CN113278553B - 一种添加非固氮菌的增强型高效固氮复合菌系及其应用 - Google Patents

一种添加非固氮菌的增强型高效固氮复合菌系及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种添加非固氮菌的增强型高效固氮复合菌系及其应用，属于农业微生物技术领域。本发明公开一种增强型高效固氮菌，包括克雷伯氏菌MNAZ1050、柠檬酸杆菌MNAZ1397和假单胞菌MNAZ228中至少一种；还公开一种增强型高效固氮复合菌系，包括固氮菌和非固氮菌；其中，固氮菌包括上述三种菌中的至少一种；所述非固氮菌包括不动杆菌ACZLY512和克吕沃尔氏菌AZ981中至少一种；该固氮复合菌系中的固氮菌单独使用均具有较好的固氮作用，而将固氮菌和非固氮菌配合使用构建成固氮复合菌系比单独使用固氮菌时固氮作用更显著，可以在明显的减少氮肥施用条件下促进作物生长，对于提高作物产量具有重要意义。

Description

一种添加非固氮菌的增强型高效固氮复合菌系及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，涉及一种添加非固氮菌的增强型高效固氮复合菌系及其应用。
背景技术
氮肥是作物高产稳产的关键因素，对作物增产的贡献超过50％。然而，当全球开始大规模施用氮肥后，尤其是一些国家和地区过量使用氮肥后，导致了一系列的生态环境问题，例如土壤酸化、温室气体排放、水体富营养化、农产品硝酸盐含量超标等，严重阻碍了全球农业的可持续发展。在此背景下，生物固氮成为减少农业氮肥施用的重要途径之一。
生物固氮是指固氮微生物将空气中的分子态氮转化为氨的过程。据不完全统计，每年全球固氮微生物固氮总量超过5000万吨，对地球生物圈氮素循环具有重要意义。目前，已发现的固氮微生物均属于细菌，从已获得全基因组的植物内生固氮菌分类来看，主要集中分布在α-变形菌纲的根瘤菌目和红螺菌目，β-变形菌纲的伯克氏菌目，γ-变形菌纲的肠杆菌目和厚壁菌门的芽孢杆菌目。植物内生固氮菌定植在植物内部，在营养充足和微环境适宜的生态位形成高效的固氮体系，为宿主作物提供氮素营养的同时，还通过分泌植物激素等方式促进宿主作物生长。
当前，国内外学者对植物内生固氮菌研究主要集中在单一固氮菌株的筛选和应用。例如，一株提高作物抗病、抗逆的水稻内生固氮菌及其用途(申请号：CN201110197581.9)、一株甘蔗内生伯克霍尔德氏菌CZ08152及其应用(申请号：CN201810098752.4)、一株水稻内生促生根瘤菌及其用途(申请号：CN201810390383.6)、一株产ACC脱氨酶的小麦内生固氮菌及其用途(申请号：CN201110197638.5)等。上述发明均没有考虑固氮菌之间以及固氮菌与非固氮菌之间的协同增效作用。
如上所述，不同专利中提及的固氮菌其固氮能力或其他功能表现效果不尽相同，并且针对不同种植物可能表现出不同功能或者同一种植物同一功能也表现出差异，因此开发具有更好固氮能力或者新功能的固氮新菌株对作物生产具有重要意义。但是，在自然生态***中，微生物并不是以单一菌株形式独立存在，而是与其他微生物和栖息环境组成一个复杂的生物网络，通过相互作用和功能互补来维持生态***的正常功能。超越单一微生物、单一环境要素、单一微观过程的传统理念，从微生物组学的角度定向挖掘固氮微生物功能，通过固氮菌分离培养和生物信息学分析，进行人工模拟和体系重构，构建高效固氮复合菌系。相比单一菌株，高效固氮复合菌系在实际应用中将取得更好的效果。因此，针对不同的需求开发更强功能的高效固氮复合菌系对于解决现有技术存在的技术问题具有现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种添加非固氮菌的增强型高效固氮复合菌系及其应用，该固氮复合菌系中的固氮菌单独使用均具有较好的固氮作用，而将固氮菌和非固氮菌配合使用构建成固氮复合菌系比单独使用固氮菌时固氮作用更显著，可以在明显的减少氮肥施用条件下促进作物生长。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种增强型高效固氮菌，包括克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)MNAZ1050、柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)MNAZ1397和假单胞菌(Pseudomonas sp.)MNAZ228 中至少一种；
其中，所述克雷伯氏菌MNAZ1050、柠檬酸杆菌MNAZ1397和假单胞菌MNAZ228 保藏编号分别为CGMCC No.22270、CGMCC No.22267和CGMCC No.22266，保藏时间均为2021年5月6日，保藏单位均为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还提供一种增强型高效固氮复合菌系，包括固氮菌和非固氮菌；其中，固氮菌包括克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)MNAZ1050、柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.) MNAZ1397和假单胞菌(Pseudomonas sp.)MNAZ228中至少一种；所述非固氮菌包括不动杆菌(Acinetobacter sp.)ACZLY512和克吕沃尔氏菌(Kluyvera sp.)AZ981中至少一种；
所述克雷伯氏菌MNAZ1050、柠檬酸杆菌MNAZ1397和假单胞菌MNAZ228保藏编号分别为CGMCC No.22270、CGMCC No.22267和CGMCC No.22266，保藏时间均为2021年5月6日，保藏单位均为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
所述不动杆菌ACZLY512和克吕沃尔氏菌AZ981保藏编号分别为CGMCC No.22268和CGMCC No.22269，保藏时间均为2021年5月6日，保藏单位均为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还提供一种菌剂，所述菌剂的活性成分为所述的固氮菌。
优选的是，当菌剂包含两种及以上菌种时，所述菌剂按如下任一项比例构建：
所述克雷伯氏菌MNAZ1050：所述柠檬酸杆菌MNAZ1397的含菌量比例为(1-7)： (1-4)；
所述克雷伯氏菌MNAZ1050：所述假单胞菌MNAZ228的含菌量比例为(1-7)： (1-2)；
所述柠檬酸杆菌MNAZ1397：所述假单胞菌MNAZ228的含菌量比例为(1-4)： (1-2)；
所述克雷伯氏菌MNAZ1050：所述柠檬酸杆菌MNAZ1397：所述假单胞菌 MNAZ228含菌量比例为(1-7)：(1-4)：(1-2)。
本发明还提供一种菌剂，所述菌剂的活性成分为所述的固氮复合菌系，所述固氮复合菌系中的固氮菌和非固氮菌的含菌量比例为(1-2)：(1-2)。
优选的是，当所述菌剂中的固氮菌包含两种及以上菌种时，所述固氮菌按如下任一项比例构建：
所述克雷伯氏菌MNAZ1050：所述柠檬酸杆菌MNAZ1397的含菌量比例为(1-7)： (1-4)；
所述克雷伯氏菌MNAZ1050：所述假单胞菌MNAZ228的含菌量比例为(1-7)： (1-2)；
所述柠檬酸杆菌MNAZ1397：所述假单胞菌MNAZ228的含菌量比例为(1-4)： (1-2)；
所述雷伯氏菌MNAZ1050：所述柠檬酸杆菌MNAZ1397：所述假单胞菌MNAZ228 含菌量比例为(1-7)：(1-4)：(1-2)；
当所述菌剂中的非固氮菌由不动杆菌ACZLY512和克吕沃尔氏菌AZ981组成时，所述非固氮菌是由不动杆菌ACZLY512和克吕沃尔氏菌AZ981按照含菌量比例(1-2)： (1-2)混合而成。
本发明还提供一种所述的增强型高效固氮菌或所述的增强型高效固氮复合菌系在制备菌剂中的应用，应用于制备如下任一项所示菌剂中：
(1)提高粮食作物和农艺作物的固氮作用的菌剂；
(2)提高粮食作物和农艺作物地上部分生物量的菌剂；
(3)提高粮食作物和农艺作物根系生物量的菌剂。
本发明还提供一种所述的增强型高效固氮菌或所述的增强型高效固氮复合菌系或所述的菌剂的使用方法，所述固氮菌、固氮复合菌系或所述菌剂采用灌根方式处理粮食作物或园艺作物根系。
本发明公开了以下技术效果：
1、本发明利用现代生物信息学分析，结合固氮菌的分离培养，将玉米内生物固氮菌群落组成进行简化和重组、构建了一个增强型高效固氮复合菌系。该固氮复合菌系在有氧或微氧条件下，均保持高效的固氮活力；同时，高效固氮复合菌系中所有菌株筛选自5个玉米品种，与玉米之间不存在相互排斥效应。因此，本发明提出的增强型高效固氮复合菌系具有极强的环境适应性。
2、本发明提出的增强型高效固氮复合菌系在氮肥减施条件下，对玉米生长具有良好的促进效应，而且玉米根系生长得到明显改善，表明该增强型高效固氮复合菌系不仅可以生物固氮，为玉米提供氮素营养，而且还有根系促生作用，展现了该固氮复合菌系在粮食作物和园艺作物生产等领域良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为从5个玉米品种获得的969株细菌在属水平上的分类学信息以及网络分析结果；
图2为微氧条件下增强型高效固氮复合菌系固氮酶活性；其中，参比菌株为圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC10006，不同字母表示处理之间存在显著差异 (p<0.05)；
图3为有氧条件下增强型高效固氮复合菌系固氮酶活性；其中，参比菌株为圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC10006，不同字母表示处理之间存在显著差异 (p<0.05)；
图4为施用增强型高效固氮复合菌系的玉米长势图。
具体实施方式
现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1增强型高效固氮复合菌系的构建以及固氮效应验证
1、复合菌系中菌株筛选工作
1)在中国农业科学院农业资源与农业区划研究所试验基地采集垦沃6号、良玉66、浚单20、郑单958、掖单13号5个玉米品种茎部输导组织汁液。选择玉米基部以上的第3节茎中央位置，用修枝剪将玉米茎截断，由于玉米根压作用，玉米茎部输导组织汁液将从横切面处流出，利用0.5g无菌脱脂棉球吸取该汁液，将脱脂棉球装入50mL 无菌离心管，放置于冰面带回实验室。
2)在超净工作台中，向装有脱脂棉球的离心管中加入2mL 0.9％无菌生理盐水，摇床28℃，160rpm培养1小时，充分混匀。取培养后的液体稀释10倍，取稀释液100 μL涂布于R2A固体培养基，在28℃培养2～4d。当培养基长出菌落后挑菌，用划线法对菌株进行3次纯化，-70℃保存于30％甘油。
R2A固体培养基(g L-1)，包括以下成分：酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15.0g。
3)从5个玉米品种茎部输导组织汁液中共获得1574个纯菌，通过16S rDNA序列分析，其中16S rDNA不同的菌株共有969株。
2、生物信息学分析及复合菌系构建
1)基于16S rDNA序列分析，对这969株菌在属水平上进行分类学分析。这969 株细菌分布在44属，其中80％的细菌分布在前5个属，分别为泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas) 和克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)(见图1)。
2)上述969株细菌的16S rDNA在种水平上可划分为152个种。以这152个种的相对丰度为输入数据，以每个种中数量最多的菌株为代表性菌株，利用MENA (http://ieg4.rccc.ou.edu/mena/)进行网络分析，设定阈值为0.9的随机矩阵理论(Random MatrixTheory)构建网络，通过Cytoscape 3.6.1对数据进行可视化。
结果表明：最后微生物网络包含17个代表性菌株，它们分为三个模块，包括：模块A，模块B和模块C(见图1)。模块A中三个度系数(degree)最高的点分别为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)MNAZ1050、柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)MNAZ1397和假单胞菌(Pseudomonas sp.)MNAZ228，上述三种菌的相对丰度比例为5:2:1，且均为固氮菌。模块B与模块A通过不动杆菌(Acinetobacter sp.)ACZLY512和克吕沃尔氏菌 (Kluyvera sp.)AZ981相互连接，上述两种菌的相对丰度比例为2:1，且均为非固氮菌。模块C为独立模块，它与模块A和模块B均无相互作用关系。
3)鉴于上述微生物之间的相互关系，发明人选取模块A中度系数最高的克雷伯氏菌MNAZ1050，柠檬酸杆菌MNAZ1397，假单胞菌MNAZ228作为固氮菌代表株，形成固氮菌组A，三者之间的比例为5:2:1；选取模块B中与模块A相关联的不动杆菌 ACZLY512和克吕沃尔氏菌AZ981为非固氮菌代表株，形成非固氮菌组B，二者之间的比例为2:1。固氮组A和非固氮组B以1:1的比例组成增强型高效固氮复合菌系，上述五个菌株之间在网络分析中均表现为正相互作用关系。
3、复合菌系的固氮效应验证
利用乙炔还原法测定复合菌系中菌株的固氮酶活性，具体方法为：
从R2A固体培养基上挑取待检测的菌种单菌落，接种于4mL R2A液体培养基中，摇床160rpm，28℃过夜培养。次日菌液在4℃条件下离心10min，5000rpm，去除上清液。用等量0.9％生理盐水重悬洗涤菌体2次，在相同条件下离心10min，以去除残留的培养基、抗生素以及菌体代谢产物。将洗涤之后的菌液OD600调至1.0。在无菌的20mL 顶空瓶中加入4.5mLDN无氮液体培养基和0.5mL OD600为1.0的待测菌种菌液，使得培养液初始OD600为0.1。每个样品做5个试验重复。每个顶空瓶用氩气置换4min，以排净瓶中空气。向每个充好氩气的顶空瓶中分别注入占瓶内体积1％的氧气(微氧条件) 或21％的氧气(正常空气含氧量)，以及占瓶内体积10％的乙炔气体。将注完气的顶空瓶置于28℃、160rpm条件下摇床培养，记录时间，12小时后利用气相色谱仪检测乙烯含量，计算固氮酶活性。
其中，DN无氮液体培养基(g/L)，其成分为：蔗糖10.0g、苹果酸5g、一水合磷酸氢二钾0.2g、一水合磷酸二氢钾0.4g、氯化钠0.1g、氯化铁0.01g、钼酸钠0.002g、七水合硫酸镁0.02g、一水合氯化钙0.002g。
以下具体分微氧和有氧条件下对不同菌株组合构建的复合菌系的固氮酶酶活进行说明。
1)在1％微氧条件下，根据上述生物信息学分析结果，固氮菌组A中克雷伯氏菌MNAZ1050，柠檬酸杆菌MNAZ1397，假单胞菌MNAZ228按照5：2：1的比例混合，非固氮菌组B中不动杆菌ACZLY512和克吕沃尔氏菌AZ981按照2：1比例混合的前提下，验证固氮菌组A和非固氮菌组B按照不同比例组合时固氮酶活性的差异，具体组合方式见表1。
表1微氧条件下固氮菌组A和非固氮菌组B按照不同比例组合时固氮酶活性
Figure BDA0003078828210000071
从表1中可以看出，仅有非固氮菌组B组成复合菌系时，没有固氮酶活性(见图 2)；而由固氮菌组A和固氮菌组B按照不同的组合方式进行组合时表现出不同的固氮酶活性，并且固氮组A和非固氮组B以1：1配比时固氮酶活性最显著，其固氮酶活性高达2224.1C2H4/mgpro hr，相比固氮菌组A，增强型高效固氮复合菌系固氮酶活性增加42％，差异达到显著水平(p<0.05)；增强型高效固氮复合菌系是参比菌株圆褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)ACCC10006的15倍，参比菌株来自于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
在1％微氧条件下，又验证了固氮菌组A和非固氮菌组B以1:1比例混合构成复合菌系时，固氮菌组A以及非固氮菌组B中分别以不同形式组合，对于固氮酶活性的影响，见表2。
表2微氧条件下按照不同形式组合形成固氮复合菌系的固氮酶活性
Figure BDA0003078828210000072
Figure BDA0003078828210000081
从表2中可以看出，固氮菌组A中克雷伯氏菌MNAZ1050，柠檬酸杆菌MNAZ1397 和假单胞菌MNAZ228任意一株固氮菌单独使用，都具有很高固氮酶活性，是参比菌株圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC10006固氮酶活性的6-8倍，并且任意两株固氮菌株组合使用相比单独使用任意一株固氮菌菌株，固氮酶活性均有提高；三种固氮菌同时使用时，相比任意两种固氮菌菌株组合的酶活均有提高，并且在固氮菌组A中克雷伯氏菌MNAZ1050，柠檬酸杆菌MNAZ1397和假单胞菌MNAZ228以5:2:1 比例混合时，酶活最高为1569.8C2H4/mgpro hr。
而非固氮菌组B中不动杆菌ACZLY512和克吕沃尔氏菌AZ981单独使用任意一株非固氮菌时，没有固氮酶活性。当非固氮菌组B和固氮菌组A以1:1组合时，选择非固氮菌组B中至少一种非固氮菌菌株和固氮菌组A配合使用时，均表现出比单独使用固氮菌组A时更高的固氮酶活性，并且固氮菌组A中克雷伯氏菌MNAZ1050，柠檬酸杆菌MNAZ1397和假单胞菌MNAZ228以5:2:1混合，非固氮菌组B中不动杆菌ACZLY512和克吕沃尔氏菌AZ981以2:1混合，表现出最高的固氮酶活性2224.1 C2H4/mg pro hr，这和上述生物信息学分析结果一致。
2)在21％正常空气含氧量条件下，根据上述生物信息学分析结果，固氮菌组A中克雷伯氏菌MNAZ1050，柠檬酸杆菌MNAZ1397，假单胞菌MNAZ228按照5：2：1 的比例混合，非固氮菌组B中不动杆菌ACZLY512和克吕沃尔氏菌AZ981按照2：1 比例混合的前提下，验证固氮菌组A和非固氮菌组B按照不同比例组合时固氮酶活性的差异，具体组合方式见表3。
表3有氧条件下固氮菌组A和非固氮菌组B按照不同比例组合时固氮酶活性
Figure BDA0003078828210000091
从表3中可以看出，仅有非固氮菌组B组成复合菌系时，没有固氮酶活性(见图 3)；而由固氮菌组A和固氮菌组B按照不同的组合方式进行组合时表现出不同的固氮酶活性，并且固氮组A和非固氮组B以1：1配比时固氮酶活性最显著，其固氮酶活性高达1048.1C2H4/mgpro hr，相比固氮菌组A，增强型高效固氮复合菌系固氮酶活性增加10倍，差异达到显著水平(p<0.05)；增强型高效固氮复合菌系是参比菌株圆褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)ACCC10006的59倍，参比菌株来自于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
在21％正常空气含氧量条件下，又验证了固氮菌组A和非固氮菌组B以1:1比例混合构成复合菌系时，固氮菌组A以及非固氮菌组B中分别以不同形式组合，对于固氮酶活性的影响，见表4。
表4有氧条件下按照不同形式组合形成固氮复合菌系的固氮酶活性
Figure BDA0003078828210000092
Figure BDA0003078828210000101
从表4中可以看出，固氮菌组A中克雷伯氏菌MNAZ1050，柠檬酸杆菌MNAZ1397 和假单胞菌MNAZ228任意一株固氮菌单独使用，都具有固氮酶活性，并且任意两株固氮菌株组合使用相比单独使用任意一株固氮菌菌株，固氮酶活性均有提高；三种固氮菌同时使用时，相比任意两种固氮菌菌株组合的酶活均有提高，并且在固氮菌组A 中克雷伯氏菌MNAZ1050，柠檬酸杆菌MNAZ1397和假单胞菌MNAZ228以5:2:1比例混合时，酶活最高为95.2C2H4/mg prohr。但整体上，在21％正常空气含氧量条件下，固氮菌组A中克雷伯氏菌MNAZ1050，柠檬酸杆菌MNAZ1397和假单胞菌MNAZ228 三种固氮菌单独使用或混合使用时，固氮酶活性均低于100C2H4/mg pro hr(表3)，远低于微氧条件下的固氮酶活性(均高于900C2H4/mg pro hr，见表2)，表明氧气对固氮作用产生了抑制作用。
而非固氮菌组B中不动杆菌ACZLY512和克吕沃尔氏菌AZ981单独使用任意一株非固氮菌时，没有固氮酶活性。当非固氮菌组B和固氮菌组A以1:1组合时，选择非固氮菌组B中至少一种非固氮菌菌株和固氮菌组A配合使用时，均表现出比单独使用固氮菌组A时固氮酶活性大幅度增加，并且固氮菌组A中克雷伯氏菌MNAZ1050，柠檬酸杆菌MNAZ1397和假单胞菌MNAZ228以5:2:1混合，非固氮菌组B中不动杆菌 ACZLY512和克吕沃尔氏菌AZ981以2:1混合，表现出最高的固氮酶活性1048.1 C2H4/mg pro hr，这和上述生物信息学分析结果一致。
实施例2增强型高效固氮复合菌系在玉米生长上的应用
1)选择玉米品种郑单958，玉米种子用75％酒精灭菌3min，再用5％次氯酸钠灭菌8min，再用无菌水清洗3遍，将种子埋至无菌石英砂1cm处，用无菌水将石英砂浇透，培养箱30℃黑暗催芽3天，3天后将出芽后的玉米种子转移至人工气候箱，白天光照16小时，黑夜时长8小时，空气湿度60％。
2)玉米长出三片叶后，将玉米苗从石英砂中小心拔出，去除玉米种子胚乳。将固氮菌组A和非固氮菌组B以1:1的比例混合，组成增强型高效固氮复合菌系菌液，将玉米根系浸泡至复合菌系菌液中10min，对照组玉米根系浸泡至无菌水中10min。浸泡结束后将玉米苗种植无菌石英砂中，每个培养盆中种植两颗长势一致的玉米苗。
增强型高效固氮复合菌系菌液配置方法：分别将克雷伯氏菌MNAZ1050、柠檬酸杆菌MNAZ1397、假单胞菌MNAZ228、不动杆菌ACZLY512和克吕沃尔氏菌AZ981 接种至30mL R2A液体培养基中，摇床160rpm，28℃过夜培养。次日菌液在4℃条件下离心10min，5000rpm，去除上清液。用等量0.9％生理盐水重悬洗涤菌体2次，在相同条件下离心10min，以去除残留的培养基、抗生素以及菌体代谢产物。将洗涤之后的菌液OD600调至1.0，将20mL雷伯氏菌MNAZ1050、8mL柠檬酸杆菌MNAZ1397、 4mL假单胞菌MNAZ228混合，配成比例为5:2:1的固氮菌组A菌液；将20mL不动杆菌ACZLY512和10mL克吕沃尔氏菌AZ981混合，配成比例为2:1的非固氮菌组B 菌液。最后，30mL固氮菌组A菌液和30mL非固氮菌组B菌液混合形成增强型高效固氮复合菌系菌液。
3)玉米定植后，每天浇500mL无菌水，每3天浇500mL氮素减少50％的营养液。
氮素减少50％的营养液母液成分为：硝酸钾303.3g/L，四水硝酸钙472.32g/L，磷酸二氢铵115.08g/L，七水硫酸镁246.48g/L，乙二胺四乙酸铁钠9.8g/L，微量元素液体(硼酸1.546g/L、一水硫酸锰0.338g/L、七水硫酸锌0.576g/L、五水硫酸铜0.124g/L、钼酸0.080g/L)，使用时各取1mL母液稀释至1L。
4)玉米生长第30天，将60mL增强型高效固氮复合菌系菌液用无菌水稀释到500 mL后浇至玉米根部，对照组使用同样体积的无菌水。
5)在氮肥施用减少50％条件下，玉米生长65天后，施用增强型高效固氮复合菌系的玉米根系生物量为14.75g(干重)，相比对照组，根系生物量增加23％，玉米地上部生物量为29.44g(干重)，相比对照组，地上部生物量增加32％。整株玉米生物量增加 29％(见图4)。
上述结果表明，本发明增强型高效固氮复合菌系不仅可以通过生物固氮为玉米补充氮素营养，而且能够增加玉米根系生物量，具有根系促生作用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种固氮复合菌系，其特征在于，包括固氮菌和非固氮菌；其中，固氮菌包括克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)MNAZ1050、柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)MNAZ1397和假单胞菌(Pseudomonas sp.)MNAZ228；所述非固氮菌包括不动杆菌(Acinetobacter sp.)ACZLY512和克吕沃尔氏菌(Kluyvera sp.)AZ981；
所述克雷伯氏菌MNAZ1050、柠檬酸杆菌MNAZ1397和假单胞菌MNAZ228保藏编号分别为CGMCC No.22270、CGMCC No.22267和CGMCC No.22266，保藏时间均为2021年5月6日，保藏单位均为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
所述不动杆菌ACZLY512和克吕沃尔氏菌AZ981保藏编号分别为CGMCC No.22268和CGMCC No.22269，保藏时间均为2021年5月6日，保藏单位均为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的固氮复合菌系，所述固氮复合菌系中的固氮菌和非固氮菌的含菌量比例为(1-2)：(1-2)。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述固氮菌中，克雷伯氏菌MNAZ1050：柠檬酸杆菌MNAZ1397：假单胞菌MNAZ228含菌量比例为(1-7)：(1-4)：(1-2)；
所述非固氮菌中，不动杆菌ACZLY512和克吕沃尔氏菌AZ981按照含菌量比例(1-2)：(1-2)混合而成。
4.一种如权利要求1所述的固氮复合菌系在制备菌剂中的应用，其特征在于，应用于制备如下任一项所示菌剂中：
(1)提高粮食作物和农艺作物的固氮作用的菌剂；
(2)提高粮食作物和农艺作物地上部分生物量的菌剂；
(3)提高粮食作物和农艺作物根系生物量的菌剂。
5.一种如权利要求1所述的固氮复合菌系或权利要求2-3任一项所述的菌剂的使用方法，其特征在于，所述固氮复合菌系或所述菌剂采用灌根方式处理粮食作物或园艺作物根系。
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