CN107099486A - 解淀粉芽孢杆菌gn03及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GN03菌株及其应用，解淀粉芽孢杆菌GN03由蔬菜产量和质量都较高的紫色土中分离，菌落白色半透明状，光滑湿润，圆形微***，边缘整齐，革兰氏染色菌体为阳性，孢子呈椭圆，孢子囊未见膨胀，生长位置为中生，荚膜肥厚。培养1‑2d，菌落直径2‑3mm，培养3‑5d，菌落直径6‑8mm。在阿须贝无氮培养基上，菌体浓度为1.5×10⁶cfu/ml时，28℃、120r/min培养7天，其发酵液固氮量高达91.5±2.69mg/L，表现出较高的自生固氮能力。

Description

解淀粉芽孢杆菌GN03及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GN03及其应用。

背景技术

1904年，德国微生物学家最早提出了植物根际(rhizosphere)这个概念，指植物根周围数毫米的区域范围。植物根际是植物根系与土壤界面的一个微环境，是土壤、根系和微生物三者紧密结合的相互作用位点。根际微生物种群主要是以细菌为主，根据其对植物的作用不同，根际细菌(rhizobacteria)大体上可以分为有益细菌(2％-5％)，有害细菌(8％-15％)和中性细菌(80％-90％)三大类。植物根际促生菌(plant growth-promotingrhizobacteria，PGPR)是指能自由生活于土壤中或定植于植物根际的一类可促进植物生长或抑制病原菌活动的菌群，通常指具有固氮、溶磷、解钾、分泌抗生素和产生植物激素等能力或者具有其中之一能力的有益细菌。

自然界大气中有大约80％氮气不能被高等植物直接吸收利用。固氮微生物是指某些微生物在其生命活动过程中可以直接将大气中的氮素通过固氮酶的作用转换成植物可以直接吸收利用的NH₄₊，保证植物拥有足够的氮素养分。一般把它们分为自生固氮菌、共生固氮菌和联合固氮菌。已有研究表明，施用适宜的固氮菌，可增加植物的生物固氮量，提高植物蛋白质含量和植物产量，并且减少氮素化肥的使用量，对农业生产和生态环境保护具重要作用。

微生物肥料(microbial fertilizers)是指以微生物的生命活动为核心，导致农作物获得特定的肥料效应的一类肥料制品。衡量微生物肥料的质量标准的核心是无害和有效原则。

由于我国在微生物肥料方面的研究投入少，使我国的生物肥料产业依然处于整体水平不高、技术创新不足、产品质量和应用效果不稳定的缺点，这些都制约着我国微生物肥料的进一步推广和普及。结合世界农业可持续发展的前提，我国微生物肥料的发展趋势主要包括以下四大方面：1)选育优良菌种；2)不同功能菌株的组合；3)研发多功能微生物肥料；4)重点产品的研究和应用。

土壤微生物群落的多样性决定了土壤微生态***功能的多样性。接种外源微生物肥料的有效性长期以来一直是学术界的热点争议问题，这主要归因于外源促生菌自身无法与土著优势微生物种群进行竞争而导致的定殖能力低下、遗传性状不稳定等。酸性紫色土是中国典型的土壤类型，广泛覆盖于中国四川盆地。在紫色土中单一接种PGPR对植物的促生效应等已有一定研究，如固氮菌、硅酸盐细菌等。但是，大多数相关研究都是基于对土壤或基质进行灭菌后，再开展接种PGPR对于植物的促生等效应的研究，所引种的外源性菌剂在大田试验条件下，均因生态适应性差等问题，无法与土著微生物竞争而“湮灭”，无法实现对作物的促生效应。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是属于芽孢杆菌属的一种革兰氏阳性好氧菌。已有研究多集中在将解淀粉芽孢杆菌作为生防菌剂应用于预防植物病害方面。基于此，亟需筛选出一种对酸性土壤(如紫色土、红壤等)具竞争优势的土著自生固氮能力的植物促生菌株，以期应用于微生物肥料生产。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)GN03，具有高效的自我固氮能力；本发明的目的之二在于提供解淀粉芽孢杆菌GN03在植物根际促生中的应用，目的之三在于提供解淀粉芽孢杆菌GN03作为微生物菌剂肥料中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GN03，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.13474。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌GN03在植物根际促生中的应用。

进一步，所述解淀粉芽孢杆菌GN03作为植物根际有益菌用。

进一步，所述解淀粉芽孢杆菌GN03在制备自生固氮微生物菌剂中的应用。

进一步，所述的解淀粉芽孢杆菌GN03在促进植物株高、茎粗、总根长、叶面积的生长的应用。

进一步，所述解淀粉芽孢杆菌GN03添加浓度为10⁴cfu/ml～10¹⁰cfu/ml。

3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌GN03在微生物菌剂肥料中的应用。

进一步，解淀粉芽孢杆菌GN03在酸性土壤中作为微生物菌剂肥料中的应用。

进一步，所述微生物菌剂肥料为固氮菌剂肥料。

本发明的有益效果在于：本发明所分离得到的自生固氮菌GN03为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GN03，其不仅生长速度快，培养1-2d，菌落直径2-3mm，培养3-5d，菌落直径能达6-8mm；还具有较强的自生固氮能力，在阿须贝无氮培养基上，菌体浓度为1.5×10⁶cfu/ml时，28℃、120r/min培养3天，其发酵液固氮量高达91.5±2.69mg/L；将其应用到植物根际中，可在植物根际中快速大量生长繁殖成为作物根际的优势菌，能自我固定空气中的氮素为NH₃或NH₄ ⁺并与病原微生物争夺营养物质，在空间上限制其它病原微生物的繁殖机会，对作物根际起到良好的促生作用。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为GN03菌株的芽孢染色；

图2为GN03菌株革兰氏染色；

图3为GN03菌株的16S rDNA***发育树。

生物材料保藏

本发明中解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens GN03，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏日期为2016年12月20日，保藏编号为CGMCC No.13474，分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1GN03菌株的分离鉴定

(1)供试土壤

采集重庆市北碚区紫色土，取样地点为种植蔬菜十年以上，且蔬菜产量和质量都较高的种植区。将土样混合均匀后，置于冰桶内，带回于4℃冰箱保存备用，供试土壤基本理化性质见表1。

表1供试土壤基本理化性质

(2)培养基

固氮菌选择培养基(也称为：阿须贝无氮培养基)：0.2g CaSO₃；0.2g KH₂PO₄；0.2gNaCl；5.0g CaCO₃；0.2g MgSO₄·7H₂O；葡萄糖5.0g；琼脂15g；去离子水1000ml；pH自然。

LB培养基：10g NaCl；酵母粉5g；胰蛋白胨10g；琼脂15g；去离子水1000mL；pH自然。

(3)GN03菌株的分离、纯化

称取10g紫色土溶于90mL无菌水中，28℃、120r/min振荡2h，选择稀释梯度为10^-4、10^-5、10^-6和10^-7，分别取100ul涂于固氮菌选择培养基上，28℃培养3-5d。挑取生长速度快或周围有透明圈的菌株，使用划线法于选择培养基分离纯化，直至纯培养后转接至LB斜面培养，-80℃保存菌种。

将以上挑选的菌株命名GN03，并于2016年12月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.13474，分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。

实施例2GN03菌株固氮能力的测定

配制阿须贝无氮液体培养基，取100mL培养基分装于250mL三角瓶中，高压灭菌后，接种分离纯化后的GN03菌株，并设置不接种的空白对照，28℃、120r/min培养7d，稀释发酵液菌体浓度至1×10⁸cfu/mL，备用；

再配制阿须贝无氮液体培养基，取100mL培养基分装于250mL三角瓶中，121℃，30min灭菌后，试验组接种1×10⁸cfu/mL GN03菌株发酵液2mL，对照组加2mL未接菌的阿须贝无氮液体培养基，平行实验重复三次，28℃、120r/min培养7d。用稀释平皿菌落计数法(固氮菌选择培养基，28℃培养7天)测定发酵终止的菌数；用pH计测定发酵终止的pH；取发酵液5000r/min离心10min，收集10mL上清液，采用凯氏定氮法测培养液中的含氮量，测试结果如表2所示，经测定，液体培养7d后其固氮量达91.5±2.69mg/L，表现出较高的自生固氮能力，将其应用于植物根际，可保证植物拥有足够的氮素养分以促进植物生长，并进一步抑制植物根际其他病原菌活动的菌群。

表2固氮菌GN03菌株固氮能力的测定

注：同一列中不同字母表示不同处理间差异达到P≤0.05显著水平。

实施例3GN03菌株的鉴定

1)形态学鉴定

将保藏的菌株GN03分别经选择培养基活化后，观察其菌落形态特征；然后再挑取菌株进行革兰氏染色、荚膜染色和芽孢染色后于显微镜下观察菌体形态。

GN03菌株的芽孢染色如图1所示，GN03菌株在阿须贝无氮培养基上的菌落形态为白色半透明状，光滑湿润，圆形微***，边缘整齐。GN03菌株革兰氏染色结果如图2所示，革兰氏染色菌体为阳性，孢子呈椭圆，孢子囊未见膨胀，生长位置为中生，荚膜肥厚。培养1-2d，菌落直径2-3mm，培养3-5d，菌落直径6-8mm。

2)生理生化鉴定

接触酶试验：挑取一小环培养24h的GN03菌株斜面，涂抹于已滴有5％过氧化氢的载玻片上，如有气泡产生则为接触酶阳性反应，无气泡产生则接触酶为阴性反应。

氧化酶试验：配制二甲基对苯二胺水溶液(1.0％)，滴在滤纸上使滤纸刚好湿润。取培养24h的GN03菌株斜面，用玻璃棒刮取少许菌苔涂在湿润的滤纸上。在10s内菌苔或其边缘呈现红色者为氧化酶阳性反应，在30s内出现红色者为迟缓阳性；不呈现红色或30s以后才呈现红色则属氧化酶阴性反应。

甲基红(M-R)试验：甲基红试剂(即称取甲基红0.02g溶于60mL 95％的酒精中，再加40mL水混匀)，接种GN03菌株于装有灭菌后的葡萄糖蛋白胨培养液的试管中，37℃培养24h后，沿管壁加入甲基红试剂3-4滴混匀，放置，观察是否变色，若培养液由橘黄色变为红色则为M-R阳性反应。

乙酰甲基甲醇(V-P)试验：V-P试剂为40％KOH溶液15滴，再加入等量α-萘酚溶液(α-萘酚5.0g溶于100mL无水酒精中)，混合均匀，再加入肌酸l mg，接种GN03菌株于装有灭菌后的葡萄糖蛋白胨培养液的试管中，37℃培养24h后，沿管壁加入V-P试剂3-4滴混匀，猛烈振荡，10min内变为红色即V-P阳性反应。

淀粉水解试验：在牛肉膏蛋白栋培养基平板中加入0.2％的可溶性淀粉，用接种环取少量的GN03菌株点接在配置好的培养基表面，28℃培养24h后，滴加少量的碘液均匀铺满于平板中。菌落周围如出现无色透明圈，则表示该菌具有分解淀粉的能力，则为淀粉水解阳性反应，无透明圈则为淀粉水解阴性反应。

硝酸还原酶试验：接种GN03菌株于硝酸盐还原培养液中，37℃培养48h，分成两管，其中一管加入格利斯亚硝酸试剂A(磺胺酸0.5g溶于30％150mL醋酸溶液中)、格利斯亚硝酸试剂B(α-萘酚0.5g加入50mL蒸馏水中，煮沸后加入150mL醋酸溶液)各1滴，如出现红色，则为阳性反应。不出现红色，则在另一管中加入少量锌粉，加热，再加入格利斯亚硝酸试剂A、B各1滴，如出现红色，则为硝酸还原酶阴性反应；如不出现红色，则为硝酸还原酶阳性反应。

糖类发酵试验：将培养24h的GN03菌株穿刺接种于培养基(1.0g(NH4)H2PO4，0.2gMgSO4，0.2g KCl，酵母膏0.2g，琼脂5g，葡萄糖或木糖10g，蒸馏水1000mL，0.04％溴甲酚紫酒精溶液20mL。)中，适温培养3d后观察颜色变化，若指示剂变黄，表示糖醇发酵产酸，为阳性；不变或变蓝(紫)则为阴性。琼脂柱中若有气泡出现，则表示为产气反应。

明胶液化试验：用穿刺接种法接种GN03菌株于明胶液化培养基(蛋白胨5g；明胶150g；水1000mL；pH 7.2-7.4)中，20℃培养48h后，观察培养基有无液化情况，若液化，则为明胶液化阳性反应。

吲哚试验：将GN03菌株接种于装有蛋白栋水培养基(1％胰蛋白栋水溶液，pH 7.5)的试管中，37℃培养24h后，在培养液中加入***约l mL，充分振荡后静置片刻，再沿管壁加入吲哚试剂(对位二甲基苯甲醛3.0g，戊醇75.0mL，浓盐酸25.0mL)。如有吲哚存在，***层呈现玫瑰红色，则为吲哚阳性反应。

柠檬酸盐利用试验：接种GN03菌株于柠檬酸盐斜面培养基(柠檬酸钠2.0g；1.0gNH3H2PO4；1.0g K2HPO4；5.0g NaCl；0.2g MgSO4；琼脂1.5g；0.04％苯酚红10mL；水1000mL)上，37℃培养36h，若斜面呈蓝色则为柠檬酸盐利用阳性反应，不变色为柠檬酸盐利用阴性反应。

苯丙氨酸脱氨酶试验：接种GN03菌株于苯丙氨酸斜面培养基(5.0g NaCl；1.0gNa2PO4；酵母膏3.0g；L-苯丙氨酸1.0g；琼脂15g；水1000ml)上，36℃培养24h，滴加10％FeCl3试剂3-5滴，自斜面上方流下，若出现绿色则为苯丙氨酸脱氨酶阳性反应。

以上GN03菌株生理生化鉴定结果如表3所示。

表3GN03菌株生理生化鉴定结果

注：“+”表示反应为阳性，“－”表示反应为阴性。

由表3可知，GN03菌株的生理生化特征为接触酶、M-R试验、V-P试验及硝酸还原酶等试验呈现阳性；氧化酶、吲哚试验、柠檬酸盐利用及苯丙氨酸脱氨酶试验呈现阴性；能水解淀粉、液化明胶。

3)16S rDNA分子生物学鉴定

GNO3菌株活化后，分别接种于LB液体培养基(28℃、120r/min)振荡培养24h，再采用TAKARA MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0提取细菌全基因组DNA，以此为模板进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)。

用细菌通用引物27F和1492R扩增16S核糖体序列，引物27F：5′—AGAGTTTGATCATGGCTCAG—3′，1492R：5′—TACGGTTACCTTGTTACGACTF—3′；PCR反应体系(50μl)为：Premix Taq(Takara Taq TM Version 2.0plus dye)25μl，引物27F和1492R各2μl，模板DNA1.0μl，去离子水20μl。扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸2min，循环30次，然后72℃延伸10min，得到扩增后的DNA样品。将PCR扩增产物送交上海英潍捷基贸易有限公司纯化、16S rDNA测序，测序结果如SEQ ID NO：1所示。所得测序结果通过NCBI的GenBank数据库进行Blast比对，最后使用MEGA6.06软件的Neighbor-Joining法构建基于16S rDNA序列的***发育树。

基于16S rDNA***发育树分析结果如图3所示，图3表明GN03菌株与登录号为KJ767360的解淀粉芽孢杆菌处于同一最小分枝，相似度达到88％以上。结合形态学、生理生化和16S rDNA测序结果，将GN03固氮菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，该菌株命名为Bacillus amyloliquefaciens GN03，简称GN03。

实施例4GN03菌株对烟草幼苗生长的促进作用

将培养皿灭菌后，铺上滤纸，用蒸馏水润湿，将K326烟草种子均匀的铺在滤纸上，25±1℃催芽3-4d(期间保持培养皿滤纸湿润)。将催芽后的烟草种子转移到装有基质(60％腐植土+40％珍珠岩)的育苗穴盘中，每穴放2粒经催芽的烟草种子，其上用基质覆盖，出苗后每穴保留一株烟苗。

待烟草长到3-4叶1心时开始接种GN03菌液(菌液按实施例2方法制备)。设置3个处理：对照、菌液浓度10⁴cfu/mL和10⁸cfu/mL两个试验组。四次重复，每穴接种1ml菌液(对照接种1mL培养基)，每隔7d接菌1次，共接菌4次，待最后一次接菌后30d和60d，测定烟草株高，地径，叶面积，叶片数，根长。结果见表4。

表4接种GN03菌30d和60d时烟草烟草幼苗生长情况

注：同一列中“*”表示不同处理间具有显著性差异：“*”表示达到P≤0.05显著水平、“**”表示达到P≤0.01极显著水平。

由表4可知，接种GN03菌株10⁸cfu/mL后烟草幼苗株高、根长和叶面积与对照相比显著增长，差异达到极显著；而10⁴cfu/mL则差异不是很明显。因此，GN03菌株能明显促进烟草植株生长。

实施例5GN03菌株减量施用氮肥对小白菜生长的效果

供试菌种为B.amyloliquefaciens GN03，供试植物为超纯四季小白菜(栽培种),供试土壤为紫色土(土壤基本理化性质见表5)，经灭菌(121℃，120min)风干后，花盆土量为1.5公斤。

表5供试土壤基本理化性质

试验方法(表6)：共计4个处理，每个处理重复4次。肥料用量为N：0.2g/kg、P₂O₅(P)：0.15g/kg、K₂O(K)：0.2g/kg；施肥方法：底肥一次性施入，肥源依次为尿素、过磷酸钙和氯化钾。

表6PGPR对小白菜的促生效应实验设计

施肥10天后，取若干小白菜种子，用10％H₂O₂浸泡10min，无菌水冲洗3-5次，风干后，按每盆10-15粒播种。出苗后分次间苗,三叶期预定苗(5株/盆)，5天后依生长势一致间苗，每盆定苗3株。定苗后灌根接种：对照组为30ml/pot LB培养基；试验组分别灌根等体积的GN03菌悬液(活菌数为10⁸cfu/ml)，随机放置。

接种30天后，采样测定生物量包括：株高、茎粗、总根长、最大叶片叶面积等。结果见表7。

表7接种GN03对小白菜生长状况的影响

注：同一列中不同字母表示不同处理间差异达到P≤0.05显著水平。

由表7可知，GN03处理促进小白菜的生长显著优于CK1和CK2处理，并且，与全量施用氮磷钾肥处理相比，GN03处理还显著提高了的小白菜茎粗和总根长，分别提高达到15.54％和166.73％。该结果表明，接种固氮菌GN03能促进小白菜的生长，达到施用N肥的效果，应用到实际生产中能减少氮肥的使用。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

<110> 重庆师范大学

<120> 解淀粉芽孢杆菌GN03及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1419

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens

<223> 16S rDNA序列

<400> 1

tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60

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Claims (8)

1.解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GN03，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.13474。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌GN03在植物根际促生中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌GN03作为植物根际有益菌用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌GN03在制备自生固氮微生物菌剂中的应用。

5.如权利要求2-4任一项所述的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌GN03添加浓度为10⁴cfu/ml～10¹⁰cfu/ml。

6.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌GN03在微生物菌剂肥料中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，解淀粉芽孢杆菌GN03在酸性土壤中作为微生物菌剂肥料中的应用。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述微生物菌剂肥料为固氮菌剂肥料。