芽孢杆菌宿主为枯草芽孢杆菌WB800ΔnprB-ΔaprE-Δepr-Δbpr-ΔnprE-Δmpr-Δvpr-ΔwprA。

2.一种权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、构建表达框：将蔗糖磷酸化酶基因连接到表达载体上，并***SEQ ID NO. 1所述的RBS序列；

S2、整合表达：将S1步骤构建的表达框整合至枯草芽孢杆菌宿主中，消除抗性得到所述的枯草芽孢杆菌；

所述的整合是将所述的表达框整合至枯草芽孢杆菌宿主的yqhB位点、yitR位点和ymzB位点中的一个或多个位点。

3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在全细胞催化合成α-熊果苷中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的应用是将所述的枯草芽孢杆菌作为催化剂，在25-35℃催化蔗糖和对苯二酚反应生产α-熊果苷。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，催化反应的反应液包括OD₆₀₀=30-60的枯草芽孢杆菌细胞，300-450 g/L蔗糖，50-70 g/L 对苯二酚。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌细胞是通过将所述的枯草芽孢杆菌接种至TB培养基中35-38℃培养10-15 h得到。