CN108192843B - 一种固氮菌株及其微生态制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适应高海拔低温型自身固氮菌株为暗灰链霉菌株。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.14766，命名为暗灰链霉菌HG101菌株(Streptomyces canus HG101)。

Description

一种固氮菌株及其微生态制剂

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种适应高海拔低温型自身固氮菌株(Streptomyces canus CGMCC NO.14766)及基于该固氮菌株制备微生态制剂的发酵方法。

背景技术

现在人类生产氮肥使用的化学方法，不仅需要高温、高压等非常苛刻的条件，而且还浪费大量原料，氮分子的有效利用率很低。固氮菌每年从空气中约固定1.5亿吨氮肥，是全世界生产氮肥总量的几倍。因此，固氮菌及其固氮酶的研究已成为当今农业生产应用和科学研究的热点。生物固氮是固氮微生物的一种特殊的生理功能，已知具固氮作用的微生物约近50个属，包括细菌、放线菌和蓝细菌，它们的生活方式、固氮作用类型有较大区别，但细胞内都具有固氮酶。不同固氮微生物的固氮酶均由钼铁蛋白和铁蛋白组成。固氮酶必须在厌氧条件下，即在低的氧化还原条件下才能催化反应。根据固氮微生物与高等植物的关系，可分为自生固氮菌、共生固氮菌以及联合固氮菌。

共生固氮菌，在与植物共生的情况下才能固氮或才能有效地固氮，固氮产物氨可直接为共生体提供氮源。主要有根瘤菌属(Rhizobium)的细菌与豆科植物共生形成的根瘤共生体，弗氏菌属(Frankia,一种放线菌)与非豆科植物共生形成的根瘤共生体；某些蓝细菌与植物共生形成的共生体，如念珠藻或鱼腥藻与裸子植物苏铁共生形成苏铁共生体，红萍与鱼腥藻形成的红萍共生体等。根瘤菌生活在土壤中，以动植物残体为养料，同时，根瘤菌从空气中吸收氮气转化为氨，被豆科植物利用，根瘤菌与豆科植物形成共生关系，因此根瘤菌也被称为共生固氮菌或者联合固氮菌。

联合固氮菌，有的固氮菌生活在某些植物根的粘质鞘套内或皮层细胞间，不形成根瘤，但有较强的专一性，如雀稗固氮菌与点状雀稗联合，生活在雀稗根的粘质鞘套内固氮；其他如生活在水稻、甘蔗及许多热带牧草的根际的微生物，由于与这些植物根系联合，因而都有很强的固氮作用。

自生固氮菌(Azotobacteria)是自由生活在土壤或水域中，能独立进行固氮作用的某些细菌。以分子态氮为氮素营养，将其还原为NH₃，再合成氨基酸、蛋白质。包括好氧性细菌，如固氮菌属、固氮螺菌属以及少数自养菌；兼性厌氧菌，如克雷伯氏菌属；厌氧菌，如梭状芽孢杆菌属的一些种。还有光合细菌如红螺菌属、绿菌属以及蓝细菌，如鱼腥藻属、念珠藻属等。自生固氮菌中，人们应用得最多的是圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)。圆褐固氮菌具有较强的固氮能力，并且能够分泌生长素，促进植株的生长和果实的发育,因此，将圆褐固氮菌制成菌剂，施用到土壤中，可以提高农作物的产量。

国内外关于固氮菌及固氮酶文献报道很多，也有一些相关的专利申请和专利授权，相关报道和这里主要集中在根瘤菌属。根据农业部2012版生物有机肥执行标准，在原有有机肥标准基础上，增加了“功能性菌株活菌数”，和“保质期”两项指标。具体为有效活菌数(cfu)≥0.20亿/g。有效期≥6月。目前固氮菌肥基本上是添加共生固氮菌或联合固氮菌的生物菌剂，根瘤菌菌剂为主。添加自身固氮菌的生物有机肥很少。作为根瘤菌添加剂，在有机肥商品中也存在“货架期极短”致命缺陷。根瘤菌最适生长温度26— 30℃，无芽孢，人工培养条件下细胞数可达10—100亿个/mL，由于无芽孢，人工培养条件下菌体极易死亡，失去活性。4℃斜面保存1个月后，死亡率95％，3个月基本接种不出菌种。在根瘤菌生产过程中，根瘤菌在微滤，超滤浓缩工艺过程中，活菌死亡率超过90％以上，经干燥后(不论冻干还是吸附自然干燥)，活菌数损失非常大，存活率不及原有的 1％，严重影响根瘤菌作为商品的货架期，很难满足6个月的保质期要求。

发明内容

本发明旨在针对当前固氮菌生产与应用方面的不足，提供一种适应高海拔低温型自身固氮菌及其生产工艺方法，包括固氮菌菌株的筛选，发酵培养基的选择，发酵工艺的优化，固氮菌微生态制剂制备，固氮菌微生态菌剂的应用。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述适应高海拔低温型自身固氮菌株为暗灰链霉菌株，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.14766，命名为暗灰链霉菌HG101菌株(Streptomyces canus HG101)。

其中，所述固氮菌株适合生长温度为15—39℃，适合固氮温度为15—37℃。

优选地，所述固氮菌株最适生长温度位35—37℃，最适固氮温度25—28℃。

所述固氮菌株在0—4℃条件下，保存1年，存活率达60—70％；在拉萨河谷地区室温 (大约在13—18℃)条件下，保存1年，存活率达40—45％。

所述固氮菌株孢子丝多圈螺旋形，孢子卵圆形、球形，表面光滑，菌落无色，有时反面微黄色、微污黄色、浅棕色，色素不渗透，气丝白色或有时微烬灰色，无色素；利用***糖、木糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、鼠李糖、棉子糖、淀粉、菊糖、甘油；不利用肌醇、山梨醇、卫矛醇、醋酸钠、柠檬酸钠；不利用铵盐为氮源，在(NH₄)₂SO₄合成培养基中不能生长；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐。

所述固氮菌株为自身固氮菌株，与作物无共生特点，对作物无害，无作物品种的特异性，固氮对象是整个土壤而非特异性植物。

所述固氮菌株克用于制备生物发酵有机肥(包括但不限于固氮菌肥)、土壤调理剂、改良剂或松土剂。

上述固氮菌株制备微生态制剂的固体发酵方法包括如下步骤：

(1)按如下重量份配制发酵培养基：麸皮50—65份，自来水48—55份，豆粕2—5份；自然pH，121—124℃灭菌40—50min，即得发酵培养基，可装入60cm×40cm×5cm不锈钢浅盘；

(2)按2—5％的接种量将固氮菌株的固体种子接种至发酵培养基，于25—38℃发酵84— 144h，发酵期间翻动发酵麸曲1—2次；

(3)发酵终止后，将发酵麸曲用沸腾干燥机干燥至含水量为6—8％，所述干燥温度为60 —80℃；

(4)将干燥后的发酵麸曲粉碎至40—80目，制成微生态菌剂，所述微生态制剂中活菌数为50—100亿个/g。

上述固氮菌株制备微生态制剂的液体发酵方法包括如下步骤：

(1)按如下重量份配制发酵培养基：淀粉2—5份，自来水95—98份，酵母膏0.5—8份，pH 6.8—7.5，121℃灭菌25—30min，即得发酵培养基；

(2)按5—10％的接种量将固氮菌株的液体种子至发酵培养基，于35—37℃发酵72—96h，发酵时发酵罐的通气量为(1.0—1.2):1vvm，搅拌桨末端线速度小于18米/秒；

(3)发酵终止后，将发酵液经板框过滤后制成滤饼，用沸腾干燥机干燥至含水量为6— 8％，所述干燥温度60—80℃；

(4)将干燥后的菌饼粉碎至40—80目，制成微生态菌剂，所述微生态制剂中活菌数达100 —500亿个/g。

下面对本发明作进一步说明：

本发明目的之一是获得一种自身固氮菌菌株：从西藏河谷青稞种植地区，海拔3600 米以上的土壤取样，空运寄回，尽快分离；配制平板筛选无氮培养基(甘露醇2g，氯化钠0.02g，KH₂PO₄0.02g，MgSO₄·7H₂O0.02g，琼脂2.0g，蒸馏水100mL，121℃灭菌 25min)，用蒸馏水按十倍稀释法涂布上述土样，37℃培养2—4天，待长出菌落，接入试管斜面(斜面培养基同筛选培养基)，获得若干自身固氮菌，如附图1；摇瓶发酵筛选，配制无氮发酵培养基(可溶性淀粉2g，氯化钠0.02g，KH₂PO₄0.02g，MgSO₄·7H₂O0.02 g，琼脂2.0g，蒸馏水100mL，121℃灭菌25min)，接种上述筛选菌株，于35℃摇床中振荡培养2.5—4.0天，测定固氮酶酶活力，复筛获得固氮酶活力较高菌株HG101，经鉴定该菌株为暗灰链霉菌(Streptomycescanus)，菌株于2017年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号，CGMCC No.14766；⑷固氮酶酶活力的测定采用乙炔还原法进行，乙烯含量采用岛津GC9A型气相色谱仪检测，以乙烯的生成量表征固氮酶活性的高低，固氮酶活性(nmol C₂H₄/mL·h)。

本发明目的之二是制备自生固氮菌Streptomyces canus CGMCC No.14766微生态制剂的方法，通过以下固体发酵或液体发酵技术方案实现：固体发酵法，⑴发酵培养基配方为麸皮50％—65％，自来水48％—55％，豆粕2％—5％，自然pH，121—124℃灭菌40 —50min，制成熟料，装入60cm×40cm×5cm不锈钢浅盘；按2％—5％的接种量接种所述菌株的固体种子或液体种子，混匀后培养；发酵温度25—38℃；⑷发酵周期84—144 小时，发酵期间翻曲1—2次；⑸发酵终止后，发酵曲用沸腾干燥至含水量6％—8％，干燥温度60—80℃；⑹干燥后的发酵麸曲，经粉碎至40—80目，制成微生态菌剂，活菌数达50—100亿个/g；液体发酵法，⑴发酵培养基配方为淀粉2％—5％，自来水95％— 98％，酵母膏0.5％—8％，自然pH 6.8—7.5，121℃灭菌25—30min；⑵按5％—10％的接种量接种所述菌株的液体种子；⑶发酵温度35—37℃，发酵周期72—96小时，发酵罐通气量为1.0—1.2:1(vvm，特征为无菌空气体积/发酵罐装液量体积/min)，搅拌桨末端线速度小于18米/秒；⑷发酵终止后，发酵液板框过滤，制成滤饼，用沸腾干燥至含水量6％— 8％，干燥温度60—80℃；⑸干燥后的菌饼，经粉碎至40—80目，制成微生态菌剂，活菌数达100—500亿个/g；Streptomyces canusCGMCC No.14766菌株的孢子存活期长，在 0—4℃条件下，保存1年，存活率达70％—80％，在拉萨河谷地区室温条件下，保存1 年，存活率达40％—50％，具有较好的商业价值。

本发明目的之三是利用制备的自生固氮菌Streptomyces canus CGMCC No.14766的孢子用于生物固氮的方法用途，通过以下固体发酵或液体发酵技术方案实现：⑴Streptomyces canus CGMCC No.14766菌株用于发酵有机肥，保持或增加有机肥的氮素含量；⑵Streptomyces canus CGMCC No.14766菌株用于发酵微生态菌剂，制备生物固氮菌肥；⑶Streptomyces canus CGMCC No.14766菌株用于发酵微生态菌剂，制备土壤调理剂、改良剂、松土剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)固氮菌HG101与一般固氮菌、特别是根瘤菌相比较，固氮菌HG101属于自身固氮菌，固氮对象整个土壤，作用面积大，适合西藏高原贫瘠土壤，且无作物种属的限制。

(2)固氮菌HG101具有较宽的生长温度范围(15-39℃)和固氮温度范围(15-37℃)，适合西藏高原低温气候，对青稞作物有明显增产效果。

(3)固氮菌HG101适合畜禽废弃物发酵生物有机肥，除具有固氮保氮功效外，还具有环境保护功能，对人体无害的安全菌株。

(4)固氮菌HG101作为固氮菌剂，由于可以承受耐较高温的孢子，具有较长的保质期，适合制作农业生产有机肥菌剂、肥料发酵剂。

附图说明

图1为暗灰链霉菌HG101(Streptomyces canus)在无氮培养基上生长情况，生物量饱满，暗示固氮能力强。

具体实施方式

实施例1 低温固氮菌的分离：

从西藏河谷青稞种植地区，海拔3600米以上的土壤取样，空运寄回，尽快分离；通过无氮培养基平板筛选(甘露醇2g，氯化钠0.02g，KH₂PO₄0.02g，MgSO₄·7H₂O0.02 g，琼脂2.0g，蒸馏水100mL，121℃灭菌25min)，用蒸馏水按十倍稀释法涂布，37℃培养2—4天，待长出菌落，接入试管斜面(斜面培养基同筛选培养基)，获得238株不同类型的自身固氮菌。

实施例2 固氮菌固氮活性的摇瓶复筛：

配制液体无氮培养基若干于锥形瓶中(甘露醇2g，氯化钠0.02g，KH₂PO₄0.02g，MgSO₄·7H₂O0.02g，蒸馏水100mL，121℃灭菌25min)，接入固氮菌试管斜面菌种，在180r/m，30℃摇床中培养3天，按乙炔还原法测定固氮酶活性，选取固氮酶活性大于 40nmol C₂H₄/mL·h的菌株进一步进行单一变量条件测定，从本实例中获得7株固氮酶活性较好的菌株。

实施例3 固氮菌固氮条件的优化测定：

选取固氮活性较好的固氮菌，进行温度变量测定，选取在15—25℃具有固氮酶活性的菌株进一步优化；本实例获得一株低温固氮酶活性较高的菌株HG101，该菌株适合生长温度为15—39℃，最适生长温度35—37℃；菌株HG101适合固氮温度为15—37℃，最适固氮温度25—28℃，具有低温固氮能力。

实施例4 固氮菌HG101的生理生化特性测定和形态鉴定：

根据单一变量原则，分别测定唯一碳源或唯一碳源培养基的菌株生长情况，观察菌落形态，获取固氮菌HG101的形态特征；菌株HG101孢子丝多圈螺旋形，孢子卵圆形、球形，表面光滑，菌落无色，有时反面微黄色、微污黄色、浅棕色，色素不渗透，气丝白色或有时微烬灰色，无色素；利用***糖、木糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、鼠李糖、棉子糖、淀粉、菊糖、甘油；不利用肌醇、山梨醇、卫矛醇、醋酸钠、柠檬酸钠；不利用铵盐为氮源，在(NH4)₂SO₄合成培养基中不能生长；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐。

实施例5 固氮菌HG101的16S rDNA序列分子鉴定：

固氮菌HG101的16S rDNA序列，经上海迈浦生物科技有限公司测序，并与GenBank数同源性比对，关键***发育树，确定为Streptomyces canus，与形态及生理生化测定一致。

实施例6 固氮菌HG101固体发酵产气微生态制剂：

配制固体发酵培养基，麸皮45％，自来水50％，豆粕5％，自然pH，121℃灭菌40min，制成熟料，装入60cm×40cm×5cm不锈钢浅盘；按5％的接种量接种所述菌株的固体种子或液体种子，混匀后培养；在30℃条件下发酵96小时，发酵期间翻曲2次，发酵终止后，发酵曲用沸腾干燥机60℃干燥至含水量8％，粉碎80目，制成微生态菌剂，活菌数达80亿个/g。

实施例7 固氮菌HG101液体发酵产微生态制剂：

配制液体发酵培养基80L，期中淀粉2％，酵母膏0.5％，自来水97.5％，pH 7.5，121℃灭菌25min，在100L发酵罐中按5％的接种量接种固氮菌HG101的液体种子，在温度35℃，发酵84小时，发酵罐通气量为1:1(vvm)，发酵终止后，发酵液板框过滤，制成滤饼，在60℃条件下，用沸腾干燥至含水量8％，干燥后的菌饼，经粉碎至80目，制成微生态菌剂，活菌数达200亿个/g。

实施例8 固氮菌HG101微生态粉剂发酵猪粪有机肥固氮、保氮应用：

将含水量75％左右的鲜猪粪4吨，按8:1的重量比例与含水量20％左右的蘑菇渣混合，含水量调配至60％左右，同时混合2kg市售发酵腐熟剂，再把堆肥猪粪物料分成两垄，其中一垄添加活菌数为80亿个/g固氮菌HG101微生态粉剂500g，另一垄作为对照，经20余天发酵腐熟，其生物有机肥特征指标见表1：

表1 固氮菌菌剂对猪粪、蘑菇渣的快速腐熟的时间和养分对比

从表1可知，接种固氮菌菌剂和发酵腐熟菌剂比单一接种发酵腐熟菌剂效果好，略有白色，具有土腥味特质，不愉快气味去除效果明显；发酵时间缩短2天；氮素增加0.2％，说明固氮菌HG101在发酵猪粪过程中还具有固氮、保氮功效。

实施例9

固氮菌HG101微生态粉剂用于土壤调理、改良、松土增加农业生产产量：在西藏河谷地区海拔3500m以上的种植区，种植藏青320，采用对比法使用氮磷钾复合肥、固氮菌HG101 微生态粉剂(200亿个/g)交替施用，其青稞产量结果见表2：

表2 固氮菌菌剂与复合肥施用对青稞产量的影响

从表2可知，施用复合肥或固氮菌HG101菌剂均能大幅提高青稞产量，其中固氮菌HG101 的施用增产率大25％以上，增产效果明显。

实施例10

固氮菌HG101保藏期与紫云银根瘤菌ACCC13005对比存活实验，结果见表3：从表3可以看出，固氮菌HG101用于能产生休眠体孢子，保质期远远低于紫云银根瘤菌ACCC13005，特别是生物有机肥固体制剂中具有较长的保质期，在西藏河谷高海拔低温区，保存1年，存活仍然达率40％，体现较高商业价值，克服了根瘤菌难以保藏的的缺点。

表3 固氮菌HG101与紫云银根瘤菌ACCC13005对比保存实验

Claims (5)

1.一种适应高海拔低温型自身固氮菌株，其特征在于，所述固氮菌株为暗灰链霉菌株(Streptomyces canus)，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.14766，命名为暗灰链霉菌HG101菌株。

2.基于权利要求1所述固氮菌株制备微生态制剂的固体发酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)按如下重量份配制发酵培养基：麸皮50—65份，自来水48—55份，豆粕2—5份；121—124℃灭菌40—50min，即得发酵培养基；

(2)按2—5％的接种量将固氮菌株的固体种子接种至发酵培养基，于25—38℃发酵84—144h，发酵期间翻动发酵麸曲1—2次；

(3)发酵终止后，将发酵麸曲干燥至含水量为6—8％，所述干燥温度为60—80℃；

(4)将干燥后的发酵麸曲粉碎至40—80目，制成微生态菌剂，所述微生态制剂中活菌数为50—100亿个/g。

3.基于权利要求1所述固氮菌株制备微生态制剂的液体发酵方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)按如下重量份配制发酵培养基：淀粉2—5份，自来水95—98份，酵母膏0.5—8份，pH6.8—7.5，121℃灭菌25—30min，即得发酵培养基；

(2)按5—10％的接种量将固氮菌株的液体种子至发酵培养基，于35—37℃发酵72—96h，发酵时的通气量为1.0—1.2:1vvm；

(3)发酵终止后，将发酵液经板框过滤后制成滤饼，干燥至含水量为6—8％，所述干燥温度60—80℃；

(4)将干燥后的菌饼粉碎至40—80目，制成微生态菌剂，所述微生态制剂中活菌数达100—500亿个/g。

4.如权利要求1所述固氮菌株在制备生物发酵有机肥中的应用。

5.如权利要求1所述固氮菌株在制备土壤调理剂、改良剂或松土剂中的应用。

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