CN113265403A - 大豆Dt1基因编辑位点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大豆Dt1基因编辑位点及其应用。本发明的大豆Dt1基因编辑位点为一段23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，序列为：5’‑TGTATGAGAGAAAGAGACGAGGG‑3’；在大豆基因组的准确定位是19号染色体Dt1基因启动子上游的2029‑2051处，染色体的坐标为45178492‑45178514。该编辑位点是对该基因启动子进行编辑的有效靶标，在核酸内切酶Cas9的介导下进行双链断裂，从而获得Dt1不同的等位基因突变体。本发明为调节Dt1的表达量以改变大豆的结荚习性和产量提供了新策略，也为培育大豆新品种和提高大豆产量提供了可靠的手段和素材，对于作物研究和生产具有十分重要的作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大豆Dt1基因编辑位点及其应用。
背景技术
CRISPR/Cas9基因编辑技术已被大范围应用于植物基因功能研究和农作物性状改良等领域。刘耀光教授及其团队研发了高效简便的CRISPR/Cas9植物多基因编辑载体***(Ma et al.,2016)，在该***中，可以通过设计不同目标序列的多个导向RNA(sgRNA)，将Cas9蛋白靶向到多个基因组位点上，同时进行多基因编辑，也可以在目的基因的启动子或UTR区域设计靶点，对目的基因的启动子或UTR进行编辑，调节目的基因的表达量。例如，Hendelman等通过对SlWOX9基因的启动子进行编辑产生不同的等位基因，发现SlWOX9在营养和生殖发育中的多效性作用，这对利用基因组编辑在农业中的应用具有重要意义(Hendelman et al.,2021)。
大豆结荚习性是联系大豆开花期与产量性状的桥梁(孔凡江等,2016)。根据花期长短、茎生长状态、茎粗细、节间数、叶大小及茎顶端结荚情况等综合性状，大豆品种被划分为3种类型：有限结荚习性、亚有限结荚习性和无限结荚习性(Bernard,1972)。Liu等利用图位克隆的方法首次克隆了控制无限结荚习性基因位点Dt1，Dt1由GmTFL1b基因编码，将包含GmTFL1b基因全长和启动子基因组片段转化至有限型大豆中，能显著增加大豆节数和延迟顶端花序出现的时间(Liu et al.,2010)。Ping等则克隆了控制亚有限结荚习性的Dt2，是一个含有MADS结构域的基因，与AP1同属于APETALA1/SQUAMOSA(AP1/SQUA)亚家族(Ping etal.,2014)。Dt1对Dt2具有上位性效应，dt1/dt1为有限结荚习性，Dt1/Dt1；Dt2/Dt2为亚有限结荚习性(Dt1和Dt2都是纯合显性的才是亚有限)，Dt1/Dt1；dt2/dt2为无限结荚习性(Dt1是纯合显性，dt2是纯合隐性的才是亚有限)(Ping et al.,2014)。从Dt2控制的大豆表型推测Dt2可能不是与拟南芥中的AP1基因功能相似，在FMs中抑制TFL1的表达，Dt2可能是在大豆顶端分生组织(SAMs)中抑制Dt1的表达，使大豆的SAMs转化为生殖花序(Ping etal.,2014)。
最近，Chen等通过CRISPR/Cas9技术同时敲除了大豆AP1基因的四个同源基因(AP1a、AP1b、AP1c和AP1d)，获得了纯合的ap1a ap1b ap1c ap1d四突变体。表型分析结果证明，ap1突变后主茎节数增加。进一步研究表明AP1基因是通过抑制Dt1的表达来控制主茎节数的发育与形成(Chen et al.,2020)。此外，Yue等研究发现大豆中存在Dt1/FT5a/FDc1-AP1-Dt1负反馈竞争抑制环，来控制大豆主茎节数的发育(Yue et al.,2021)。这些新发现让我们更深入的认知Dt1在调控大豆结荚习性中的作用，进而对提高大豆适应性和产量奠定了理论基础；同时为利用Dt1基因的自然变异进行分子设计育种改良大豆单株产量性状提供了可能。然而，目前为止，还没研究报道通过CRISPR/Cas9技术对Dt1的启动子进行编辑以改变Dt1的的表达量，进而改变大豆的结荚习性和产量性状。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种大豆Dt1基因编辑位点。
本发明的另一目的在于提供上述大豆Dt1基因编辑位点的应用。
本发明的再一目的在于提供一种培育Dt1突变体结荚习性和产量改良大豆品种的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种大豆Dt1基因编辑位点，为一段23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，序列为：5’-TGTATGAGAGAAAGAGACGAGGG-3’(SEQ ID NO.1)；该位点在大豆基因组的准确定位是19号染色体Dt1基因启动子上游的2029-2051处，染色体的坐标为45178492-45178514(图1)。
所述的编辑位点针对Dt1基因的启动子进行编辑，以改变Dt1的的表达量，进而改变大豆的结荚习性和产量性状。
所述大豆Dt1基因编辑位点3’端含有GGG，通过sgRNA与基因组PAM位点附近的DNA碱基互补配对，介导Cas9核酸内切酶靶向识别基因组并实现基因组DNA的双链断裂，从而诱发DNA损伤修复机制，在修复过程中随机引入或删除核苷酸对，导致目标靶点核苷酸对的删除或***，造成目标靶点附近的突变。
含有上述大豆Dt1基因编辑位点的重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌。
所述重组表达载体采用的表达载体为pYLCRISPR/Cas9。
所述重组菌采用的菌为发根农杆菌。
所述重组表达载体是sgRNA载体与权利要求1所述大豆Dt1基因编辑位点采用BsaⅠ酶切后连接，所得sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体经过Bsa I酶切后连接得到。
所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d。
上述大豆Dt1基因编辑位点在改变大豆的结荚习性和产量中的应用。
一种培育Dt1突变体结荚习性和产量改良大豆品种的方法，具体包括以下步骤：
(1)按照如SEQ ID NO.1所示大豆Dt1基因编辑位点的序列合成sgRNA；
(2)在sgRNA的5’端添加碱基GTCA，获得如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，将其反向互补得到sgRNA的反向序列，在其5’端添加碱基AAAC，获得如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；将SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3退火，形成双链DNA；
(3)构建sgRNA表达盒：将步骤(2)形成的双链DNA连接至sgRNA载体前；
(4)将表达载体与步骤(3)中所述sgRNA表达盒连接，得到Cas9 sgRNA重组表达载体；
(5)将步骤(4)中所述Cas9 sgRNA重组表达载体转化至发根农杆菌，并侵染大豆子叶；
(6)除草剂筛选，得到转基因植株。
步骤(3)中所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d；
步骤(4)中所述表达载体为pYLCRISPR/Cas9；
步骤(3)中所述双链DNA、sgRNA载体，步骤(4)中所述表达载体、sgRNA表达盒均采用BsaⅠ酶切；
步骤(5)所述发根农杆菌优选为K599。
步骤(6)所述筛选转基因系采用的除草剂优选为Basta。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的Dt1基因的编辑位点是对该基因启动子进行编辑的有效靶标，可对Dt1基因的启动子进行编辑，在核酸内切酶Cas9的介导下进行双链断裂，从而获得Dt1不同的等位基因突变体。本发明为调节Dt1的表达量以改变大豆的结荚习性和产量提供了新策略，也为培育大豆新品种和提高大豆产量提供了可靠的手段和素材，对于作物研究和生产具有十分重要的作用。
附图说明
图1为编辑位点(基因上游2029-2051)在大豆基因组上的位置示意图。
图2为***有编辑位点T1的Cas9 sgRNA表达载体示意图，Cas9 sgRNA表达载体以pYLCRISPR/Cas9载体为骨架，带有除草剂基因(Bar)，Cas9基因，AtU3d启动子，靶点T1和sgRNA的一个表达载体。
图3为敲除载体构建过程中的电泳图；其中，A为sgRNA表达盒扩增的第一轮PCR产物，B为sgRNA表达盒扩增的第二轮PCR产物，C为大肠杆菌DH10b的菌落PCR产物电泳图；M为2kb DNA ladder。
图4为转基因毛状根检测靶点的编辑效果图；其中，A为农杆菌K599菌落PCR产物的电泳图，B为农杆菌感染大豆子叶，培养15天后长出的毛状根，C为毛状根DNA扩增Cas9产物的电泳图，D为靶点检测引物扩增转基因毛状根的产物，E为靶点的编辑结果；M为2kbladder DNA marker。
图5为不同的等位基因突变体及其测序结果；其中，A和C为单碱基***的植株及其测序结果，B和D为缺失28bp、***17bp的植株及其测序结果；图C和D中W82为对照植株威廉姆斯82。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
除非特别指出或是单独定义，本申请中所使用的科学和技术术语具有本发明所属领域技术人员共知的、无歧义的相同含义。
实施例1、***有Dt1基因启动子编辑靶位点T1的Cas9 sgRNA表达载体CLY2的构建
(1)主要试剂和来源
大肠杆菌感受态细胞E.coli DH10b、发根农杆菌菌株K599，均购自全式金公司；sgRNA载体pYLgRNA-AtU3d和pYLCRISPR/Cas9载体(均在“A robust CRISPR/Cas9Systemfor Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and DicotPlants”中公开)由华南农业大学刘耀光教授实验室提供。BsaⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Master Taq mix均购自TaKaRa公司；PCR产物回收试剂盒购自全式金公司；质粒提取试剂盒购自全式金公司；胰蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、卡那霉素(Kan，50μg/mL)、壮观霉素(Spec，100μg/mL)、利福平(Rif，50μg/mL)等其他化学试剂均为国产分析纯试剂，引物合成和测序由天一辉远公司完成。
靶点引物：
T1F:5’-gtcaTGTATGAGAGAAAGAGACGA-3’(SEQ ID NO.2)；
T1R:5’-aaacTCGTCTCTTTCTCTCATACA-3’(SEQ ID NO.3)。
第一轮PCR的引物为：
U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’(SEQ ID NO.4)；
gRNA-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’(SEQ ID NO.5)。
第二轮PCR的引物为：
B1F:5’-TTCAGAGGTCTCTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID NO.6)；
BLR:5’-AGCGTGGGTCTCGaccgACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’(SEQ ID NO.7)。
载体测序引物
SP3F:5’-TGCAATAACTTCGTATAGGCT-3’(SEQ ID NO.8)；
SP1R:5’-GTCGTGCTCCACATGTTGACC-3’(SEQ ID NO.9)。
(2)操作步骤
第一步：靶点引物退火成双链。
将正向引物和反向引物加入0.5×TE中混合成100μmol/L，分别取正、反向引物1μL加入PCR管中，补加98μL无菌水至100μL，PCR程序设置为90℃30s，室温冷却退火，得到双链DNA。
第二步：双链DNA与gRNA表达盒酶切连接。
10μL酶切连接反应体系：2μL 10ng/μL的sgRNA载体，0.5μL 100μmol/L双链DNA，0.5μL BsaⅠ(10U/μL)，0.2μL T4 DNA ligase，1μL 10×NEB T4 DNA ligase buffer，1μL10×NEB Cut Smart Buffer，4.8μL无菌水。PCR程序设置为：5个循环：37℃5min，20℃5min。
第三步：2轮PCR。
第一轮PCR，扩增gRNA表达盒，15μL PCR反应体系：2μL第二步的PCR产物，7.5μLMaster Taq mix，10μmol/L U-F 0.2μL，10μmol/L gRNA-R 0.2μL，ddH2O补足到15μL。PCR程序设置为：95℃2min；10个循环：95℃15s，55℃15s，72℃10s；25个循环：95℃15s，60℃15s，72℃10s。取3μL PCR产物加入到无菌离心管中，补加6μL无菌水、1μL 10×loading buffer，进行1％琼脂糖凝胶电泳，查看凝胶电泳图像是否出现500bp左右的目的条带(图3A)。
第二轮PCR，使用特定位置的通用引物B1F/BLR扩增获得带有特异性接头的包含启动子、靶点和sgRNA的完整表达盒靶。取第一轮PCR产物2μL加入到8μL的无菌水中混合稀释10倍，再取1μL作为第二轮PCR的模板。20μL的反应体系：10μL Master Taq mixQ，前后引物各0.15μL，第一轮PCR产物稀释液1μL，无菌水补足到20μL。PCR反应程序设置为：95℃2min，35个循环：95℃10s，58℃15s，72℃20s。取3μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像仪查看是否有500bp的条带(图3B)。按照凝胶回收试剂盒上的步骤进行胶回收，并用DNA浓度检测仪检测回收DNA片段的浓度。
第四步：sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体连接，得到Cas9 sgRNA表达载体(图2)
15μL反应体系：Cut Smart Buffer 1.5μL，pYLCRISPR/Cas9质粒0.5μL，BsaI 1μL，上一步纯化产物(浓度为60～70ng/μL)4μL，T4 DNA ligase 0.2μL，10×NEB T4 DNAligase buffer 1.5μL，10×NEB Cut Smart Buffer 1.5μL，加无菌水补足到15μL。PCR程序设置为：37℃5min，10℃5min，20℃5min，37℃5min，15cycles。
第五步：连接产物的转化
E.coli DH10b感受态细胞放在冰上解冻5分钟后加入10μL上一步得到的表达载体，轻轻弹动混合均匀。冰浴30min后，放入42℃水浴锅中热激1min后立刻冰浴2min。在超净工作台中加500μL不含抗生素的LB培养液，37℃220rpm振荡培育1小时，5000rpm离心1min，倒掉部分上清液，重悬菌液吸出，均匀涂布于含有壮观霉素的LB固体培养基上，放入37℃培养箱过夜。挑取细菌单克隆，使用引物SP3F、SP1R进行PCR检测(图3C)，阳性克隆送天一辉远测序。
实施例2、大豆转基因毛根靶点编辑效果检测
(1)主要试剂和来源
本实验提取毛根DNA来自栽培大豆W82(Glycine max Wm82.a2.v1)。发根农杆菌感受态细胞K599购自全式金公司；质粒提取试剂盒购自全式金公司；全能型植物基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪公司；萌发培养基：霍格兰营养液(Coolaber)，0.8％琼脂，2％蔗糖，pH＝5.8；毛根诱导培养基：霍格兰营养液(Coolaber)，2％蔗糖，0.8％琼脂，0.6g MES，500mg/L羧卞青霉素，5mg/L除草剂Basta，pH＝5.8。胰蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、卡那霉素(Kan，50μg/mL)、壮观霉素(Spec，100μg/mL)、利福平(Rif，50μg/mL)等其他化学试剂均为国产分析纯试剂，引物合成和测序由天一辉远公司完成。
Cas9的引物为：
Cas9-F：5’-CAACACCGACCGCCACTC-3’(SEQ ID NO.10)；
Cas9-R：5’-TGCCGCTCTGCTTATCCC-3’(SEQ ID NO.11)。
靶点检测的引物为：
JCF:5’-GCATACTCGGCAATTTAATGAGG-3’(SEQ ID NO.12)；
JCR:5’-TGCCTTGCGTAGAGAACCTT-3’(SEQ ID NO.13)。
(2)操作步骤
第一步：K599农杆菌转化。
实施例1测序正确的阳性克隆进行质粒提取。取50μL农杆菌感受态细胞K599中加入0.1μg阳性质粒，轻轻混匀，冰浴30min，在液氮中冷冻1min，37℃水浴热激5min，冰上冷却2min。将菌液接种于500μL YEP培养基，28℃220rpm摇床培养2h,离心1min，悬浮细胞均匀涂布在加有卡那霉素，壮观霉素，利福平抗生素的YEP培养基上，28℃倒置培养36h。用引物SP3F、SP1R进行菌落PCR，10μL反应体系：5μL Master Taq mix，引物各0.2μL，3.6μL无菌水，1μL菌液。PCR程序设置为：95℃2min；35个循环：95℃30s，58℃30s，72℃90s；72℃2min。进行1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像***查看是否出现2000bp左右的目的条带(图4A)。
第二步：侵染大豆子叶。
选取颗粒饱满均匀、种皮无裂痕的大豆Willam82种子，用10％H2O2对种子表面进行消毒1min，然后用无菌去离子水冲洗干净。将消毒的种子播种在萌发培养基中，在大豆人工气候室中培养5天，直到子叶竖起，与下胚约成直角状态。将第一步得到的含有目的质粒的发根农杆菌K599放于培养箱，28℃培养至OD＝0.6左右。用解剖刀蘸取菌液在大豆子叶的正面划网格状，将处理好的子叶摆放到根诱导培养基上，25℃光照培养15天左右，毛状根长出(图4B)。
第三步：靶点编辑效果检测。
根据DNA提取试剂盒上的步骤，每3个第二步得到的转基因毛状根混合成一个样进行DNA提取。以提取的毛状根DNA为模板，用CAS9引物和靶点检测引物分别扩增靶点所在区域的片段，PCR反应体系：5μL Master Taq mix，正向引物和反向引物各0.2μL，0.5μL DNA模板，ddH2O补足到10μL。PCR程序为：94℃2min；35个循环：95℃30s，59℃30s，72℃1min；最后72℃5min。CAS9PCR有带(图4C)的毛根对应的靶点检测引物扩增的产物(图4D)送到天一辉远公司测序，利用BioEdit软件查看测序数据，由靶位点的测序结果查看靶点的编辑效果(图4E)，测序结果显示，从靶点处往后都是双峰，说明该靶点可以有效编辑该基因的启动子，该靶点的编辑效率为56％。
实施例3、大豆转基因纯合突变体的获得
(1)主要试剂和来源
本实验转化外植体是栽培大豆威廉姆斯82(W82，Glycine max Wm82.a2.v1)。根癌农杆菌菌株EHA101购自全式金公司；质粒提取试剂盒购自全式金公司；全能型植物基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪公司；萌发培养基：霍格兰营养液(Coolaber)，0.8％琼脂，2％蔗糖，pH＝5.8。共培养营养基：霍格兰营养液(Coolaber)，0.5％BBL琼脂，3％蔗糖，1mg/mLBAP，1mg/mL GA3，0.4mg/mL半胱氨酸胺，0.154mg/mL二硫苏糖醇，pH＝5.8。芽诱导培养基：霍格兰营养液，3％蔗糖，0.8％琼脂，0.6g MES，1mg/mL BAP，500mg/L羧卞青霉素，5mg/L除草剂，pH＝5.8。茎伸长培养基：霍格兰营养液，3％蔗糖，0.8％琼脂，0.6g MES，500mg/L羧卞青霉素，5mg/L除草剂，pH＝5.8，1mg/mL IAA，1mg/mL GA3，1mg/mL玉米素Zeatin-R。生根培养基：霍格兰营养液，3％蔗糖，0.8％琼脂，0.6g MES，0.5mg/mL NAA，pH＝5.8。胰蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、卡那霉素(Kan，50μg/mL)、壮观霉素(Spec，100μg/mL)、利福平(Rif，50μg/mL)等其他化学试剂均为国产分析纯试剂，引物合成和测序由天一辉远公司完成。
(2)操作步骤
1)种子萌发：将表面光滑无破损的大豆种子在氯气中进行干燥表面消毒16小时后取出，置于超净工作台内吹30min除去氯气，然后播种于萌发培养基上，28℃光照培养3天。
2)农杆菌菌液准备：从新鲜YEP板上挑取单克隆(实施例2得到的含有目的质粒的发根农杆菌K599)放入2mL添加了卡那霉素、壮观霉素、利福平抗生素的YEP液体培养基中，摇过夜培养，从中取2mL饱和菌液于加有卡那霉素、壮观霉素、利福平抗生素的250mL的YEP液体中，于28℃摇至过夜，离心收集菌落，用CM液体悬浮菌液至OD650为1.0(EHA101)。
3)共培养：将菌液倒入培养皿中，用解剖刀切下发芽的种子，沿子叶下胚轴垂直剖开豆子，除去胚轴上的幼芽，在子叶节区域内垂直于轴切出7-8个切口；将切好的外植体放到有悬浮菌液的培养皿中侵染30分钟，用镊子将外植体转移到共培养营养基上，切口向下，封好后于培养箱中暗培养3天。
4)幼芽诱导：共培养3天后，将外植体置于芽诱导培养基上生长14天后，在子叶节部位齐平切取子叶节下胚轴，将新露出的伤口***新的芽诱导培养基中，继续培养14天。
5)幼芽生长：切去分化外植体上的子叶，并在节的基部切一个新的切口，然后将外植体转移到茎伸长培养基上，在培养室中生长2-8周，每两周换一次新的培养基，每次都在外植体的基部切一个新鲜的水平切口。
6)生根：幼芽生长到3cm长时，把他们从组织上切下，然后将其转移到装有生根培养基的培养瓶中培养，2周之后，待幼苗长出足够多根后，将其转移到基质中于培养箱中培养4周，然后将小苗转移到温室培养至结荚。
7)转基因植株的检测：
除草剂筛选：在转基因植株上选取完全展开的三出复叶中一片，用记号笔在一半作标记，另一半用棉签蘸取稀释好的除草剂Basta涂抹在叶片正面2-3天后观察叶片变化。如果叶片发生失绿、变黄，枯萎或者有色斑点产生则说明该植株不抗除草剂，为阴性的非转基因材料；如果叶片没有发生变化，说明其植株内有除草剂抗性，可能为阳性植株。
转基因植株的鉴定：抗除草剂的T0代植株收获种子之后，进行T1代繁种，T1代苗通过叶片涂抹除草剂，筛选获得两个除草剂抗性有分离的株系，其中重点检测无除草剂抗性的植株编辑情况。收取新叶提取DNA，用SP3F、SP1R引物进行PCR鉴定，检测阴性的植株利用靶点检测引物进行PCR，PCR产物送测序检测靶点编辑情况。检测结果显示，已获得两种等位的无cas9骨架的纯合突变体，一种是在靶点处有单碱基G的***(图5A)，对应的植株见图5C，另一种是靶点处缺失28bp GCATGTATGAGAGAAAGAGACGAGGGTT，***17bpTTATATAGTTATACATA(图5B)，对应的植株见图5D。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广州大学
<120> 大豆Dt1基因编辑位点及其应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Dt1基因编辑位点
<400> 1
tgtatgagag aaagagacga ggg 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T1F
<400> 2
gtcatgtatg agagaaagag acga 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T1R
<400> 3
aaactcgtct ctttctctca taca 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> U-F
<400> 4
ctccgtttta cctgtggaat cg 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> gRNA-R
<400> 5
cggaggaaaa ttccatccac 20
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> B1F
<400> 6
ttcagaggtc tctctcgact agtggaatcg gcagcaaagg 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BLR
<400> 7
agcgtgggtc tcgaccgacg cgtccatcca ctccaagctc 40
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SP3F
<400> 8
tgcaataact tcgtataggc t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SP1R
<400> 9
gtcgtgctcc acatgttgac c 21
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cas9-F
<400> 10
caacaccgac cgccactc 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Cas9-R
<400> 11
tgccgctctg cttatccc 18
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JCF
<400> 12
gcatactcgg caatttaatg agg 23
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JCR
<400> 13
tgccttgcgt agagaacctt 20
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突变体靶点处缺失片段
<400> 14
gcatgtatga gagaaagaga cgagggtt 28
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 突变体靶点处***片段
<400> 15
ttatatagtt atacata 17
Claims (8)
1.一种大豆Dt1基因编辑位点，其特征在于，所述编辑位点为一段23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，序列为：5’-TGTATGAGAGAAAGAGACGAGGG-3’；该位点在大豆基因组的准确定位是19号染色体Dt1基因启动子上游的2029-2051处，染色体的坐标为45178492-45178514。
2.根据权利要求2所述大豆Dt1基因编辑位点，其特征在于，所述大豆Dt1基因编辑位点3’端含有GGG，通过sgRNA与基因组PAM位点附近的DNA碱基互补配对，介导Cas9核酸内切酶靶向识别基因组并实现基因组DNA的双链断裂，诱发DNA损伤修复机制，在修复过程中随机引入或删除核苷酸对，导致目标靶点核苷酸对的删除或***，造成目标靶点附近的突变。
3.含有权利要求1所述大豆Dt1基因编辑位点的重组表达载体、重组基因细胞系或重组菌。
4.根据权利要求3所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体采用的表达载体为pYLCRISPR/Cas9；所述重组菌采用的菌为发根农杆菌。
5.根据权利要求4所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是sgRNA载体与权利要求1所述大豆Dt1基因编辑位点采用BsaⅠ酶切后连接，所得sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体经过BsaI酶切后连接得到；
所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d。
6.权利要求1所述大豆Dt1基因编辑位点在改变大豆的结荚习性和产量中的应用。
7.一种培育Dt1突变体结荚习性和产量改良大豆品种的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)按照如SEQ ID NO.1所示大豆Dt1基因编辑位点的序列合成sgRNA；
(2)在sgRNA的5’端添加碱基GTCA，获得如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，将其反向互补得到sgRNA的反向序列，在其5’端添加碱基AAAC，获得如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；将SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3退火，形成双链DNA；
(3)构建sgRNA表达盒：将步骤(2)形成的双链DNA连接至sgRNA载体前；
(4)将表达载体与步骤(3)中所述sgRNA表达盒连接，得到Cas9 sgRNA重组表达载体；
(5)将步骤(4)中所述Cas9 sgRNA重组表达载体转化至发根农杆菌，并侵染大豆子叶；
(6)除草剂筛选，得到转基因植株。
8.根据权利要求7所述培育方法，其特征在于，
步骤(3)中所述sgRNA载体为pYLgRNA-AtU3d；
步骤(4)中所述表达载体为pYLCRISPR/Cas9；
步骤(3)中所述双链DNA、sgRNA载体，步骤(4)中所述表达载体、sgRNA表达盒均采用BsaⅠ酶切；
步骤(5)中所述发根农杆菌为K599；
步骤(6)中所述筛选转基因系采用的除草剂为Basta。
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