CN102250784B - 一种当归根际高效解磷菌及其制备得到的菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种当归根际高效解磷菌及其制备得到的菌剂和应用，该解磷菌为芽孢杆菌Bacillus sp.DGP01，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.4755，保藏日期：2011年4月7日。解磷菌菌剂是通过以下方法制备得到的：取解磷菌Bacillus sp.DGP01菌株接种于种子培养基摇瓶中，振荡培养至对数生长期；然后将培养好的菌种接种入装有发酵培养基的种子罐，培养至对数生长期；然后将上述发酵液接入装有发酵培养基的生产罐中培养得到。该解磷菌能够将难溶性无机磷转化为可供植物直接吸收利用的优质磷素化合物，可提高土壤中难溶性磷的生物有效性和磷肥利用效率，节肥增产，且在培育和发挥土壤生态肥力、保持农业生态平衡方面具有重要意义和应用价值。

Description

一种当归根际高效解磷菌及其制备得到的菌剂和应用

技术领域

本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及一种当归根际高效解磷菌Bacillus sp.DGP01，及其发酵制备得到的菌剂和应用。

背景技术

磷是植物生长发育所必需的矿质元素之一，是植物体内核酸及多种酶、辅酶、ATP等重要组成成分，作物吸收磷量与其生物量和产量呈显著正相关性，植物缺磷时，会出现分蘖减少或延迟，抽穗推迟，成熟迟，穗粒数减少，籽粒不饱满，玉米果穗秃顶，油菜脱荚、甘薯、马铃薯块变小等现象，因此磷对农业生产极其重要。但我国有74％的耕地土壤缺磷，土壤中95％以上的磷为无效形式，植物很难直接吸收利用，尤其是红壤旱地磷素最为缺乏；另一方面土壤磷素的积累问题相当严重，通过施肥进入土壤的磷会与Ca²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Al³⁺等离子结合形成难溶性磷酸盐，施入的磷肥有75％～90％积累在土壤中，作物的磷肥当季利用率一般只有5％～10％，大部分磷肥成为无效态(难溶态)在土壤中积累。由于长期施用磷肥，大多数农田土壤潜在的磷库含量很大，而提供作物生长发育的磷流却很小。土壤中无机磷的含量约占土壤全磷量的1/3-1/2，而土壤中无机磷的形态主要有原生矿物和次生矿物两种，其中原生矿物主要是磷灰石，磷灰石的主要成分为钙氟磷灰石Ca₅F(PO₄)₃和氢氧磷灰石Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂，次生矿物主要指化合态，即沉淀态的磷酸盐。在北方的石灰性土壤中，磷酸钙占无机磷量的60％-80％，在南方的砖红壤中，磷酸铁和磷酸铝占无机磷量的80％，这些结合态磷的活性低，向土壤供磷能力弱，土壤中除无机磷外，磷素中约1/3-1/2是有机磷，主要以植酸钙镁的形态存在，约占30％-50％；此外，大量使用化肥明显造成土壤板结、土壤保水力下降、草地退化、荒漠化严重等不良后果。因此，提高磷的利用率一直是农学、土壤学、生态环境和微生物学研究者关注的热点。

当归(Angelica sinensis(Oliv.)Diels)为伞形科多年生草本药用植物，药用部位是其干燥根，收载于各部《中华人民共和国药典》。当归具有补血活血，调经止痛，润肠通便之功效，是中医妇科临床上的常用中药，素有“十方九归”之说。当归主要分布于甘肃、云南、四川、湖北、贵州等省区，但主产于我国甘肃岷县、武都、成县等地，年产量占全国95％以上，当归是一种喜肥药用植物，在营养生长期间，高肥是促进根系发育、获得高产的重要因素，当归生长发育过程中对氮、磷、钾三元素需求量大，当归产区土壤中和农家肥料中一般磷、钾不足，必须依靠施肥补充土壤养分的不足，而目前主要使用磷酸二氢钾、磷酸二铵和氮磷钾复合肥等化学肥料作追肥。长期以来，人们主要从无机磷的吸附与解吸、沉淀和溶解等化学转化过程来研究土壤磷的活化。微生物对土壤磷的转化和有效性影响很大，土壤微生物既是土壤无机质转化的执行者，又是植物营养元素的活性库，土壤微生物的生物量及其周转对植物养分有效性起着重要作用。迄今为止发现的溶磷菌主要集中在农作物土壤中，解磷微生物肥料也多应用于农作物的生产实践中，而关于当归等中药材栽培的微生物生态***尚未见相关报道。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，对当归的根际微生物进行深入研究，提供一种具有降解土壤难溶无机磷，为植物提供可以直接吸收的优质磷素的当归根际高效解磷菌Bacillus sp.DGP01，本发明另一个目的是提供当归根际高效解磷菌Bacillus sp.DGP01发酵制备得到的解磷菌剂，及Bacillus sp.DGP01在制备降解土壤难溶无机磷的解磷菌剂中的应用。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种当归根际高效解磷菌，该解磷菌为芽孢杆菌Bacillus sp.DGP01，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.4755，保藏日期：2011年4月7日，保藏名称为：芽孢杆菌Bacillus sp.，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；菌株特征为：菌体短杆状，具有一个内生芽孢，革兰氏反应为阳性，好氧。

本发明提供的当归根际高效解磷菌的分离方法为：从甘肃岷县采集当归新鲜植株，抖掉附着在根上的疏松土壤，取粘附在当归根表面厚度约2～3mm的土壤，即为当归根际土壤样品，称取研磨后的根际土样粉末10g，加入90ml含有少许玻璃珠的无菌水中，置于恒温摇床以120转/分钟振荡30～40分钟，稀释，取10^-3和10^-4稀释度的土壤悬液涂布于解磷细菌筛选固体平板培养基上(培养基组成为：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，KCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O0.3g，NaCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，Ca₃(PO₄)₂5.0g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5)，在32℃培养5天，有溶磷圈的菌落视为有解磷活性，相应的菌株为解磷细菌，记录菌落直径和溶磷圈的大小，挑取溶磷圈较大的单菌落进行分离纯化，转接到斜面培养基培养得到当归根际高效解磷菌芽孢杆菌Bacillus sp.DGP01，于4℃保藏。

本发明提供的当归根际高效解磷菌的菌剂，它是通过以下方法制备得到的：取当归根际解磷菌Bacillus sp.DGP01菌株接种于种子培养基摇瓶中，振荡培养至对数生长期；然后将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入装有发酵培养基的500升种子罐(即菌种和发酵培养基的体积比例为1∶10)，投料量为350～400升，培养至对数生长期；然后将上述发酵液按10％的接种量接入装有发酵培养基的5吨生产罐培养(即发酵液和发酵培养基的体积比例为1∶10)，投料量为4.0～4.5吨，发酵所得培养液用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附后用包装袋分装成固体菌剂剂型，发酵培养液中菌体数量可达到10亿个/mL以上。

作为优选方案，以上所述的当归根际高效解磷菌的菌剂，所述的种子培养基、种子罐与生产罐所用的发酵培养基均由下列重量的原料制成：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，KCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，NaCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，KH₂PO₄1.0g，蒸馏水1000mL，种子培养基、种子罐与生产罐所用的发酵培养基的pH为7.0～7.5。

作为优选方案，以上所述的当归根际高效解磷菌的菌剂，在种子罐和生产罐的发酵培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.6～1.0(即单位时间内通入的无菌空气和发酵培养基的体积比)，搅拌速度为180～200转/分，培养温度30～32℃，培养时间为48～60小时。

本发明提供的当归根际高效解磷菌的菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)取分离得到的当归根际解磷菌Bacillus sp.DGP01菌株接种于种子培养基摇瓶中，振荡培养至对数生长期；

(2)然后取步骤(1)培养好的菌种按10％的接种量接种入装有发酵培养基的500升种子罐中培养，投料量为350～400升，培养至对数生长期；

(3)然后取步骤(2)培养好的发酵液按10％的接种量接入装有发酵培养基的5吨生产罐中培养，投料量为4.0～4.5吨，发酵所得培养液用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附后用包装袋分装成固体菌剂剂型。

作为优选方案，以上所述的当归根际高效解磷菌菌剂的制备方法，其中步骤(1)所述的种子培养基，步骤(2)与步骤(3)所述的发酵培养基均由下列重量的原料制成：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，KCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，NaCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O0.03g，KH₂PO₄1.0g，蒸馏水1000mL，种子培养基和发酵培养基的pH为7.0～7.5。

作为优选方案，以上所述的当归根际高效解磷菌菌剂的制备方法，步骤(1)摇瓶培养的温度为28～30℃，搅拌速度为180～200转/分；步骤(2)种子罐和步骤(3)生产罐的发酵培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.6～1.0(即单位时间内通入的无菌空气和发酵培养基的体积比)，搅拌速度为180～200转/分，培养温度30～32℃，培养时间为48～60小时。

本发明提供的当归根际高效解磷菌在制备降解土壤难溶无机磷的解磷菌剂中的应用。

本发明提供的解磷菌剂可与磷矿粉或有机肥混合使用，也可以单独使用，应用于当归等中药材的栽培施肥，可提高中药材的产量和品质。

有益效果：本发明提供的当归根际高效解磷菌及其制备得到的菌剂和现有技术相比具有以下优点：

1、本发明经过大量实验筛选，从当归根际中筛选出具有降解难溶性无机磷(如Ca²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Al³⁺等离子结合形成难溶性磷酸盐)的解磷菌Bacillus sp.DGP01，并以解磷菌Bacillus sp.DGP01为菌种发酵培养制备得到解磷菌剂，该解磷菌及其菌剂能够将难溶性无机磷转化为可供植物直接吸收利用的优质磷素化合物，可提高土壤中难溶性磷的生物有效性和磷肥利用效率，节肥增产，而且可改善土壤结构，提高土壤有机质含量，改良盐碱地以及对培育和充分发挥土壤生态肥力、保持农业生态环境的平衡等均具有极其重要意义和应用价值。

2、本发明提供的解磷菌及其菌剂，不仅能增加土壤中的有效磷而且能促进植物对其他营养元素的吸收，解磷菌可以吸附植物根系周围的锌、铜、钙等微量元素，改善植物营养；而且还可分泌生长调节物质，促进根系生长；并且解磷菌接种后，在植物根际大量生长繁殖，在一段时间内成为植物根际的优势菌，从而可抑制或减少病原微生物的繁殖机会，提高植物的抗病能力。

3、本发明提供的解磷菌剂可将土壤中难溶性无机磷降解为植物可以利用的可溶性无机磷，向土壤中直接释放优质磷肥料，故不存在生产过程中向环境排放污染物，解磷微生物是一种真正意义上的环保型肥料；且本发明提供的解磷菌剂的制备方法，生产工艺简单，生产效率高，能实现工业化大生产，具有良好的经济效应和社会效应。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

一种当归根际高效解磷菌菌剂，它是通过以下方法制备得到的：

取当归根际解磷菌Bacillus sp.DGP01(保藏号为CGMCC No.4755)菌株接种于种子培养基摇瓶中，30℃，200转/分种振荡培养至对数生长期；然后将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入装有发酵培养基的500升种子罐，投料量为400升，培养至对数生长期；然后将上述发酵液按10％的接种量接入装有发酵培养基的5吨生产罐培养，投料量为4吨，发酵所得培养液直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型的解磷菌菌剂。

以上所述的种子培养基、种子罐与生产罐所用的发酵培养基均由下列重量的原料制成：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，KCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，NaCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，KH₂PO₄1.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.5。

以上在种子罐和生产罐的发酵培养过程中无菌空气的通气量为1∶1.0，搅拌速度为200转/分，培养温度32℃，培养时间为60小时。

实施例2

一种当归根际高效解磷菌菌剂，它是通过以下方法制备得到的：

取当归根际解磷菌Bacillus sp.DGP01(保藏号为CGMCC No.4755)菌株接种于种子培养基摇瓶中，30℃，200转/分种振荡培养至对数生长期；然后将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入装有发酵培养基的500升种子罐，投料量为450升，培养至对数生长期；然后将上述发酵液按10％的接种量接入装有发酵培养基的5吨生产罐培养，投料量为4.5吨，发酵所得培养液用泥炭吸附后用包装袋分装成固体剂型的解磷菌菌剂。

以上所述的种子培养基、种子罐与生产罐所用的发酵培养基均由下列重量的原料制成：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，KCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，NaCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，KH₂PO₄1.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.5。

以上在种子罐和生产罐的发酵培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.6，搅拌速度为180转/分，培养温度30℃，培养时间为48小时。

实施例3解磷菌解磷能力测试

1、液体培养法测定菌株的解磷能力

在100mL三角瓶中装入30mL已灭菌的种子培养基(葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，KCl0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，NaCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，KH₂PO₄1.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.5)，接入已经活化好的斜面Bacillus sp.DGP01菌种(保藏号为CGMCC No.4755)，摇瓶培养至对数生长期(约10⁸CFU·mL^-1)。按5％接种量分别接入解磷培养液(250mL三角瓶装40mL培养基)，同时设不接菌种的对照组，每个处理重复5次，接种后在32℃，200转/分钟恒温摇床上培养7～10天后，取10ml培养液，12000转/分钟离心10min，然后采用钼锑抗比色法测定上清液可溶性磷含量。

2、砂培试验测定菌株的解磷能力

将解磷菌Bacillus sp.DGP01(保藏号为CGMCC No.4755)接种到无菌的加有难溶性无机磷培养基的土壤或细砂中，通过室内模拟培养后，测定土壤(或细砂)中可溶性磷含量的变化来确定菌株解磷能力。具体步骤为取适量河砂，晒干后过2mm筛，水洗3次，以除去附着的土壤，再用1％稀盐酸浸泡24h后，用蒸馏水洗至中性，烘干备用。称取细砂50g放入50mL三角瓶中，分别加入磷酸三钙、磷酸铝、磷酸铁和磷矿粉0.5g，1.05×10⁵Pa灭菌30min，共灭菌3次。将2mL Bacillus sp.DGP01菌的菌液接入灭菌的细砂中，加入8mL解磷培养基[葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，KCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，NaCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，磷源5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5]，同时设不加菌种的对照组，在32℃培养4周后，直接用水浸提砂土，并采用钼锑抗比色法测定浸提液中可溶性磷的含量。

3、结果与分析

3.1采用液体培养法测定Bacillus sp.DGP01菌株的解磷能力

Bacillus sp.DGP01菌株对不同难溶性磷酸盐均具有较强的解磷作用(如表1)，尤其是对磷矿粉和磷酸三钙的解磷效果较强，相对于对照组，分别提高了20多倍，对难溶性磷酸铝和磷酸铁的解磷作用和对照组相比分别提高7倍多和19倍多。

表1Bacillus sp.DGP01菌株对不同难溶性磷酸盐的解磷作用

3.2Bacillus sp.DGP01菌株的砂培试验结果

将Bacillus sp.DGP01菌株通过砂培试验，具体实验结果如表2所示：

表2Bacillus sp.DGP01菌株的砂培试验结果

由表2的砂培实验结果表明，本发明提供的Bacillus sp.DGP01菌株对难溶性磷矿粉、磷酸三钙、磷酸铝和磷酸铁均具有较好的解磷作用，可以高效的将难溶性磷盐转化为植物易吸收利用的可溶性磷。

实施例4Bacillus sp.DGP01菌株解磷的稳定性试验

本发明采用连续传代的方法考察Bacillus sp.DGP01菌株对难溶性磷盐，如磷矿粉、磷酸三钙、磷酸铝和磷酸铁的解磷功能的稳定性，具体实验结果如表3所示，结果表明在连续传代30次后Bacillus sp.DGP01菌株对磷矿粉、磷酸三钙、磷酸铝及磷酸铁的解磷作用仍然较强，各代的可溶性磷含量波动范围均在10％以内，实验结果表明本发明提供的Bacillus sp.DGP01解磷菌具有很好的解磷稳定性能。

表3Bacillus sp.DGP01菌株解磷的稳定性试验结果

通过以上实验结果表明，本发明从当归植株的根际中筛选得到的具有很好解磷作用的Bacillus sp.DGP01菌株，该菌可高效的将土壤中难溶性磷盐，如磷矿粉、磷酸三钙、磷酸铝和磷酸铁降解成可供植物直接吸收利用的优质磷素化合物，从而可提高土壤中难溶性磷的生物有效性和磷肥利用效率，节肥增产，而且可改善土壤结构，提高土壤有机质含量，改良盐碱地以及对培育和充分发挥土壤生态肥力、保持农业生态环境的平衡等均具有极其重要意义和应用价值，因此本发明提供的当归根际解磷菌Bacillus sp.DGP01可开发成为新一代绿色环保的解磷微生物肥料。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种当归根际高效解磷菌的菌剂，其特征在于，它是通过以下方法制备得到的：取当归根际解磷菌-芽孢杆菌(Bacillus sp.)DGP01菌株接种于种子培养基摇瓶中，振荡培养至对数生长期；然后将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入装有发酵培养基的500升种子罐，投料量为350～400升，培养至对数生长期；然后将上述发酵液按10％的接种量接入装有发酵培养基的5吨生产罐培养，投料量为4.0～4.5吨，发酵所得培养液用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附后用包装袋分装成的固体菌剂型；

所述的种子培养基、种子罐与生产罐所用的发酵培养基均由下列重量的原料制成：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，KCl0.3g，MgSO₄·7H₂O0.3g，NaCl0.3g，FeSO₄·7H₂O0.03g，MnSO₄·4H₂O0.03g，KH₂PO₄1.0g，蒸馏水1000mL，且种子培养基、种子罐与生产罐所用的发酵培养基的pH值为7.0～7.5；

以上所述的在种子罐和生产罐的发酵培养过程中无菌空气的通气量为1：0.6～1.0，搅拌速度为180～200转/分，培养温度30～32℃，培养时间为48～60小时；

以上所述的解磷菌为芽孢杆菌DGP01，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.4755，保藏日期：2011年4月7日。

2.权利要求1所述的当归根际高效解磷菌的菌剂在制备降解土壤难溶无机磷的解磷菌剂中的应用。